組蛋白乳酸化促進(jìn)心肌梗死后修復(fù)性基因激活
心肌梗死(MI)后炎癥的消退和心臟修復(fù)的啟動(dòng)需要及時(shí)激活修復(fù)信號(hào)。組蛋白乳酸化通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控賦予巨噬細(xì)胞穩(wěn)態(tài)基因表達(dá)特征。但組蛋白乳酸化在心肌梗死后修復(fù)反應(yīng)中的作用尚不清楚。我們旨在研究組蛋白乳酸化是否在心肌梗死早期和遠(yuǎn)程后誘導(dǎo)單核細(xì)胞的修復(fù)性基因表達(dá)。我們證明組蛋白乳酸化通過(guò)促進(jìn)修復(fù)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)單核-巨噬細(xì)胞的抗炎和促血管生成雙重活性，并證實(shí)組蛋白乳酸化有利于修復(fù)環(huán)境并改善心肌梗死后的心功能。此外，我們探索了單核細(xì)胞組蛋白乳酸化在再灌注心肌梗死中的潛在積極作用。機(jī)制上，我們提供了新的證據(jù)，證明單核細(xì)胞在心肌梗死早期經(jīng)歷代謝重編程，并證明糖酵解和MCT1(單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1)介導(dǎo)的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)失調(diào)促進(jìn)組蛋白乳酸化。最后，我們揭示了IL(白細(xì)胞介素)-1β依賴的GCN5(一般控制非抑制性5)募集對(duì)組蛋白H3K18乳酸化的催化作用，并闡明了其作為上游調(diào)控元件在單核細(xì)胞組蛋白乳酸化調(diào)控和心肌梗死后下游修復(fù)基因表達(dá)中的潛在作用。組蛋白乳酸化促進(jìn)單核細(xì)胞修復(fù)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的早期遠(yuǎn)程激活，這對(duì)于心肌梗死后免疫穩(wěn)態(tài)的建立和心臟修復(fù)過(guò)程的及時(shí)激活至關(guān)重要。本文于2022年11月發(fā)表于Circulation Research (IF=23.213)。
技術(shù)路線
結(jié)果
(1) 修復(fù)基因在心臟招募前在骨髓和循環(huán)單核細(xì)胞中被早期和遠(yuǎn)程激活
單核巨噬細(xì)胞從炎癥狀態(tài)及時(shí)過(guò)渡到修復(fù)狀態(tài)決定了免疫穩(wěn)態(tài)和心肌梗死的結(jié)局。我們假設(shè)修復(fù)性基因激活可能在心臟招募前在骨髓和循環(huán)單核細(xì)胞內(nèi)啟動(dòng)。為驗(yàn)證這一假設(shè)，使用不同時(shí)間點(diǎn)心肌梗死小鼠BM和循環(huán)白細(xì)胞的單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。在解復(fù)用和定位到參考基因組后，我們進(jìn)行了粗略的聚類，以大致定義5種主要的細(xì)胞類型，并關(guān)注單核細(xì)胞上(圖1A和1B)。在27284個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中，5346個(gè)單核細(xì)胞根據(jù)樣本來(lái)源和心肌梗死后的不同時(shí)間點(diǎn)分為7組：心肌梗死后0、1、2天的BM單核細(xì)胞和心肌梗死后0、1、2、4天的外周血單核細(xì)胞(圖1C)。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基因本體學(xué)(GO)術(shù)語(yǔ)分析揭示了心肌梗死第一天單核細(xì)胞群體中顯示的主要過(guò)程，表明單核細(xì)胞除了上調(diào)和放大心肌梗死后的炎癥反應(yīng)外，還迅速啟動(dòng)修復(fù)過(guò)程，包括對(duì)血管生成和傷口愈合的反應(yīng)(圖1D)。小提琴圖顯示了一系列經(jīng)典修復(fù)基因，包括Anxa6、F10、Lrg1和Tgfbi在MI后早期的表達(dá)(圖1E)。心肌梗死后單核細(xì)胞發(fā)育過(guò)程的偽時(shí)間軌跡分析顯示，BM和循環(huán)單核細(xì)胞中的修復(fù)基因被早期激活，并隨時(shí)間的推移逐漸積累(圖1F和1G)。
