靶向誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療

       膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是一種高度侵襲性的腫瘤，目前缺乏有效的治療方法。細(xì)胞焦亡已成為一種有前途的癌癥治療方法，但仍需要新的焦亡促進(jìn)劑來靶向癌細(xì)胞。本研究報(bào)道來源于植物的天然化合物蘆薈大黃素（AE）可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡抑制GBM細(xì)胞，使其成為焦亡介導(dǎo)的GBM治療的潛在助推器。然而，由于血腦屏障（BBB）及其非選擇性，給藥AE具有挑戰(zhàn)性。為克服這一障礙，開發(fā)了AE @ ZIF-8 NPs，一種生物礦化的納米載體，可以響應(yīng)腫瘤的酸性微環(huán)境（TAM）釋放AE。進(jìn)一步用轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）和聚乙二醇-聚嵌段共聚物（乳酸-羥基乙酸）（PEG-PLGA）修飾納米載體，分別提高其穿過BBB和腫瘤靶向性。結(jié)果表明，AE-NPs（Tf-PEGPLGA修飾AE @ ZIF-8 NPs）顯著增加顱內(nèi)分布和腫瘤組織蓄積，增強(qiáng)GBM焦亡。此外，AE-NPs激活抗腫瘤免疫并降低AE相關(guān)毒性?？偟膩碚f，本研究為GBM治療提供了一種新的方法，并提供了一種能夠穿透BBB、靶向腫瘤和減輕毒性的納米載體。研究于2023年4月發(fā)表在期刊《Small》上，IF: 15.153。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：
1、AE抑制GBM細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡
       蘆薈大黃素（Aloe-emodin, AE）是一種具有抗腫瘤作用的天然單體化合物（圖1A）。為探索AE潛在的抗GBM活性，作者對(duì)GBM人細(xì)胞系U87MG和GBM小鼠細(xì)胞系GL261給予AE。Cell Counting Kit 8（CCK-8）實(shí)驗(yàn)表明AE以時(shí)間和濃度依賴的方式抑制GBM細(xì)胞（圖1B），并且AE處理的GBM細(xì)胞的形態(tài)表現(xiàn)出焦亡特異性特征，如細(xì)胞膜腫脹和起泡（圖1C），提示AE可能誘導(dǎo)GBM細(xì)胞焦亡。由于細(xì)胞焦亡伴隨著乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的胞外釋放，為進(jìn)一步證實(shí)AE誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，作者下面檢測(cè)AE處理的U87MG細(xì)胞中LDH的釋放，結(jié)果顯示LDH的釋放隨著AE濃度的增加而增加（圖1D）。這些結(jié)果表明，AE抑制GBM細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。

圖1 AE誘導(dǎo)GBM細(xì)胞焦亡

2、AE激活GBM細(xì)胞中的CASP3 / GSDME焦亡通路
       細(xì)胞焦亡主要通過caspase-1 / gasdermin D（CASP1 / GSDMD）途徑或CASP3 / GSDME途徑激活。為明確AE介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的機(jī)制，進(jìn)行AE-GBM網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。與AE和GBM相關(guān)的重疊靶點(diǎn)的Venn圖確定了44個(gè)GBM治療AE的潛在靶點(diǎn)（圖2A）。用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這44個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析（圖2B），PPI網(wǎng)絡(luò)顯示44個(gè)節(jié)點(diǎn)和473條邊。作者接下來對(duì)每個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，篩選出節(jié)點(diǎn)度大于23的前20個(gè)靶點(diǎn)。這些靶點(diǎn)包括AKT1、ALOX5、AKT2、BCL2L1、CASP3、CASP9、CDK2、CDK6。其中，CASP3是核心交集靶點(diǎn)之一（圖2C）。由于CASP3是CASP3 / GSDME焦亡通路的關(guān)鍵蛋白，作者推測(cè)AE可能通過CASP3 / GSDME通路誘導(dǎo)GBM焦亡。體外研究證實(shí)AE誘導(dǎo)CASP3和GSDME的激活，但不誘導(dǎo)GSDMD（圖2D-E）的激活，這與經(jīng)典的焦亡誘導(dǎo)劑順鉑相似。
       有報(bào)道顯示GSDME的表達(dá)決定了細(xì)胞焦亡是否在化療藥物誘導(dǎo)的抗腫瘤過程中占主導(dǎo)地位。作者接下來通過Western blot（WB）和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析GSDME在GBM細(xì)胞系和腫瘤組織中的表達(dá)情況。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ualcan.path.uab.edu/index. html）分析結(jié)果顯示，與其他腫瘤和正常腦組織相比，GSDME在GBM（圖2F-G）中高表達(dá)。WB顯示GSDME在HMO6（人小膠質(zhì)細(xì)胞系）細(xì)胞中呈陰性表達(dá)，在人GBM細(xì)胞系U87MG、DBTRG中表達(dá)較高，其次是HepG2、Hela、A549，甚至在小鼠細(xì)胞中也有表達(dá)。最重要的是，GSDME在GBM細(xì)胞系GL261中的表達(dá)高于小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2（圖2H）。這些結(jié)果提示GSDME通過激活CASP3 / CASP3 / CASP3 / CASP3是抗GBM治療的良好靶點(diǎn)。

