抑制ALKBH5通過促進Ccl28 m6A修飾和增加Treg募集來減輕雄性小鼠腎損傷

       缺血再灌注損傷(IRI)是急性腎損傷(AKI)的常見原因。AKI中m6A修飾的作用尚不清楚。在這里，我們描述了ALKBH5和m6A修飾在I/R誘導(dǎo)的雄性小鼠腎損傷模型中的作用。與野生型小鼠相比，Alkbh5敲除小鼠IRI后的病理損傷較輕，腎功能較好，而Alkbh5敲入小鼠則相反。此外，在管上皮細胞中條件敲除Alkbh5可減輕I/R誘導(dǎo)的AKI和纖維化。CCL28被確定為ALKBH5的靶標(biāo)。此外，隨著Alkbh5缺乏，Ccl28 mRNA的穩(wěn)定性增加。在IRI-Alkbh5^fl/fl Ksp^Cre小鼠中，升高的CCL28水平上調(diào)了Treg募集，抑制了炎癥細胞。ALKBH5抑制劑IOX1對I/R誘導(dǎo)的AKI具有保護作用。綜上所述，抑制ALKBH5可促進Ccl28 mRNA的m6A修飾，增強其穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)Treg/炎癥細胞軸。ALKBH5和這個軸是一個潛在的AKI治療靶點。本文于2023年3月發(fā)表于Nature Communications（IF=16.6）上。
技術(shù)路線

結(jié)果
1）m6A修飾和ALKBH5參與腎臟IRI和mRTECs的缺氧和復(fù)氧(H/R)反應(yīng)
       為了研究m6A修飾是否參與腎IRI，我們檢測了從IRI小鼠腎組織中提取的RNA的m6A水平。m6A水平在IRI后12小時開始下降，但在24小時和48小時急劇上升，然后在IRI后120小時恢復(fù)到接近正常水平(圖1a)。為了確定哪些m6A修飾的調(diào)控因子在IRI中起作用，我們使用GEO數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行了單細胞測序分析，發(fā)現(xiàn)去甲基化酶Alkbh5是最顯著的改變基因(補充圖，未展示)。然后，我們測量了腎組織中幾種已知的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶相關(guān)蛋白的RNA表達水平。Alkbh5的表達在12 h時升高，在24 h和48 h時下降，IRI后120 h開始恢復(fù)(圖1b)。其他調(diào)節(jié)因子的變化如圖1b所示，其中Alkbh5的變化最為明顯。這些蛋白的Western blotting (WB)分析顯示了相同的變化，與實時定量PCR (RT-qPCR)結(jié)果一致(圖1c)。蓮藕凝集素(LTL)和ALKBH5的免疫熒光(IF)染色顯示，ALKBH5主要在RTECs中表達，并在IRI后24 h表達減少(圖1d)。H/R應(yīng)用于mRTECs。隨后，測定m6A修飾、m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶mRNA表達水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，H/R組(6 H和12 H復(fù)氧)的m6A修飾增加(圖1e)。H/R組Alkbh5、Fto、和Wtap mRNA表達下調(diào)，Mettl3和Mettl14 mRNA表達上調(diào)(圖1f)。WB分析也驗證了類似的結(jié)果(圖1g)。這些數(shù)據(jù)表明，常見的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶，尤其是ALKBH5的表達水平在腎臟IRI過程中發(fā)生了顯著變化，表明m6A修飾可能在這一過程中發(fā)揮了重要作用。