為探討心肌梗死后不同單核細(xì)胞亞群的修復(fù)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，我們將單核細(xì)胞分為2個(gè)亞群；Ly6Chi和Ly6Clo，并檢測(cè)了單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)中不同亞群中代表性修復(fù)基因的表達(dá)(圖S1E和S2G)。在第1天對(duì)假手術(shù)小鼠和心肌梗死后小鼠的循環(huán)Ly6Chi和Ly6Clo單核細(xì)胞進(jìn)行分類后，采用逆轉(zhuǎn)錄-qPCR (RT-qPCR)檢測(cè)修復(fù)基因的表達(dá)。修復(fù)基因在Ly6Chi單核細(xì)胞亞群和Ly6Clo單核細(xì)胞亞群中都在早期被激活(圖S1F)。
為驗(yàn)證上述發(fā)現(xiàn)，對(duì)假手術(shù)或心肌梗死第1天小鼠的循環(huán)單核細(xì)胞進(jìn)行了RNAseq分析，鑒定出心肌梗死后650個(gè)上調(diào)基因和203個(gè)下調(diào)基因，表明循環(huán)單核細(xì)胞在到達(dá)損傷心臟之前發(fā)生了早期和明顯的轉(zhuǎn)錄組變化(圖1H)。氧化石墨烯項(xiàng)富集分析證實(shí)，修復(fù)基因的表達(dá)，包括參與血管發(fā)育、傷口愈合和細(xì)胞外基質(zhì)組織的基因，被廣泛和遠(yuǎn)程激活(圖1I)。為篩選以血管發(fā)生為代表的關(guān)鍵修復(fù)過(guò)程中的樞紐基因，使用CytoScape軟件對(duì)血管發(fā)育中富集的基因進(jìn)行了蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。在基于MCC方法的網(wǎng)絡(luò)中優(yōu)先級(jí)最高的10個(gè)基因中，已知的修復(fù)基因Vegf-a和IL-10被確定為MI后早期修復(fù)網(wǎng)絡(luò)的潛在樞紐基因(圖1J)。此外，我們對(duì)心肌梗死和假手術(shù)小鼠術(shù)后第1天的BM單核細(xì)胞進(jìn)行了RNA測(cè)序，心肌梗死后傷口愈合信號(hào)和相關(guān)修復(fù)基因的快速上調(diào)，證實(shí)了心肌梗死后單核細(xì)胞修復(fù)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的早期遠(yuǎn)程激活(圖S2H和S2I)。此外，BM和外周血中的Ly6Chi和Ly6Clo亞群都表現(xiàn)出早期修復(fù)途徑的啟動(dòng)，包括血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)組裝和IL(白細(xì)胞介素)-10的產(chǎn)生(圖S2J至S2Q)。
總之，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了單核細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上及時(shí)啟動(dòng)修復(fù)活性，并強(qiáng)調(diào)了通過(guò)早期對(duì)炎癥和修復(fù)基因的細(xì)致調(diào)節(jié)，心肌梗死后免疫環(huán)境的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。
