腹膜高脂肪環(huán)境通過激活NSUN2介導(dǎo)的ORAI2 m5C修飾促進(jìn)胃癌細(xì)胞腹膜轉(zhuǎn)移

       腹膜轉(zhuǎn)移(PM)是胃癌（GC）的重要轉(zhuǎn)移方式。它與預(yù)后不良有關(guān)。PM的潛在分子機(jī)制仍然難以捉摸。m5C是一種轉(zhuǎn)錄后RNA修飾，參與許多腫瘤的進(jìn)展。然而，其在GC腹膜轉(zhuǎn)移中的作用尚不清楚。在我們的研究中，轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明NSUN2在PM中的表達(dá)顯著上調(diào)。PM NSUN2高表達(dá)的患者預(yù)后較差。機(jī)制上，NSUN2通過m5C修飾調(diào)控ORAI2 mRNA的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)ORAI2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移和定植。YBX1通過與ORAI2 m5C修飾位點(diǎn)結(jié)合，起到“閱讀器”的作用。GC細(xì)胞攝取網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞中的脂肪酸后，轉(zhuǎn)錄因子E2F1上調(diào)，進(jìn)而通過順式元件促進(jìn)NSUN2的表達(dá)。總之，這些結(jié)果揭示了腹膜脂肪細(xì)胞為GC細(xì)胞提供脂肪酸，從而通過AMPK通路促進(jìn)E2F1和NSUN2的升高，上調(diào)的NSUN2通過m5C修飾激活關(guān)鍵基因ORAI2，從而促進(jìn)GC的腹膜轉(zhuǎn)移和定植。本文于2023年5月發(fā)表于Oncogene（IF= 8.756）上。
技術(shù)路線

結(jié)果：
1）NSUN2在GC腹膜轉(zhuǎn)移中高表達(dá)，并與GC腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)
       為了探索胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制，我們通過高通量測序分析，在10對腹膜轉(zhuǎn)移組織和相應(yīng)的原發(fā)腫瘤組織中測量mRNA表達(dá)水平(圖1A)。取TCGA中胃腺癌數(shù)據(jù)和腹膜轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的交集，得到2078個差異表達(dá)基因。然后根據(jù)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行Reactome富集分析。有趣的是，這些高表達(dá)基因在RNA代謝途徑中顯著富集(圖1B)，這表明胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的RNA表達(dá)譜與原發(fā)腫瘤有明顯不同。然后通過qPCR驗(yàn)證腹膜轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中RNA代謝途徑中差異表達(dá)最顯著的基因NOL6、NUP107、NUP160、TRMT6、NAT10和NSUN2的表達(dá)情況(圖1C)。NSUN2在20對胃癌組織及相應(yīng)腹膜轉(zhuǎn)移組織中的mRNA表達(dá)差異最為顯著(圖1D)。10對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移組織及匹配的胃癌組織的免疫組化染色也表明NSUN2在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移中高表達(dá)(圖1E)。生存分析表明，腹膜轉(zhuǎn)移中NSUN2高表達(dá)的患者預(yù)后較差(圖1F)。這些結(jié)果顯示NSUN2在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移中高表達(dá)并與不良預(yù)后相關(guān)，提示NSUN2可能在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移中起重要作用。

2）NSUN2在體外促進(jìn)GC惡性生物學(xué)行為
       為了確定NSUN2與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的關(guān)系，我們選擇了具有高轉(zhuǎn)移能力的胃癌細(xì)胞株HGC-27和MKN-45進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。集落形成、CCK8實(shí)驗(yàn)顯示，sh-NSUN2顯著降低GC細(xì)胞的增殖能力。此外，oe-NSUN2增加了GC細(xì)胞的能力(圖2A, B)。接下來，傷口愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)表明，敲低NSUN2分別抑制了GC細(xì)胞的遷移和侵襲。相反，過表達(dá)NSUN2可促進(jìn)GC細(xì)胞遷移和侵襲(圖2C-E)。下調(diào)NSUN2抑制GC細(xì)胞粘附腹膜間充質(zhì)細(xì)胞系HMrSV5的能力，當(dāng)NSUN2過表達(dá)時，GC細(xì)胞粘附腹膜間充質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增加(圖2F)。綜上所述，這些結(jié)果表明NSUN2在體外胃癌細(xì)胞的腹膜轉(zhuǎn)移和增殖中發(fā)揮了重要作用。

