單細胞轉錄組學揭示了 橫紋肌肉瘤中的免疫抑制和與患者預后相關的細胞狀態(tài)

      橫紋肌肉瘤（RMS）是一種起源于間充質(zhì)的軟組織惡性腫瘤，被認為是肌原性分化異常的結果。盡管有密集的治療方案，高?；颊叩念A后仍然令人沮喪。RMS的細胞分化狀態(tài)及其與患者預后的關系在很大程度上仍然不清楚。在這項研究中，作者使用單細胞mRNA測序技術生成了橫紋肌肉瘤的轉錄組圖譜。對橫紋肌肉瘤腫瘤微環(huán)境的分析顯示其存在免疫抑制的跡象。作者還發(fā)現(xiàn)，在更具侵襲性的融合陽性（FP）RMS亞型中，NECTIN3和TIGIT之間可能存在相互作用，這可能是腫瘤引起T細胞功能障礙的潛在原因。在惡性橫紋肌肉瘤細胞中，作者定義了反映正常肌原性分化的轉錄程序，并且證明這些細胞分化狀態(tài)對FP RMS和更不具侵襲性的融合陰性亞型的患者預后有預測性。作者的研究揭示了針對橫紋肌肉瘤免疫微環(huán)境的治療潛力，并建議評估腫瘤分化狀態(tài)可以實現(xiàn)更精細的風險分層。
      該研究于2023年5月發(fā)表發(fā)表在《Nature communications》，IF：17.694。

      技術路線：

      實驗方法：單細胞RNA測序、免疫組織化學和H&E染色、RNA熒光原位雜交、細胞分類、免疫微環(huán)境分析、免疫細胞類型鑒定、GSEA、配體-受體相互作用分析、Logistic回歸分析、基因集富集分析、差異化軌跡建模、轉錄因子活性分析、生存分析。

1、橫紋肌肉瘤（RMS）腫瘤的單細胞圖譜
      作者采用基于板的單細胞mRNA測序（SORT-seq）協(xié)議，對活體冷凍原發(fā)RMS腫瘤標本和最近建立的患者來源的腫瘤器官模型進行了操作（圖1a）。選擇基于板的方法可以從低活性的原始樣本或樣本物質(zhì)有限的情況下生成高質(zhì)量的單細胞轉錄組。從作者的27個RMS樣本（包括19個原發(fā)樣本和8個先前建立的腫瘤器官樣模型），涵蓋主要的分子和組織亞型（FP，F(xiàn)N，肺泡和胚胎，圖1b、c），作者獲得了10216個通過質(zhì)量閾值的高質(zhì)量單細胞轉錄組。
      為了區(qū)分原發(fā)樣本中的RMS細胞和組成腫瘤微環(huán)境的非惡性細胞類型，作者采用了兩種互補的方法。首先，使用SingleR評估了每個單細胞轉錄組與來自健康細胞類型和橫紋肌肉瘤的批量轉錄組的參考集之間的相似性。通過對相似性得分進行聚類，可以明確區(qū)分與批量橫紋肌肉瘤具有高相似性的細胞（惡性細胞）和類似于多種免疫或基質(zhì)細胞類型的細胞。其次，對每個腫瘤基礎上的單細胞拷貝數(shù)變異（CNV）進行推斷和聚類。在所有腫瘤中，可以區(qū)分出具有一致的全染色體和亞染色體CNV的細胞（惡性細胞）和那些看起來是拷貝中性的細胞?？傮w而言，單細胞來源的CNV圖譜與大量腫瘤樣本的全基因組測序結果高度相似。使用兩種方法分類為“惡性”或“正?！钡募毎槐Ａ?，而分類不一致的細胞則被排除在進一步分析之外。每個原發(fā)樣本中的惡性細胞百分比的中位數(shù)為56％，盡管變化很大（2％-97％），但在分子亞型之間沒有顯著差異（圖1f）。如預期的一致，疑似惡性細胞表達DES、MYOD1和MYOG等典型的橫紋肌肉瘤標記基因（圖1e）。然后，使用SingleR細胞類型相似性得分和已知標記基因的表達來確定非惡性細胞的身份（圖1e）。與惡性細胞的整體百分比一樣，每種非惡性細胞類型的比例在腫瘤之間變化很大，但根據(jù)融合狀態(tài)沒有顯著差異（圖1f）。
      將分類的原發(fā)性單細胞轉錄組在均勻流形逼近與投影（UMAP）空間中進行投影顯示，腫瘤間的異質(zhì)性和分子亞型分類（FN或FP）驅動了惡性細胞的聚類，而非惡性細胞則按細胞類型進行聚類（圖1d），這與先前對其他腫瘤實體的描述相符。基于分子亞型和腫瘤間異質(zhì)性進行的聚類也觀察到了腫瘤器官樣細胞中的情況，支持在體外擴增后保留了亞型特異性轉錄組差異的存在。