圖1：心肌梗死后骨髓(BM)和循環(huán)單核細(xì)胞修復(fù)基因的早期激活
(2) 心肌梗死后骨髓和循環(huán)單核細(xì)胞組蛋白乳酸化迅速升高
為探討乳酸化在心肌梗死后單核細(xì)胞修復(fù)基因的早期和遠(yuǎn)程激活中的作用，我們?cè)u(píng)估了心肌梗死早期心肌梗死中心肌和循環(huán)單核細(xì)胞以及心肌浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞中乳酸化的變化。我們通過(guò)磁頭分選從心肌梗死小鼠中分離心肌和循環(huán)單核細(xì)胞(圖S3A和S3B)。WB分析顯示，與對(duì)照組小鼠相比，MI小鼠骨髓和循環(huán)單核細(xì)胞的整體乳酸水平顯著升高，并且在17 kDa附近出現(xiàn)了一個(gè)優(yōu)勢(shì)條帶，這可能代表了組蛋白H3(圖2A和2B)。在不同時(shí)間點(diǎn)采集心肌梗死后小鼠的單核細(xì)胞免疫印跡表明，乳酸化水平早在心肌梗死后4至24小時(shí)就顯著上調(diào)，并保持高水平直至72小時(shí)。相反，乙?；皆谛募」Ｋ涝缙谠黾?，并在心肌梗死后72小時(shí)內(nèi)迅速下降至基線水平(圖2C至圖2F)。我們檢測(cè)了先前鑒定的組蛋白H3K18乳酸化水平(H3K18la)，其趨勢(shì)與全球乳酸化水平相似(圖2G至2J)。H3K18la水平維持在高水平長(zhǎng)達(dá)7天，并在心肌梗死后14天恢復(fù)到基線水平(圖S3D)。同樣，在Ly6Chi亞群中發(fā)現(xiàn)H3K18la水平上升，而Ly6Clo單核細(xì)胞也顯示出類似上升趨勢(shì)，但時(shí)間稍晚(圖S3E和S3F)。與此一致，心肌梗死后3天的免疫熒光染色顯示心肌梗死區(qū)整體乳酸化和H3K18la水平顯著升高，合并共聚焦圖像顯示，乳酸化定位于梗死區(qū)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核(圖2K和2L)。綜上所述，心肌梗死后心肌梗死局部和遠(yuǎn)端外周的單核巨噬細(xì)胞顯示組蛋白乳酸化增加。
圖2：心肌梗死(MI)后骨髓和循環(huán)單核細(xì)胞組蛋白乳酸化水平升高
(3) 組蛋白乳酸化促進(jìn)修復(fù)基因Lrg1、Vegf-a和IL-10的激活
為篩選心肌梗死中組蛋白乳酸化的候選靶基因，從假手術(shù)小鼠和心肌梗死小鼠中篩選心肌梗死后24小時(shí)的循環(huán)單核細(xì)胞，并使用抗H3K18la或抗H3K18ac抗體對(duì)其進(jìn)行CUT&Tag檢測(cè)。H3K18la富集于基因的啟動(dòng)子區(qū)域和上游區(qū)域(圖3A)。大多數(shù)H3K18la或H3K18ac增加的基因都是特異性的，H3K18la修飾相關(guān)基因與H3K18ac在心肌梗死后顯著不同。這些基因中只有14%(4168個(gè)中的566個(gè))同時(shí)顯示H3K18la和H3K18ac顯著增加，而63%的H3K18la標(biāo)記基因沒(méi)有顯示H3K18ac顯著增加(圖3B和3C)。H3K18la修飾的基因主要參與免疫、內(nèi)分泌和循環(huán)系統(tǒng)；心血管疾??；以及脂質(zhì)和碳水化合物代謝(圖S4B)。基因集富集分析表明，H3K18la結(jié)合的基因在很大程度上與血管生成和傷口愈合有關(guān)(圖3D)。