2）Alkbh5缺乏和過表達改變了I/R誘導(dǎo)的AKI和纖維化
       為了研究ALKBH5在腎IRI中的作用，我們構(gòu)建了ALKBH5敲除(KO)和ALKBH5敲入(KI)小鼠。隨后，我們對WT、KO和KI小鼠進行了45分鐘的單側(cè)腎蒂夾持或假手術(shù)(圖2a)。在IRI-KO和IRI-KI組中，m6A甲基化分別高于和低于IRI-WT組(圖2b, c)。在Sham-WT、Sham-KO和Sham-KI組中，無論是在腎功能分析(包括血清肌酐和血尿素氮(BUN))(圖2d-g)還是在病理評分分析(圖2h-k)中，都沒有顯著差異。然而，在IRI組中，KO小鼠表現(xiàn)出更好的腎功能(血清肌酐和BUN降低；圖2d, f)，輕度腎損害(圖2h-j)，腎細胞凋亡較少(圖2l)。相應(yīng)地，IRI-KI小鼠表現(xiàn)出更差的腎功能(圖2e, g)，更嚴重的腎損害(圖2k)。IRI后4周采用Sirius red和Masson染色檢測腎纖維化的嚴重程度，結(jié)果顯示IRI-KO小鼠比IRI-WT小鼠表現(xiàn)出更少的陽性染色點(圖2,n)。我們的數(shù)據(jù)顯示，Alkbh5缺乏可防止I/R誘導(dǎo)的AKI和纖維化。相反，Alkbh5過表達加重了I/R后的腎損傷。

3）RTECs中Alkbh5缺乏保護I/R誘導(dǎo)的AKI和纖維化
       為了研究RTECs中Alkbh5的缺失是否對腎IRI具有保護作用，我們將Alkbh5^fl/fl小鼠與Ksp^Cre小鼠雜交，構(gòu)建了Alkbh5-cKO小鼠。免疫熒光染色(圖3b)驗證了RTECs中Alkbh5的缺失。隨后，我們在Alkbh5^fl/fl和Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠中誘導(dǎo)IRI(圖3a)。m6A點印跡顯示，與IRI-Alkbh5^fl/fl組相比，IRI-Alkbh5^fl/flKsp^Cre組m6A甲基化進一步增加(圖3c)。假手術(shù)小鼠的血清肌酐和BUN水平在Alkbh5^fl/fl和Alkbh5^fl/flKsp^Cre之間無顯著差異(圖3d, e)，但IRI-Alkbh5^fl/flKsp^Cre組在IRI后24 h和48 h的血清肌酐和BUN水平均顯著低于IRI-Alkbh5^fl/fl組(圖3d, e)。接下來，我們在IRI后24小時收集四組腎臟組織進行病理分析。H&E和PAS染色顯示，RTECs中Alkbh5缺乏減輕了I/R后腎損傷(圖3f-h)。此外，TUNEL染色也顯示Alkbh5 cKO可以減少細胞凋亡(圖3i)。這些數(shù)據(jù)表明，RTECs中Alkbh5的缺失對I/R誘導(dǎo)的AKI具有保護作用。為了進一步確定Alkbh5缺乏在I/R 4周后慢性腎損傷中的作用，我們進行了天狼星紅和Masson染色。IRI-Alkbh5^{fl/ fl}Ksp^Cre組比IRI-Alkbh5fl/fl組表現(xiàn)出較輕的纖維化(圖3j, k)。總的來說，RTECs中Alkbh5缺乏有效地保護了I/R后的AKI和慢性纖維化。