3）轉(zhuǎn)錄因子E2F1在GC細(xì)胞中促進(jìn)NSUN2的表達(dá)
       我們尋找可能導(dǎo)致NSUN2在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移中過表達(dá)的關(guān)鍵上游調(diào)控分子。通過篩選JASPAR數(shù)據(jù)庫，promo數(shù)據(jù)庫和腹膜轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子TFAP2B和E2F1可能參與調(diào)節(jié)NSUN2表達(dá)(圖3A)。此外，TCGA還顯示，NSUN2與E2F1和TFAP2B呈正相關(guān) (圖3B)。然后我們通過qPCR、western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子E2F1可以調(diào)控NSUN2的表達(dá)，而轉(zhuǎn)錄因子TFAP2B不能影響NSUN2的表達(dá)(圖3D、E)。從圖3F可以看出，NSUN2和E2F1主要定位于細(xì)胞核，在HGC-27和MKN-45細(xì)胞系中，沉默轉(zhuǎn)錄因子E2F1后，NSUN2的表達(dá)水平降低。這些結(jié)果驗(yàn)證了E2F1能夠調(diào)控NSUN2的表達(dá)。通過篩選JASPAR數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子E2F1在NSUN2啟動子序列中有3個結(jié)合位點(diǎn)。為了進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)錄因子E2F1是否可以直接結(jié)合NSUN2的啟動子序列，我們對JASPAR評分最高的序列(?623~?613)進(jìn)行了CHIP-qPCR驗(yàn)證。CHIP-qPCR結(jié)果驗(yàn)證了我們的假設(shè)，即轉(zhuǎn)錄因子E2F1可以通過結(jié)合預(yù)測的順式元件直接激活NSUN2的表達(dá)(圖3G)。熒光素酶測定表明，與野生型NSUN2啟動子序列相比，NSUN2啟動子序列突變體顯著抑制了轉(zhuǎn)錄活性(圖3H-I)。綜上所述，這些結(jié)果證明E2F1可以作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)NSUN2的表達(dá)。

4）腹膜高脂環(huán)境通過AMPK途徑激活轉(zhuǎn)錄因子E2F1
       為了研究腹膜脂肪細(xì)胞是否通過激活胃癌細(xì)胞AMPK通路調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子E2F1，我們從胃癌根治手術(shù)患者的網(wǎng)膜組織中提取脂肪細(xì)胞。與網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)48小時后，我們發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞系HGC-27和MKN-45的脂質(zhì)沉積和β-氧化率增加(圖4A, B)，伴隨著轉(zhuǎn)錄因子E2F1及其靶基因NSUN2升高(圖4C-E)。在共培養(yǎng)體系中加入AMPK通路抑制劑Dorsomorphin，與脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)錄因子E2F1和靶基因NSUN2的過表達(dá)得到部分減弱(圖4F)?？傊?，我們發(fā)現(xiàn)網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞為腹膜轉(zhuǎn)移性胃癌細(xì)胞提供脂肪酸，通過激活A(yù)MPK通路，進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達(dá)，從而上調(diào)NSUN2的表達(dá)。