為鑒定單核細(xì)胞MI后H3K18la靶基因，我們結(jié)合CUT&Tag和RNA-seq數(shù)據(jù)，根據(jù)基因表達(dá)和H3K18la修飾將基因分為4類：H3K18la差異或上調(diào)基因，H3K18la差異或下調(diào)基因(圖3E)。圖S4C中的熱圖顯示了H3K18la修飾基因與上調(diào)基因的相關(guān)性。對(duì)兩類H3K18la修飾基因的從頭基序搜索，H3K18la上調(diào)和下調(diào)的基因具有不同的富集DNA序列(圖3F)。GO分析顯示，心肌梗死期間H3K18la修飾增加的上調(diào)基因積極參與血管生成的正調(diào)控(圖3G)。RNAseq顯示，許多參與血管生成過(guò)程的代表性基因(如Vegf-a、Lrg1和IL-10，也是H3K18la修飾升高的基因)在心肌梗死后顯著上調(diào)(圖3H)。我們篩選了H3K18la修飾上調(diào)的前30個(gè)基因，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄上調(diào)進(jìn)行排名；Lrg1表達(dá)上調(diào)最顯著(圖3I)。因此Vegf-a、IL-10和Lrg1作為乳酸化的潛在靶基因(圖3J)。基因組快照顯示了Vegf-a、IL-10和Lrg1中的H3K18la修飾位點(diǎn)(圖S4D)。為在MI后1日的循環(huán)單核細(xì)胞中驗(yàn)證CUT&Tag和RNA-seq數(shù)據(jù)，進(jìn)行了RT-qPCR和染色質(zhì)免疫沉淀-qPCR (ChIP-qPCR)分析，以確認(rèn)Vegf-a、IL-10和Lrg1的啟動(dòng)子區(qū)表達(dá)增加和H3K18la富集(圖3K和3L)。只有Vegf-a在心肌梗死后表現(xiàn)出不同的H3K18ac修飾水平。ChIP-qPCR證實(shí)，心肌梗死后循環(huán)單核細(xì)胞中Vegf-a的H3K18ac修飾位點(diǎn)與H3K18la不同(圖S4F)。qRT-PCR和ChIP-qPCR也驗(yàn)證了心肌梗死后不同單核細(xì)胞亞群中H3K18la靶基因的上調(diào)和乳酸化水平(圖S4G至S4J)。
綜上所述，在心肌梗死后單核細(xì)胞中確定了H3K18la的靶基因，H3K18la可啟動(dòng)心肌梗死后早期遠(yuǎn)程修復(fù)基因激活，有望促進(jìn)心肌梗死后心臟及時(shí)修復(fù)。
圖3：H3K18la啟動(dòng)心肌梗死(MI)后修復(fù)基因Lrg1、Vegf-a和IL-10的表達(dá)
(4) H3K18la調(diào)控巨噬細(xì)胞靶基因的轉(zhuǎn)錄和修復(fù)活性
為研究H3K18la對(duì)修復(fù)基因表達(dá)的直接影響，我們通過(guò)外源性乳酸或乳酸脫氫酶抑制劑FX-11處理骨髓源性巨噬細(xì)胞(BMDM)的組蛋白乳酸化水平。鈣黃素和碘化丙啶染色和免疫印跡分析顯示，在濃度高達(dá)40 μM時(shí)，F(xiàn)X-11對(duì)BMDMs無(wú)明顯的有害作用，對(duì)H3K18la有明顯的抑制作用(圖S5A和S5B)。脂多糖(LPS)刺激BMDMs導(dǎo)致H3K18la水平升高(圖4A)。添加外源性乳酸后，細(xì)胞內(nèi)乳酸水平和組蛋白H3K18la水平升高(圖4B和4C)，與以往研究一致。ChIP-qPCR顯示靶基因啟動(dòng)子區(qū)H3K18la富集增加，RT-qPCR結(jié)果證實(shí)乳酸處理后靶基因表達(dá)上調(diào)(圖4D和4E)。FX-11顯著抑制BMDM細(xì)胞內(nèi)乳酸和H3K18la水平(圖4F和4G)。ChIP-qPCR和RT-qPCR顯示，F(xiàn)X-11處理后H3K18la強(qiáng)度和靶基因表達(dá)降低(圖4H和4I)。
我們分析了H3K18la對(duì)體外BMDM功能的影響。采集BMDM并用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析(圖S5C)。促炎M1巨噬細(xì)胞的百分比在乳酸組顯著降低，而在FX-11組增加(圖4J和4K)。為排除乳酸誘導(dǎo)的H3K18la通過(guò)改變環(huán)境酸度影響巨噬細(xì)胞表型的可能性，對(duì)BMDM進(jìn)行了乳酸鈉處理。乳酸鈉增加組蛋白乳酸化水平的程度與乳酸相似，但不影響巨噬細(xì)胞的炎癥表型(圖S5D和S5E)。