圖2 AE激活GBM細(xì)胞中的CASP3 / GSDME焦亡通路

3、AE-NPS的表征及其酸性微環(huán)境響應(yīng)性研究
       為改善AE的顱內(nèi)分布和腫瘤富集，作者通過兩步法構(gòu)建了AE-NPs（Scheme 1A）。首先，通過在Zn(NO₃)₂和2 -甲基咪唑礦化過程中包裹AE合成了AE @ ZIF-8納米顆粒。隨后，用Tf-PEG-PLGA聚合物包覆AE @ ZIF-8 NPs?？瞻譠IF-8、AE @ ZIF-8和AE-NPs的外觀如圖3A所示。本研究選擇10 mg AE用于最終的AE @ ZIF-8 NPs處方和后續(xù)實(shí)驗(yàn)。AE的負(fù)載量為43.2%，AE @ ZIF-8的包封率為32.6%，動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測(cè)得AE @ ZIF-8的流體力學(xué)尺寸為155.1 ± 42.41 nm（圖3B），表面zeta電位為20.3 ± 7.95 mV（圖3C）。本研究選擇7：3的體積比進(jìn)行AE-NPs的制備及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。作者通過DLS測(cè)得AE-NPs的水動(dòng)力學(xué)粒徑為199 ± 85 nm（圖3B），并在96 h內(nèi)保持穩(wěn)定（圖3G），表面Zeta電位為13.8 ± 6.49 nm（圖3C），AE-NPs的包封率為22.5 %。由于正常腦組織的細(xì)胞間隙為38-68 nm，而腫瘤組織的細(xì)胞間隙為7-100 nm，這表明作者制備的AE-NPs可以自由通過腦組織間隙和腫瘤細(xì)胞間隙。
       通過TEM檢測(cè)空白ZIF-8 NPs、AE @ ZIF-8 NPs、AE-NPs時(shí)，AE-NPs表面有突出的Tf-PEG-PLGA包裹（圖3E中的紫紅色箭頭）。與AE @ ZIF-8相比，AE-NPs的傅里葉變換紅外（FTIR）光譜在1500-1700 cm^-1之間也出現(xiàn)了新的吸收峰（圖3F）。這可能是由轉(zhuǎn)鐵蛋白與PEG-PLGA的酰胺鍵上-CO-NH-的伸縮振動(dòng)峰引起的，提示AE-NPs制備成功。
酸性環(huán)境響應(yīng)的降解能力使ZIF-8 NPs成為靶向腫瘤和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的高效載體。為測(cè)試Tf-PEG-PLGA聚合物涂層是否會(huì)干擾ZIF-8 NPs的pH響應(yīng)性能，作者進(jìn)一步進(jìn)行了pH降解實(shí)驗(yàn)。作者的實(shí)驗(yàn)表明AE-NPs在中性環(huán)境中穩(wěn)定，而在酸性環(huán)境中隨著AE的釋放而降解（圖3H-K）。這些結(jié)果表明AE-NPs與酸性微環(huán)境發(fā)生了反應(yīng)。