5）NSUN2介導(dǎo)的ORAI2的m5C修飾維持了其穩(wěn)定性
       為了進(jìn)一步確定NSUN2是否通過m5C促進(jìn)GC的惡性生物學(xué)行為，將MeRIP-seq、RNA測序(RNA-seq)和HGC-27細(xì)胞中NSUN2介導(dǎo)的RNA免疫沉淀測序(RIP-seq)進(jìn)行交叉分析(圖5A、B)，選擇RNA-seq中差異表達(dá)最顯著的4個靶基因(RRBP1、ORAI2、PCNT、CSPG4)進(jìn)行進(jìn)一步研究。在這些候選基因中，當(dāng)NSUN2被敲低時，ORAI2 mRNA表達(dá)下調(diào)最為顯著，CSGP4表達(dá)略有下降，而PNCT、RRBP1 mRNA水平不受影響(圖5C)。此外，在HGC-27和MKN-45細(xì)胞中，ORAI2蛋白水平受到NSUN2的持續(xù)調(diào)節(jié)(圖5D、E)。為了進(jìn)一步研究NSUN2是否通過m5C依賴的方式促進(jìn)ORAI2的表達(dá)。通過MeRIP-qPCR進(jìn)一步驗(yàn)證NSUN2介導(dǎo)的ORAI2 m5C修飾位點(diǎn)，結(jié)果顯示，與IgG對照抗體相比，m5C特異性抗體在NSUN2敲除GC細(xì)胞上的ORAI2 mRNA富集被顯著抑制(圖5F)。接下來，為了進(jìn)一步探究NSUN2是否通過m5C修飾調(diào)控ORAI2，構(gòu)建NSUN2催化位點(diǎn)(半胱氨酸321)突變質(zhì)粒。與對照細(xì)胞相比，在過表達(dá)NSUN2的GC細(xì)胞中，ORAI2的表達(dá)水平顯著升高，而催化位點(diǎn)突變體NSUN2的細(xì)胞中表達(dá)水平則沒有升高(圖5G, H)。考慮到m5C修飾正向調(diào)節(jié)ORAI2的mRNA水平，我們進(jìn)一步研究了m5C修飾是否影響ORAI2的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，ORAI2 mRNA水平在NSUN2過表達(dá)時高度穩(wěn)定，而在NSUN2敲除時則相反(圖5I)。這些結(jié)果證實(shí)了NSUN2可以通過m5C修飾穩(wěn)定ORAI2 mRNA來調(diào)節(jié)ORAI2的表達(dá)。

6）YBX1識別ORAI2的m5C修飾并調(diào)控其mRNA穩(wěn)定性
       最近有研究報道，YBX1屬于m5C閱讀器家族，可以通過識別mRNAs的m5C修飾來調(diào)控靶基因的穩(wěn)定性。為了驗(yàn)證YBX1是否可以通過m5C修飾來調(diào)節(jié)ORAI2的穩(wěn)定性，當(dāng)YBX1被敲低時，ORAI2的表達(dá)水平下降，同時ORAI2的穩(wěn)定性下降(圖6A-C)。然后使用生物素標(biāo)記的ORAI2或m5C-ORAI2 RNA探針進(jìn)行RNA下拉，然后進(jìn)行western blot驗(yàn)證YBX1可以識別ORAI2的m5C修飾(圖6D)。EMSA實(shí)驗(yàn)得出了一致的結(jié)果(圖6E)。RIP-qPCR也證明了YBX1與ORAI2 m5C位點(diǎn)之間的直接相互作用(圖6F)。此外，YBX1過表達(dá)可以部分挽救NSUN2敲低對ORAI2表達(dá)的影響(圖6G)。研究表明，腫瘤的腹膜轉(zhuǎn)移主要是由PI3K/AKT通路的異常激活引起的。然后，在GC細(xì)胞中沉默ORAI2時，PI3K-AKT通路被抑制(圖6H)。這些數(shù)據(jù)表明，NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾通過YBX1依賴的ORAI2 mRNA穩(wěn)定性來維持ORAI2的表達(dá)。