2、RMS微環(huán)境的特征揭示了一般和亞型特異性的免疫功能障礙 
      了探索腫瘤浸潤性免疫細胞的組成和功能特征，對原始RMS樣本的髓系和T/NK亞群進行了基于圖的聚類（圖2a、e）。對髓系聚類中標記基因的表達進行檢查，發(fā)現(xiàn)存在未分化（M0）和分化（Mq）巨噬細胞，以及傳統(tǒng)型（cDC）和漿細胞型（pDC）樹突狀細胞（圖2b）。對分化巨噬細胞進行M1/M2特異性基因特征進行評分，顯示它們主要處于M2極化狀態(tài)（圖2c），它與幾種促腫瘤功能相關，包括抑制炎癥和促進血管生成。原發(fā)腫瘤組織的免疫熒光(IF)顯微鏡顯示CD206+和CD163+細胞在多個患者樣本中的滲透(圖2d)支持這一發(fā)現(xiàn)。
      在T/NK細胞聚類中，可以區(qū)分出幾個亞型，包括原始和gamma delta（GD）T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）、細胞毒性（CD8 +）T細胞和多個亞型的CD4 + T輔助細胞（IL7R +和ISG +）（圖2f）
      基因集富集分析（GSEA）比較RMS亞型之間的CD8 + T細胞表明，F(xiàn)P樣本中的功能障礙更為普遍，這些樣本富集了與PD-1信號傳導、氧化磷酸化和T細胞衰竭相關的基因集，而來自FN腫瘤的細胞富集了干擾素應答和刺激特征（圖2g）。為了定義調(diào)節(jié)免疫功能的潛在細胞間相互作用，作者使用CellChat模擬TME內(nèi)惡性細胞、每種亞型和細胞類型之間的配體-受體相互作用。
      該分析強調(diào)了FP腫瘤特有的一種可能存在的相互作用，即惡性細胞表達的NECTIN3與Tregs和CD8 + T細胞上的TIGIT受體之間的相互作用。這種相互作用的特異性是由于FP腫瘤細胞中NECTIN3的顯著高表達，而TIGIT在Tregs和CD8+T細胞中的表達在不同亞型之間是相似的。支持這一發(fā)現(xiàn)的是，原發(fā)性腫瘤組織的免疫熒光顯微鏡檢查顯示兩個亞型中都存在TIGIT陽性細胞，并且FP RMS中觀察到一致更普遍的NECTIN3染色模式（圖2h）。綜上所述，對RMS中的腫瘤微環(huán)境的分析突出了普遍的免疫功能障礙，如M2極化的巨噬細胞的普遍存在，以及FP特異性的T細胞衰竭表型，這部分可能受到NECTIN3和TIGIT之間的相互作用的調(diào)節(jié)。

3、RMS中的惡性細胞狀態(tài)反映了正常肌肉發(fā)育過程的特征
      雖然有人提出RMS腫瘤是由于肌肉發(fā)育出現(xiàn)問題而產(chǎn)生的，但RMS確切的發(fā)育起源仍然是一個積極研究的領域。為了將原發(fā)性RMS腫瘤細胞置于正常肌肉發(fā)育的背景下，作者訓練了一系列Logistic回歸模型，來預測惡性單細胞轉錄組與最近發(fā)表的人類胎兒和出生后肌肉發(fā)育單細胞圖譜定義的主要細胞類型的相似性。這項分析顯示，平均而言，F(xiàn)N RMS細胞類似于肌肉前體細胞和肌肉間充質(zhì)細胞，而FP細胞與成肌細胞最接近。這符合FN腫瘤通常呈現(xiàn)出未分化的“胚胎型”組織學特征的概念，而FP則更廣泛地表達了負責協(xié)調(diào)終末分化的關鍵肌肉調(diào)控因子MYOD1和MYOG6（圖1b、c）。然而，當以單細胞分辨率進行分析時，作者發(fā)現(xiàn)每個亞型和腫瘤的單個細胞都覆蓋了肌肉發(fā)育的各個階段，表明在細胞分化狀態(tài)中存在大規(guī)模的腫瘤內(nèi)和腫瘤間異質(zhì)性。