4）Alkbh5-KO小鼠m6A修飾及基因表達變化的表征
       為了確定腎臟IRI開始時ALKBH5的直接m6A去甲基化靶點，我們在I/R后24小時使用WT和KO小鼠IRI小鼠腎臟分離的RNA進行了甲基化RNA免疫沉淀測序(MeRIP-seq)和RNA測序(RNA-seq)。根據(jù)MeRIP-seq分析，m6A修飾通常位于一致的“RGAAR”基序(R = a或G)(圖4a)。m6A峰在終止密碼子附近尤其豐富(圖4b, c)。MeRIP-seq分析發(fā)現(xiàn)KO組有1754個高甲基化峰。RNA-seq結(jié)果顯示，與WT組相比，KO組有1779個基因表達上調(diào)，1331個基因表達下調(diào)(圖4d)。使用RNA-seq和MeRIP-seq數(shù)據(jù)進行KEGG分析，揭示了與免疫和代謝相關(guān)的多種信號通路，如細胞因子-細胞因子受體相互作用、TNF信號、IL-17信號等(圖4e、f)。為了進一步評估相應(yīng)基因的mRNA表達和m6A甲基化水平，我們選擇了差異表達最多的基因(圖4g、4h)。此外，我們使用四象限散點圖對四個不同的亞群及其功能進行了深入的數(shù)據(jù)分析(圖4i)。為了找到ALKBH5最可能的直接靶基因，我們選擇了與高甲基化相關(guān)的上調(diào)或下調(diào)最多的基因，如Ccl28、Sh2d5、Ngfr和Tfr2(圖4i)。在MeRIP-seq數(shù)據(jù)中，我們發(fā)現(xiàn)KO組在Ccl28 mRNA的停止密碼子周圍有一個m6A峰，而在WT組中減少(圖4j)。Ccl28是表達倍數(shù)變化最大的顯著差異表達基因，因此我們假設(shè)Ccl28是ALKBH5的直接靶基因。

5）CCL28是ALKBH5的直接靶點
       采用RT-qPCR、WB和免疫組化(IHC)檢測IRI-Alkbh5^fl/flKsp^Cre組和IRI-Alkbh5^fl/fl組Ccl28的表達水平。結(jié)果顯示，在Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠中，CCL28的mRNA和蛋白比IRI-Alkbh5^fl/fl小鼠更豐富(圖5a-c)。ELISA法也觀察到血清中CCL28的類似變化(圖5d)。然后用抗m6A抗體或IgG抗體進行MeRIP檢測。與IgG抗體相比，抗m6A抗體的免疫沉淀導(dǎo)致Ccl28 mRNA水平高度富集(圖5e)。這些結(jié)果表明m6A修飾參與了ALKBH5對Ccl28 mRNA的調(diào)控。為了確定ALKBH5和Ccl28 mRNA是否存在直接相互作用，我們使用腺病毒標(biāo)記的ALKBH5載體(Ad-ALKBH5)進行了RNA-IP。與IgG抗體相比，抗Flag抗體組的免疫沉淀顯示Ccl28 mRNA水平更高(圖5f)。ALKBH5過表達會降低pGL3-CDS的熒光素酶活性，但不會降低pGL3-5'UTR或pGL3-3'UTR的熒光素酶活性(圖5g)。ALKBH5過表達降低pGL3-CCL28-WT和pGL3-CCL28-Mut1,2,3,的熒光素酶活性，但不影響pGL3-CCL28-Mut4(圖5h)。這表明Ccl28 mRNA上潛在的m6A位點(Mut4)是Alkbh5介導(dǎo)的去甲基化位點。
       先前的研究報道了ALKBH5通過m6A去甲基化破壞了mRNA的穩(wěn)定性，因此我們假設(shè)ALKBH5缺乏穩(wěn)定了Ccl28 mRNA。在通過actinomycin D抑制RNA聚合酶后的0、2、4和6小時檢測mRTECs中Ccl28 mRNA的水平。RT-qPCR結(jié)果顯示，敲低ALKBH5后，Ccl28的半衰期延長，表明ALKBH5的降低穩(wěn)定了Ccl28 mRNA(圖5i)。IGF2BPs是m6A讀取器，具有增強mRNA穩(wěn)定性的作用。因此，我們檢測IGF2BPs (IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3)是否參與Ccl28 mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控。當(dāng)IGF2BP2被敲除時，Ccl28 mRNA的表達明顯抑制。但IGF2BP1或IGF2BP3的敲低作用有限(圖5j)。WB分析還表明，IGF2BP2敲低抑制CCL28蛋白豐度(圖5k)。使用抗IGF2BP2抗體的RNA免疫沉淀(RIP)分析進一步證實了H/R mRTECs中IGF2BP2和Ccl28 mRNA之間的相互作用(圖51)。RNA穩(wěn)定性分析顯示，IGF2BP2敲低逆轉(zhuǎn)了ALKBH5敲低對Ccl28 mRNA的穩(wěn)定性增強作用(圖5m)。因此，我們確定IGF2BP2是調(diào)控Ccl28mRNA穩(wěn)定性的閱讀蛋白。