通過(guò)EdU標(biāo)記、transwell、劃傷/傷口遷移和管形成試驗(yàn)，評(píng)估了操縱H3K18la水平的單核細(xì)胞的促血管生成能力。小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在乳酸或FX-11刺激的BMDM條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。經(jīng)乳酸處理的BMDMs條件培養(yǎng)基與小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖(圖4L)和向井區(qū)或創(chuàng)口區(qū)域遷移(圖4M和4N)以及形成更有組織的分支和更長(zhǎng)的管長(zhǎng)(圖4O)，提示H3K18la升高的單核細(xì)胞具有增強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞成管能力。
綜上所述，H3K18la促進(jìn)了Lrg1、Vegf-a和IL-10的轉(zhuǎn)錄，提高了BMDM的抗炎和促血管生成雙重修復(fù)活性。
圖4：組蛋白乳酸化激活靶基因轉(zhuǎn)錄和巨噬細(xì)胞修復(fù)活性
(5) 升高的組蛋白乳酸化有利于心肌梗死后的修復(fù)環(huán)境和改善心功能
為評(píng)估組蛋白乳酸化對(duì)缺血性心臟免疫環(huán)境的影響，我們建立了永恒性冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎的小鼠心肌梗死模型，并用乳酸鈉或FX-11處理小鼠，以控制單核細(xì)胞組蛋白乳酸化。預(yù)先確定乳酸鈉劑量，WB結(jié)果如圖S6A和S6B所示。圖5A為乳酸鈉治療心肌梗死小鼠的實(shí)驗(yàn)。乳酸鈉處理小鼠循環(huán)單核細(xì)胞和浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞中的H3K18la水平顯著升高(圖5B和5C)，Lrg1、Vegf-a和IL-10 mRNA水平升高(圖5D)。
乳酸鈉處理后H3K18la的增加抑制了炎癥因子IL-6和TNF(腫瘤壞死因子)-α的表達(dá)(圖5E)。流式細(xì)胞術(shù)顯示，升高的H3K18la抑制了Ly6Chi炎性巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)(圖5F和5G)。HE染色證實(shí)H3K18la升高導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少(圖5H)。CD31和α-SMA (α-平滑肌肌動(dòng)蛋白)的免疫熒光染色表明，乳酸鈉誘導(dǎo)的H3K18la升高促進(jìn)心肌梗死后血管生成(圖5I和5J)。
馬松三色染色顯示，乳酸鈉誘導(dǎo)的H3K18la升高可抑制心肌過(guò)度纖維化和病理性心臟重構(gòu)(圖5K)。乳酸鈉也調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的活化和膠原合成(圖S7A至S7D)。超聲心動(dòng)圖和磁共振顯示，在基線時(shí)，各組之間的心功能和血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)無(wú)顯著差異(圖S6H和S6I)，而與對(duì)照組相比，增加H3K18la改善了MI后的射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)，表明H3K18la除了具有抗炎和促血管生成作用外，還改善了MI后的心功能障礙(圖5L至5N)。
綜上所述，心肌梗死后早期單核巨噬細(xì)胞組蛋白乳酸化的增強(qiáng)有利于心肌梗死后的修復(fù)環(huán)境，有助于心肌梗死后心功能的改善。