4、FN RMS中的NMF定義的分化軌跡反映了早期肌肉發(fā)育
      為了探索異質(zhì)性的潛在來源，在作者的RMS scRNAseq隊列中，針對每個分子亞型獨立地應用了非負矩陣分解（NMF）來定義惡性細胞中活躍的基礎轉錄程序。在FN RMS樣本中，這種分析揭示了三個高度相關的轉錄程序簇，作者將其合并為三個元程序（圖3a-左側）。值得注意的是，構成每個元程序的基礎程序來自多個腫瘤樣本，這表明聚類不是由腫瘤間的差異驅動的。為了解釋每個元程序的生物學相關性，作者評估了其具有最高權重的基因的表達（圖3a-右側）。第一個程序被稱為“類間質(zhì)樣”程序，富含與細胞外基質(zhì)（ECM）組織相關的基因，包括FN1、TGFBI和幾個編碼膠原蛋白的基因等。第二個程序被稱為“前體樣”程序，包括在早期肌肉發(fā)育中表達的基因，例如FGFR4和GPC3，以及增殖標記物，包括MKI67和TOP2A。正如所暗示的那樣，具有高表達前體樣程序基因的細胞被推測具有高細胞周期活性（圖3a-右側面板）。最后，“肌母細胞樣”程序由參與調(diào)控末端肌肉分化的基因組成，包括MYOD1、MYOG、MEF2C和CDH15，以及編碼終端分化紋狀肌的結構和功能組分的基因，例如TTN和CKM。對FN細胞進行每個元程序的評分顯示，肌母細胞樣和類間質(zhì)樣程序的表達是互斥的，而高度增殖的前體樣狀態(tài)的表達僅限于得分低于類間質(zhì)樣和肌母細胞樣程序的細胞（圖3b）。這些關聯(lián)結果在來自最近發(fā)表的獨立單核RNA-seq隊列的RMS腫瘤數(shù)據(jù)集中得到了驗證。
      然后，使用元程序評分來定義每個細胞的離散“狀態(tài)”。這種分析揭示了細胞狀態(tài)在腫瘤之間的分布存在很大的變異性（圖3c）。有趣的是，某些腫瘤（例如RMS012和RMS000HEI）主要由類間質(zhì)樣細胞組成，而其他腫瘤（例如RMS444和RMS000FWE）幾乎完全包含前體樣細胞。利用RNA熒光原位雜交驗證了每個細胞狀態(tài)的存在以及前體樣和類間質(zhì)樣狀態(tài)在個體腫瘤內(nèi)的分布（圖3d）。
      為了研究FN RMS中細胞狀態(tài)的層次結構，將數(shù)據(jù)建模為擴散圖空間中的分化軌跡，并使用偽時間和RNA速度評估方向性（圖3e）。這一分析表明，細胞從高增殖的祖細胞樣狀態(tài)轉變?yōu)榉只潭雀叩拈g充質(zhì)樣或成肌樣細胞狀態(tài)。當將惡性細胞狀態(tài)評分與正常肌源性細胞類型的相似性評分進行比較時，分化狀態(tài)的差異也很明顯。這表明，祖細胞樣評分與未分化的肌源性祖細胞密切相關，而間充質(zhì)樣評分和成肌樣評分分別與分化程度較高的正常細胞類型，即肌源性間充質(zhì)細胞和成肌細胞/肌細胞密切相關。（圖3f）。然后，作者利用SCENIC pipeline進行研究，以調(diào)查轉錄因子（TF）活性與軌跡特定偽時間的關系。這種分析顯示，隨著細胞向類間質(zhì)樣狀態(tài)進展，幾個已知在上皮-間質(zhì)轉化（EMT）中發(fā)揮作用的轉錄因子的活性增加，包括TWIST1和ZEB1。相反，向肌母細胞樣狀態(tài)進展的細胞表現(xiàn)出調(diào)節(jié)末端肌肉分化的關鍵調(diào)節(jié)因子活性上調(diào)，包括MYOD1、MYOG和MYF6（MRF4）。最后，高度增殖的祖細胞樣細胞(在兩個軌跡中的早期沿著偽時間)顯示細胞周期進程調(diào)節(jié)因子的活性增加，包括幾個E2F轉錄因子以及肌肉前體標記物SOX8。綜上所述，F(xiàn)N RMS細胞中的轉錄細胞狀態(tài)可以按照反映早期成肌分化的分化軌跡組織起來，在這種分化軌跡中，祖細胞樣細胞可以產(chǎn)生類似于終末分化的成肌細胞的細胞，或者向類似于成肌間充質(zhì)細胞的間充質(zhì)狀態(tài)發(fā)展。