Scheme 1

圖3：AE-NPS的表征及其酸性微環(huán)境響應(yīng)性研究

4、NPs促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)攝取和AE介導(dǎo)的GBM細(xì)胞焦亡
       為評(píng)估GBM細(xì)胞對(duì)AE-NPs的攝取情況，作者將熒光染料吲哚菁綠包裹在ZIF-8顆粒（ICG @ ZIF-8）和Tf-PEG-PLGA聚合物包裹的ZIF-8 NPs（ICG-NPs）中。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示ICG、ICG @ ZIF-8和ICGNPs以時(shí)間依賴性方式進(jìn)入U(xiǎn)87MG細(xì)胞（圖4A）。各時(shí)間點(diǎn)ICG-NPs組ICG陽(yáng)性細(xì)胞比例及其熒光強(qiáng)度均顯著高于ICG組和ICG @ ZIF-8組（圖4B）。因此，作者推測(cè)Tf-PEG-PLGA聚合物包裹的ZIF-8 NPs增加U87MG細(xì)胞對(duì)ICG的細(xì)胞內(nèi)攝取。接下來用ICG、ICG @ ZIF-8和ICG-NPs處理U87MG細(xì)胞6 h。激光共聚焦顯微鏡（LSCM）顯示ICG-NPs處理組的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（圖4C），證實(shí)攝取增加。
       由于Tf-PEG-PLGA聚合物包裹的ZIF-8 NPs增加了細(xì)胞內(nèi)對(duì)貨物的攝取，因此作者想知道Tf-PEG-PLGA聚合物包裹的ZIF-8 NPs是否也增強(qiáng)了AE的抗腫瘤效果。因此，作者接下來用AE和AE-NPs處理U87MG細(xì)胞24 h，測(cè)定細(xì)胞存活率。納米粒包載AE表現(xiàn)出明顯更高的抑制效果（圖4D）。為研究細(xì)胞攝取增加是否影響細(xì)胞死亡機(jī)制，作者接下來用共聚焦高強(qiáng)度成像分析系統(tǒng)觀察了AE和AE-NPs處理的U87MG細(xì)胞。結(jié)果顯示，AE-NPs處理組細(xì)胞焦亡發(fā)生在24 h內(nèi)，而AE組細(xì)胞焦亡時(shí)間超過60 h（圖4E），AE-NPs處理組細(xì)胞焦亡發(fā)生在24 h內(nèi)，而AE組細(xì)胞焦亡發(fā)生在24 h內(nèi)（圖4F）。這表明TfPEG-PLGA聚合物包裹的ZIF-8 NPs對(duì)AE的包裹通過增強(qiáng)細(xì)胞焦亡進(jìn)一步增強(qiáng)了抗GBM細(xì)胞的作用。

圖4 NPs促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)攝取和AE介導(dǎo)的GBM細(xì)胞焦亡

5、AE-NPS增加AE在體內(nèi)的顱內(nèi)分布和腫瘤富集
       化療藥物在GBM治療中面臨的主要挑戰(zhàn)是BBB穿透和腫瘤靶向性。因此，制備游離ICG、ICG @ ZIF-8、ICG-NPs作為納米示蹤劑，評(píng)價(jià)Tf-PEG-PLGA包裹ZIF-8 NPs的體內(nèi)生物分布、BBB滲透和腫瘤靶向能力。按計(jì)劃，首先通過尾靜脈注射（ICG標(biāo)準(zhǔn)化為3 mg kg-1）對(duì)C57BL/6j小鼠進(jìn)行ICG、ICG @ ZIF-8和ICG-NPs處理，然后進(jìn)行光學(xué)活體成像，檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)ICG在腦和主要器官的生物分布。結(jié)果表明，與ICG和ICG @ ZIF-8相比，ICG-NPs在15 min內(nèi)具有更好的顱內(nèi)富集性，在（圖5A、B）后24 h具有明顯的顱內(nèi)滯留，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）定量進(jìn)一步證實(shí)了AE-NPs組在（圖5D ;圖S10 ,支持信息）后2 h內(nèi)腦內(nèi)AE濃度高于其他組。器官分布顯示Tf-PEG-PLGA包裹的ZIF-8 NPs延長(zhǎng)了在體內(nèi)的滯留時(shí)間。作者的研究還表明，與游離ICG相比，ICG @ ZIF-8早期腦分布較低，但（圖5A ~ C）滯留時(shí)間較長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，負(fù)載Tf-PEG-PLGA包裹的ZIF-8 NPs增強(qiáng)了貨物進(jìn)入腦內(nèi)的能力，延長(zhǎng)了滯留時(shí)間。隨后，為了評(píng)估腫瘤靶向能力，制備了ICG和ICG-NPs處理小鼠的荷瘤腦冷凍切片。結(jié)果顯示，ICGNPs在腫瘤組織（圖5E ;圖S11 ,支持信息）中顯著富集，LC-MS定量進(jìn)一步證實(shí)AE-NPs組腫瘤組織具有較高的AE濃度（圖5D ;圖S10 ,支持信息）。