7）NSUN2通過上調(diào)ORAI2的表達(dá)促進(jìn)GC惡性過程
       為了進(jìn)一步探討NSUN2是否通過ORAI2促進(jìn)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移，我們將過表達(dá)的ORAI2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到NSUN2敲低的細(xì)胞株HGC-27和MKN-45中。我們發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ORAI2可恢復(fù)NSUN2敲除細(xì)胞系HGC27和MKN45的增殖能力(圖7A, B)。此外，ORAI2表達(dá)升高可恢復(fù)NSUN2敲除細(xì)胞系HGC27和MKN45的遷移、侵襲和粘附腹膜間皮細(xì)胞能力(圖7C-F)。因此，我們發(fā)現(xiàn)NSUN2通過上調(diào)ORAI2的表達(dá)來加速GC惡性生物學(xué)行為。

8）NSUN2在體內(nèi)通過上調(diào)ORAI2表達(dá)促進(jìn)腹膜轉(zhuǎn)移
       為了進(jìn)一步探討NSUN2-ORAI2軸在體內(nèi)對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的影響，我們將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了靶向NSUN2 的shRNA或其陰性對照組的HGC27熒光細(xì)胞腹腔注射到BALB/c裸鼠體內(nèi)。通過體內(nèi)熒光成像，我們發(fā)現(xiàn)NSUN2敲低組的腹膜轉(zhuǎn)移程度明顯低于對照組(圖8A)。NSUN2過表達(dá)組BALB/c裸鼠腹膜轉(zhuǎn)移程度更高(圖8B)。腹膜轉(zhuǎn)移生態(tài)位切片的HE染色也顯示，胃癌細(xì)胞中NSUN2下調(diào)后，轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量顯著減少(圖8C)。這些結(jié)果表明，NSUN2在體內(nèi)促進(jìn)了胃癌腹膜轉(zhuǎn)移。我們還發(fā)現(xiàn)，ORAI2在NSUN2敲低組的腹膜轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)下調(diào)，通過免疫組化和western blot發(fā)現(xiàn)，NSUN2和ORAI2的表達(dá)呈正相關(guān)(圖8C, D)。為了進(jìn)一步探討NSUN2介導(dǎo)的ORAI2在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移中的作用，我們將四組胃癌細(xì)胞腹腔注射到BALB/c裸鼠體內(nèi)。我們發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定敲低的NSUN2細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染ORAI2過表達(dá)質(zhì)粒后，NSUN2促進(jìn)腹膜轉(zhuǎn)移的能力顯著增強(qiáng)(圖8E)。這些結(jié)果證明ORAI2是體內(nèi)NSUN2介導(dǎo)的腹膜轉(zhuǎn)移的效應(yīng)者。

結(jié)論
       我們的研究證明了高脂肪微環(huán)境通過調(diào)節(jié)NSUN2-m5C-ORAI2-PI3K-AKT信號軸在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移和定植中的重要作用。這些發(fā)現(xiàn)提示了微環(huán)境改變后腹膜轉(zhuǎn)移性胃癌細(xì)胞通過RNA表觀遺傳修飾發(fā)生適應(yīng)性改變，為胃癌腹膜轉(zhuǎn)移提供了治療靶點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)方法
       轉(zhuǎn)錄組測序，菌落形成，CCK-8，傷口愈合實(shí)驗(yàn)，transwell，WB，qRT-PCR，脂質(zhì)染色，RIP，ChIP，MeRIP，EMSA，動物實(shí)驗(yàn)。
參考文獻(xiàn)：Liu K, Xu P, Lv J, Ge H, Yan Z, Huang S, Li B, Xu H, Yang L, Xu Z, Zhang D. Peritoneal high-fat environment promotes peritoneal metastasis of gastric cancer cells through activation of NSUN2-mediated ORAI2 m5C modification. Oncogene. 2023 Jun;42(24):1980-1993. doi: 10.1038/s41388-023-02707-5.