5、FP RMS中的分化狀態(tài)反映了骨骼肌再生過程
      通過擴展NMF分析，作者發(fā)現(xiàn)三個特定于FP RMS的元程序，其定義為在腫瘤樣本間相關的轉錄程序（圖4a-左圖）。幾乎所有被推測處于S期或G2/M期的細胞在這個元程序中得分較高（圖4a-右圖）。與在FN RMS腫瘤中發(fā)現(xiàn)的一樣，成肌樣細胞的程序以MYOG、TTN和CKB等終末成肌分化基因的表達為標志。最后，被稱為"衛(wèi)星細胞樣"（SC-like）的程序的特征NOTCH3受體基因、Notch通路靶標，包括HEY1和HES1，以及編碼V型和VI型膠原蛋白的基因的表達。這些基因在肌肉中的衛(wèi)星細胞中具有特定調(diào)控靜止、自我更新和激活的作用。對每個元程序對單個細胞的評分顯示了類似肌母細胞和SC-like程序之間的相互排斥關系，而增殖性程序與兩者都不相關，并且通常限制在對前兩個程序得分較低的細胞中（圖4b）。
      與FN樣本類似，腫瘤之間的離散細胞狀態(tài)比例有很大的差異，特別是在增殖期和SC樣狀態(tài)之間（圖4c）。使用RNA-FISH驗證了每個元程序的表達以及類似肌母細胞和SC-like程序的相互排斥關系（圖4d）。將元程序評分與邏輯回歸定義的細胞相似性評分進行比較顯示，類似肌母細胞的程序與正在進行終末分化的細胞類型（肌母細胞和肌細胞）強相關，而SC-like程序與出生后的衛(wèi)星細胞最為相似（圖4e）。增殖性程序評分與任何正常肌肉細胞類型的相關性不強，支持這個程序僅僅是細胞周期活動的指標。軌跡推斷表明，得分高的類似肌母細胞或SC-like程序的細胞位于分化連續(xù)體的兩個極端，而增殖性細胞則表現(xiàn)為一個未分化的中間狀態(tài)（圖4f）。然而，在這種情況下，RNA速度的結果并沒有明確地暗示軌跡的嚴格方向性（圖4e）。最后，TF活性分析顯示，朝著類似肌母細胞狀態(tài)發(fā)展的細胞具有較高的MYOG和MYOD1活性，而增殖狀態(tài)的細胞則表現(xiàn)出較高的E2F TF活性。值得注意的是，除了NOTCH信號通路效應因子TF HEY1的高活性外，SC-like狀態(tài)還與關鍵的衛(wèi)星細胞調(diào)節(jié)因子PAX7的活性上調(diào)相關，進一步支持FP RMS中SC-like細胞狀態(tài)與正常衛(wèi)星細胞的相似性?？偟膩碚f， FP RMS中共享的細胞狀態(tài)異質(zhì)性形成了一個類似于骨骼肌再生的分化軌跡，其中SC-like細胞通過增殖、未分化的細胞狀態(tài)連接到類似終末分化肌母細胞的細胞狀態(tài)。