圖5：H3K18la升高可改善心肌梗死后的心臟修復(fù)
(6) 抑制組蛋白乳酸化促進(jìn)心肌梗死后的有害炎癥和心功能障礙
圖S8A顯示FX-11治療MI小鼠抑制組蛋白乳酸化的實(shí)驗(yàn)方案。循環(huán)單核細(xì)胞和浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞中H3K18la水平降低(圖S6C、S6D、S8B、S8C)，注射FX-11小鼠中H3K18la靶基因mRNA水平顯著降低(圖S8D)。與H3K18la升高對(duì)乳酸鈉注射的影響相反，H3K18la的抑制促進(jìn)了心肌梗死后血清炎癥因子的表達(dá)，增加了心肌炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)(圖S8E至S8H)，導(dǎo)致血管生成受阻(圖S6G, S8I, S8J)，病理性心臟重構(gòu)加重，心功能喪失(圖S6L、S6M、S8K至S8N)，進(jìn)一步支持組蛋白乳酸化促進(jìn)內(nèi)源性免疫穩(wěn)態(tài)和心肌梗死后心臟修復(fù)。
(7) H3K18la操縱的單核細(xì)胞輸血調(diào)節(jié)心肌梗死后的心臟修復(fù)
為探索H3K18la操縱的單核細(xì)胞經(jīng)乳酸鈉或FX-11處理后是否能將治療效果轉(zhuǎn)移到心肌梗死小鼠身上，從小鼠外周血中分離的循環(huán)單核細(xì)胞分別用乳酸鈉(La-Mo)、FX-11(FX-Mo)或PBS (Con-Mo)刺激24小時(shí)，并用PKH26標(biāo)記，在心肌梗死后6小時(shí)通過(guò)尾靜脈輸注到心肌梗死小鼠體內(nèi)(圖S9A)。這些單核細(xì)胞定位于梗死心臟(圖S10A)。
與全身給藥結(jié)果相似，與對(duì)照組相比，H3K18la (La-Mo)升高的單核細(xì)胞再輸注顯著減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制過(guò)度心肌纖維化，改善心功能，促進(jìn)血管生成(圖S9B至S9H, S10B)。相比之下，F(xiàn)X-Mo組表現(xiàn)出相反的效果，包括炎癥增加、血管生成受限、心臟重塑不良和心功能惡化(圖S9B至S9H, S10B)。
(8) 心肌梗死后循環(huán)單核細(xì)胞內(nèi)源性糖酵解重編程部分促進(jìn)H3K18la
巨噬細(xì)胞糖酵解通過(guò)提供乳酸作為底物來(lái)調(diào)節(jié)組蛋白乳酸化。但單核細(xì)胞在心臟募集前的代謝轉(zhuǎn)變及其在心肌梗死后調(diào)節(jié)乳酸化水平中的作用尚不清楚。我們使用XF24細(xì)胞外通量分析儀測(cè)量心肌梗死后1天循環(huán)單核細(xì)胞的主要代謝參數(shù)，發(fā)現(xiàn)心肌梗死小鼠單核細(xì)胞的基礎(chǔ)細(xì)胞外酸化率相對(duì)較高，糖酵解儲(chǔ)備增加，表明心肌梗死小鼠具有較高的糖酵解代謝能力。耗氧量測(cè)量顯示，心肌梗死小鼠單核細(xì)胞的基礎(chǔ)氧化磷酸化和備用呼吸能力降低。線粒體與氟羰基氰基苯腙解偶聯(lián)后，最大呼吸顯著減少，表明心肌梗死后外周單核細(xì)胞更依賴糖酵解而非氧化代謝(圖6A至6D)。這些數(shù)據(jù)表明單核細(xì)胞在心肌梗死后經(jīng)歷代謝重編程，這可能對(duì)依賴糖酵解的組蛋白乳酸化至關(guān)重要。
為驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)代謝模式和細(xì)胞外代謝物對(duì)乳酸化和乳酸化相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，我們使用C2HCl2NaO2(DCA，丙酮酸脫氫酶激酶抑制劑)和魚(yú)藤酮(線粒體呼吸鏈復(fù)合物I的抑制劑)調(diào)節(jié)糖酵解途徑和線粒體呼吸鏈中涉及的關(guān)鍵酶的活性(圖6E)。用魚(yú)藤酮治療24小時(shí)后，BMDMs細(xì)胞內(nèi)乳酸和H3K18la水平顯著升高，而在乳酸脫氫酶抑制劑FX-11存在時(shí)則降低(圖6F和6G)。ChIP-qPCR和RT-qPCR顯示，魚(yú)烯酮顯著增加了乳酸化修飾和乳酸化靶基因Lrg1、Vegf-a和IL-10的表達(dá)(圖6H和6I)。相比之下，DCA治療后BMDMs細(xì)胞內(nèi)乳酸和H3K18la水平降低。在DCA處理的細(xì)胞中再次添加乳酸成功地恢復(fù)了細(xì)胞內(nèi)乳酸、組蛋白乳酸化水平和H3K18la修飾基因的表達(dá)(圖6J至6M)。
為進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞外乳酸在組蛋白乳酸化中的作用，我們使用了乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MCT1(單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1)抑制劑AZD-3965。外源性乳酸的添加顯著增加了BMDMs中組蛋白乳酸化水平和靶基因表達(dá)，而MCT1抑制顯著抑制了外源性乳酸的這些作用，這表明細(xì)胞外環(huán)境中的乳酸至少部分需要通過(guò)MCT1轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，才能參與乳酸化(圖6N至6P)。
圖6：代謝重編程調(diào)節(jié)單核細(xì)胞中的H3K18la
(9) IL-1β依賴性GCN5募集促進(jìn)H3K18la和修復(fù)性基因表達(dá)
HAT(組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶) P300是潛在的組蛋白賴氨酸乳酸化寫(xiě)蛋白，在心肌梗死中促進(jìn)單核細(xì)胞組蛋白乳酸化的機(jī)制尚不清楚。為評(píng)估三個(gè)主要HAT家族中的代表性的P300、MOF和GCN5(一般對(duì)照非抑制性5)在心肌梗死后單核細(xì)胞組蛋白乳酸化調(diào)節(jié)中的催化活性，進(jìn)行了分子對(duì)接研究，以評(píng)估H3K18la與P300、MOF和GCN5的結(jié)合模式(圖7A至7C)。免疫沉淀法評(píng)估P300/MOF/GCN5與乳酸化組蛋白的相互結(jié)合(圖7D)。免疫熒光染色顯示H3K18la和P300/MOF/GCN5在心肌梗死后1天共定位于單核細(xì)胞的細(xì)胞核(圖7E)。
轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)男「蓴_(si)RNAs使HAT沉默(圖S11A至S11C)。P300敲低導(dǎo)致BMDMs中組蛋白乳酸化水平顯著降低，這與先前研究一致。GCN5敲低顯著抑制H3K18la水平，ChIP-qPCR和RT-qPCR顯示GCN5沉默后H3K18la修飾和H3K18la靶基因的表達(dá)水平顯著降低，證實(shí)GCN5是乳化的書(shū)寫(xiě)者并介導(dǎo)了靶基因表達(dá)的調(diào)控(圖7F至7J)。我們還評(píng)估了P300和MOF對(duì)H3K18la修飾和乳酸化基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用(圖S11D至S11I)。