圖5 AE-NPS增加AE在體內(nèi)的顱內(nèi)分布和腫瘤富集

6、AE-NPs增強(qiáng)了AE介導(dǎo)的體內(nèi)抗腫瘤作用
       為進(jìn)一步評(píng)價(jià)AE-NPs的抗腫瘤作用，作者進(jìn)行GL261原位GBM小鼠模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。接種和成瘤后，動(dòng)物隨機(jī)分為4組，每2天經(jīng)尾靜脈注射1 % F127 NS、AE、Tf-PEG-PLGA聚合物包裹的ZIF-8 NPs（NPs）、AE @ ZIF-8 AE-NPs。每周測(cè)量體重、腫瘤熒光素酶表達(dá)和精神狀態(tài)（圖6A）。結(jié)果顯示，給藥1周后，對(duì)照組（Con）組、NPs組、AE組GBM的熒光持續(xù)增強(qiáng)，其中Con組熒光增強(qiáng)最為明顯。相比之下，在AE-NPs組中降低（圖6B、C）。與其他3組相比，AE-NPs對(duì)腫瘤體積和重量的降低作用更強(qiáng)。此外，與對(duì)照組相比，NPs還降低腫瘤體積和重量（圖6D-E），這可能歸因于ZIF-8 NPs的細(xì)胞毒性作用。盡管NPs和AE對(duì)腫瘤體積和重量的減少具有相似的效果，但AE組在組織病理學(xué)上顯示腫瘤壞死增加（圖6F）。
       最后，通過HE、Ki-67染色和WB實(shí)驗(yàn)明確AE-NPs作用于GBM的機(jī)制。HE染色顯示各組均有腫瘤壞死，但AE組、AE @ ZIF-8組和AE-NPs組腫瘤壞死更明顯（圖6F）。Ki-67染色是增殖的生物標(biāo)志物，免疫組化結(jié)果顯示AE-NPs處理的GBM組織中Ki-67表達(dá)較低（圖6G-H），支持抑制增殖。給藥結(jié)束時(shí)，AE-NPs組的終末生存率優(yōu)于其他4組（圖6I）。這些結(jié)果表明AE-NPs促進(jìn)壞死，抑制GBM生長(zhǎng)，改善預(yù)后。隨后，為進(jìn)一步在分子水平上證實(shí)其抗腫瘤機(jī)制，作者通過WB檢測(cè)了不同處理的腫瘤組織中焦亡關(guān)鍵生物標(biāo)志物CASP3、C-CASP3、GSDME和GSDME-N的表達(dá)水平。與其他3組相比，AE-NPs顯著增強(qiáng)了CASP3和GSDME的活化（圖6J-K）。同時(shí)，AE @ ZIF-8顯示出焦亡激活能力，這可能是由于AE @ ZIF-8在腫瘤組織中富集引起的。