6、在RMS腫瘤器官模型中驗證亞型特異性的惡性細胞狀態(tài)
      為了確定上述亞型特異性細胞狀態(tài)是否與腫瘤細胞本身相關，作者試圖將腫瘤微環(huán)境（TME）的影響與惡性細胞分開。作者對使用NMF定義的每個亞型特定的Meta程序的腫瘤類器官細胞進行了評分。在FN腫瘤器官細胞中，3個程序之間的關系與原發(fā)性RMS腫瘤觀察到的類似：表達mesenchymal-like程序和myoblast-like程序是互斥的，而對progenitor-like程序得分較高的細胞在其他兩個程序中得分較低。同樣，在FP腫瘤器官細胞中，myoblast-like和SC-like程序之間存在強烈的負相關性，而高得分的proliferative程序在較低得分的這兩個程序中更常見。接下來，為了評估是否保留了患者特異性的細胞狀態(tài)異質(zhì)性，作者直接比較了來自原發(fā)性腫瘤和衍生腫瘤器官的細胞的元程序得分，其中有4個患者有匹配的樣本?？傮w而言，亞型特異性的元程序得分在原發(fā)性腫瘤和腫瘤器官樣本之間有重疊。在RMS012中，與原發(fā)性腫瘤細胞相比，腫瘤器官中的細胞通常對mesenchymal-like程序得分較低，這可能是由于體外選擇對較不增殖的mesenchymal-like狀態(tài)細胞的影響。綜上所述，原發(fā)腫瘤中存在的亞型特定細胞狀態(tài)也反映在RMS腫瘤器官模型中，這表明這種異質(zhì)性確實在很大程度上是惡性細胞固有的，而不是由TME誘導的。
7、惡性細胞狀態(tài)與患者預后密切相關
      綜上所述，NMF定義的轉錄程序的分析結果使作者能夠提出FN和FP RMS腫瘤的細胞狀態(tài)和分化軌跡的統(tǒng)一模型（圖5a，b）。FN腫瘤是一種高度增殖的細胞，具有早期成肌祖細胞(祖細胞樣細胞)的特征，可分化為兩種類型：肌源性間充質(zhì)細胞(間充質(zhì)樣細胞)或終末分化成肌細胞/肌細胞(成肌細胞樣細胞)。另一方面，在FP腫瘤中，高增殖細胞(增殖期)是類似分化的肌細胞(肌母細胞樣)或出生后骨骼肌駐留衛(wèi)星細胞(SC樣細胞)之間的中間細胞。為了研究RMS腫瘤的分化狀態(tài)是否會影響它們的臨床行為，作者對一組已發(fā)布的腫瘤樣本的基因表達譜進行了評分，以獲得每個元程序的分數(shù)。值得注意的是，分化程度高的FN RMS患者(間充質(zhì)樣+成肌樣)的OS概率明顯好于分化程度低的患者（p = 0.00069，圖5c左圖）。這一結果特別耐人尋味，因為細胞狀態(tài)程序本身都不能預測結果。相反，未分化祖細胞樣瘤的高分意味著OS明顯比低分的FN瘤差（p = 0.035，圖5c右圖）。作者比較了分化和祖細胞樣評分與先前驗證的元基因評分對FN RMS患者分層的預測能力。雖然使用MG5.FN分數(shù)區(qū)分高風險和低風險病例的效果略微更顯著，但分化分數(shù)預測了一組預后明顯較差的患者（圖5c）。值得注意的是，MG5.FN分數(shù)中沒有一個基因與構成任何元程序分數(shù)的基因重疊。在FP RMS患者中，SC樣程序的高表達與OS的延長有關(p=0.017)，而高增殖評分表明OS較短（p = 0.029，圖5d）。成肌樣細胞程序在FP腫瘤中的差異表達并不能預測患者的存活率?？傊@些數(shù)據(jù)表明，在FN和FP兩種RMS亞型中，具有更多分化狀態(tài)細胞比例的腫瘤表現(xiàn)出比高水平增殖、較低分化細胞更好的預后。

參考文獻：
DeMartino J, Meister MT, Visser LL, Brok M, Groot Koerkamp MJA, Wezenaar AKL, Hiemcke-Jiwa LS, de Souza T, Merks JHM, Rios AC, Holstege FCP, Margaritis T, Drost J. Single-cell transcriptomics reveals immune suppression and cell states predictive of patient outcomes in rhabdomyosarcoma. Nat Commun. 2023 May 27;14(1):3074.