先前研究報(bào)道了IL-1β特異性募集GCN5在炎癥調(diào)節(jié)中的作用。我們進(jìn)一步研究IL-1β是否是心肌梗死后驅(qū)動(dòng)乳酸化修飾的一個(gè)因素，IL-1β在心肌梗死后作為一種強(qiáng)炎性小體引發(fā)劑急劇上升。WB顯示，IL-1β刺激使BMDMs中H3K18la水平呈劑量依賴性增加(圖7K)。IL-1β刺激增加了GCN5和乳酸化組蛋白的相互結(jié)合(圖7M)，并增加了H3K18la靶基因的乳酸化和表達(dá)(圖7N和7O)。為探究IL-1β與IL-1R1的結(jié)合對(duì)于IL-1β介導(dǎo)的GCN5依賴性乳酸化是否不可或缺，我們?cè)贗L-1β刺激下阻斷了IL-1R1(圖S11J)。IL-1R1阻斷部分抑制了IL-1β對(duì)GCN5募集、H3K18la修飾、GCN5與乳酸化組蛋白結(jié)合以及H3K18la靶基因表達(dá)的促進(jìn)作用(圖7L至7O)。
圖7：IL-1β依賴性募集GCN5促進(jìn)H3K18la水平和修復(fù)性基因表達(dá)
(10) 組蛋白乳酸化有利于IR損傷后心臟修復(fù)環(huán)境
為驗(yàn)證單核細(xì)胞H3K18la促進(jìn)心臟修復(fù)的作用是否在再灌注心肌梗死中也可檢測(cè)到，我們誘導(dǎo)了一個(gè)暫時(shí)的LAD結(jié)扎模型，然后再血運(yùn)重建，以研究乳酸化在缺血再灌注(IR)損傷中的潛在作用。IR小鼠循環(huán)單核細(xì)胞的免疫印跡顯示，H3K18la水平早在IR后4小時(shí)達(dá)到峰值，此后逐漸下降，直到72小時(shí)恢復(fù)到基線水平(圖8A)。IR后單核細(xì)胞亞組中H3K18la水平的變化與總單核細(xì)胞基本一致(圖S12A和S12B)。與永恒性LAD連接MI模型類似，IR后單核細(xì)胞Lrg1、Vegf-a和IL-10結(jié)合區(qū)域的mRNA水平和H3K18la富集顯著上調(diào)(圖8B和8C)。
我們?cè)贗R后6小時(shí)進(jìn)行了H3K18la操縱的單核細(xì)胞再輸血，觀察不同處理的單核細(xì)胞的心臟定位(圖8D)。與永恒性缺血類似，相對(duì)于IR損傷后的對(duì)照組，乳酸化(La-Mo)升高的單核細(xì)胞導(dǎo)致心肌梗死面積減小(圖8E和8F)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少(圖8G)，心功能改善(圖8H和8I)。FX-Mo組正好相反(圖8E至8I)。
綜上所述，單核細(xì)胞組蛋白乳酸化在IR進(jìn)展中的免疫穩(wěn)態(tài)、組織修復(fù)和心功能改善中發(fā)揮積極作用。
圖8：組蛋白乳酸化有利于缺血再灌注(IR)損傷后心臟修復(fù)環(huán)境
結(jié)論
組蛋白乳酸化有利于心肌梗死后單核細(xì)胞的早期遠(yuǎn)程修復(fù)基因激活，從而提高了我們對(duì)心肌梗死內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的認(rèn)識(shí)。本研究中發(fā)現(xiàn)的組蛋白乳酸化相關(guān)分子可能為心肌梗死后心臟修復(fù)的改善提供新的機(jī)制基礎(chǔ)。
實(shí)驗(yàn)方法
RNAseq分析，WB，qRT-PCR和ChIP-qPCR，流式細(xì)胞術(shù)，EdU標(biāo)記，transwell，劃傷/傷口遷移和管形成試驗(yàn)，單核細(xì)胞再輸血實(shí)驗(yàn)
參考文獻(xiàn)：Wang, N., Wang, W., Wang, X., Mang, G., Chen, J., Yan, X., Tong, Z., Yang, Q., Wang, M., Chen, L., Sun, P., Yang, Y., Cui, J., Yang, M., Zhang, Y., Wang, D., Wu, J., Zhang, M., & Yu, B. (2022). Histone Lactylation Boosts Reparative Gene Activation Post-Myocardial Infarction. Circulation research, 131(11), 893–908. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.122.320488.