圖6 AE-NPs增強(qiáng)了AE介導(dǎo)的體內(nèi)抗腫瘤作用

7、AE-NPs調(diào)控GBM免疫微環(huán)境
       以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)AE-NPs在體內(nèi)外均激活CASP3 / GSDME焦亡通路。作為一種免疫原性死亡模型，細(xì)胞焦亡具有激活固有免疫和適應(yīng)性免疫以放大抗腫瘤效應(yīng)的潛力。因此，通過流式細(xì)胞術(shù)（FCM）和免疫熒光檢測(cè)免疫細(xì)胞CD8 ⁺ T細(xì)胞、CD4⁺ T細(xì)胞、Treg細(xì)胞（Fox P3⁺）、巨噬細(xì)胞及其M1亞型（抗炎、抗腫瘤亞型, CD86⁺）。CD8 ⁺ T細(xì)胞是抗腫瘤免疫的關(guān)鍵免疫細(xì)胞。因此，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理組腫瘤組織中CD8 ⁺ T細(xì)胞的浸潤(rùn)水平。結(jié)果顯示，與con組相比，AE、AE @ ZIF-8和AE-NPS組CD8表達(dá)水平均有提高，尤其是AE-NPs組（CD8 ⁺ T細(xì)胞占CD3 ⁺ T細(xì)胞的比例由31 %提高到64 %）（圖7A、E）。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為CD8 ⁺ T細(xì)胞上表達(dá)的PD-1作為抑制性受體介導(dǎo)免疫耐受，但也有報(bào)道稱PD-1表達(dá)于抗原刺激后CD8 + T細(xì)胞活化的早期階段。因此，PD-1升高可能來自于CD8 ⁺ T細(xì)胞活化，即[ 34、35]，但其確切作用有待進(jìn)一步探討。CD4 ⁺ T細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞，CD4 ⁺ T細(xì)胞及其亞型Treg細(xì)胞（FoxP3 ⁺ ,介導(dǎo)免疫耐受）也被檢測(cè)到。FCM顯示與con組相比，AE-NPs組CD4 ⁺ T由71.45 %上升至86.18 %，Treg細(xì)胞（圖7B、E、F）無明顯差異。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞功能復(fù)雜，但M1亞型（M1Φ）浸潤(rùn)有利于其發(fā)揮抗腫瘤作用。進(jìn)一步，作者通過qPCR檢測(cè)抗腫瘤免疫相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、HMGB1、TNF-α，結(jié)果如圖7HJ所示，與對(duì)照組相比，AE-NPs組IFN-γ、HMGB1、TNF-α mRNA表達(dá)增加6 ~ 17倍，驗(yàn)證了免疫微環(huán)境的激活。

圖7 AE-NPs調(diào)控GBM免疫微環(huán)境

8、AE-NPs可減輕AE相關(guān)的肝毒性和腎毒性
       與許多化療藥物類似，高濃度AE的肝毒性和腎毒性作用已被報(bào)道。同時(shí)，高濃度和未修飾的ZIF-8 NPs也有明顯的毒性反應(yīng)。因此，有必要對(duì)新構(gòu)建的AE-NPs進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。因此，作者對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行了體內(nèi)CCK-8、體重、血液生化和組織病理學(xué)檢測(cè)。盡管空白納米粒在體內(nèi)（圖6B、E、F）有明顯的GBM抑制作用，但低劑量的Zn(NO₃)₂、2 -甲基咪唑、ZIF-8、Tf-PEG-PLGA和空白納米粒在體外均未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性（圖8A）。血液生化分析顯示，AE、AE @ ZIF-8和NPs處理組的肝損傷標(biāo)志物谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）（圖8B、C）和腎損傷標(biāo)志物BUN升高（圖8E），而γ-GT和CRE無變化（圖8D、F）。令人驚訝的是，在AE-NPs處理的小鼠中，ALT、AST和BUN沒有明顯變化。此外，通過HE染色的組織病理學(xué)顯示，AE處理組的肝臟中檢測(cè)到局灶性壞死，而NPs和AE-NPs處理組沒有檢測(cè)到（圖8G）。這些結(jié)果表明AE和NPs引起的肝腎損傷均被AE-NPs顯著減輕。這可能是腫瘤靶向性增強(qiáng)的結(jié)果，降低了藥物相關(guān)的脫靶毒性和副作用。4周內(nèi)，對(duì)照組和NPs組小鼠體重下降，AE @ ZIF-8和AE-NPs組小鼠體重下降不明顯。NPs組ALT輕度升高，AST、γ-GT、Cr、BUN無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖8 AE-NPs可減輕AE相關(guān)的肝毒性和腎毒性

實(shí)驗(yàn)方法：
       體外釋放和PH響應(yīng)分析，C57BL/6J小鼠，CCK-8， LDH Release Assay，qPCR，Body Distribution，生信分析（Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)查詢AE靶點(diǎn)及相關(guān)靶基因，UniPort蛋白標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)庫(kù)，AE-GBM靶蛋白-蛋白相互作用（PPI）的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建），血液生化檢查，HE染色，免疫組織化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù).

參考文獻(xiàn)
Fang X, Chen Z, Zhou W, Li T, Wang M, Gao Y, Ma S, Feng Y, Du S, Lan P, Chen H, Wei J, Zhang S, Li Z, Liu X, Zhang H, Guo X, Luo J. Boosting Glioblastoma Therapy with Targeted Pyroptosis Induction. Small. 2023 Apr 17:e2207604. doi: 10.1002/smll.202207604. Epub ahead of print. PMID: 37066699.