6）Alkbh5缺乏增加了CCL28介導(dǎo)的Treg募集
       為了確定CCL28在AKI中的功能，我們檢測了IRI后不同時間點腎組織中CCL28的表達水平。結(jié)果顯示，Ccl28在IRI后表達增加，并在120 h達到峰值(圖6a)。接著，我們檢測了IRI后不同時間點腎臟組織中Tregs的浸潤情況。Treg的數(shù)量變化與Ccl28的表達一致(圖6b-d)。隨著Alkbh5的降低，Ccl28和Tregs的水平升高(圖6e)。我們假設(shè)Treg的募集參與了Alkbh5缺乏和CCL28上調(diào)在IRI中誘導(dǎo)保護作用的機制。我們比較了不同組在IRI后24 h腎組織中Tregs的百分比。IRI-Alkbh5^fl/flKsp^Cre組Tregs的浸潤量明顯高于IRI-Alkbh5^fl/fl組(圖6f、g)。為了進一步探索CCL28是否確實是募集Treg的關(guān)鍵因素，我們給不同組的小鼠注射了抗CCL28抗體(圖6h)。在抗CCL28抗體治療后，IRI后Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠的Tregs百分比與未治療的Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠相比顯著降低(圖6i, j)。然后，我們使用體外transwell實驗測試了對新分離的小鼠外周血單個核細胞(PBMCs)的趨化活性。在H/R + Ad-sh-ALKBH5組中，CCL28水平顯著升高，而在H/R + Ad-sh-ALKBH5+抗CCL28組中，CCL28水平被抗CCL28抗體逆轉(zhuǎn)(圖6k)。我們觀察到，H/R+Ad-sh-ALKBH5組CD4+細胞中Foxp3+CD4+細胞的百分比增加，CCL28抗體給藥后Foxp3+CD4+細胞的百分比顯著下降(圖61,m)。

7）在I/R誘導(dǎo)的AKI中，CCL28/Treg/炎癥細胞軸參與了Alkbh5缺乏治療效果的機制
       先前的一項研究報道，Tregs抑制腎IRI中的中性粒細胞、巨噬細胞和先天免疫系統(tǒng)。我們結(jié)果表明，與Alkbh5^fl/fl小鼠相比，Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠IRI腎組織中Ly6G⁺中性粒細胞和F4/80⁺巨噬細胞較少(圖7a)。為了證明CCL28/Treg/炎癥細胞軸的功能，我們將CCL28和CD25抗體分別給予Alkbh5^fl/flKsp^Cre或Alkbh5^fl/fl小鼠。針對Ly6G和F4/80的免疫組化染色顯示，與未給藥CCL28或CD25抗體的小鼠相比，給藥CCL28或CD25抗體顯著增加了Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠的中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)量(圖7a)。腎功能和病理分析顯示，CCL28或CD25抗體治療逆轉(zhuǎn)了Alkbh5缺乏的保護作用(圖7b-e)。綜上所述，CCL28和Treg阻斷有效抑制了Alkbh5基因敲除的保護作用。CCL28/Treg/炎癥細胞軸是ALKBH5在IRI中的直接下游靶點。

8）ALKBH5抑制劑IOX1和重組小鼠CCL28在IRI中發(fā)揮保護作用
       先前的研究發(fā)現(xiàn)IOX1是ALKBH5的抑制劑。我們在IRI模型中測試了IOX1和CCL28的作用(圖8a)。IOX1有效地增加了m6A甲基化，但在Ccl28治療的IRI組中沒有觀察到顯著差異(圖8b)。IOX1或CCL28處理可降低I/R后血清肌酐和BUN濃度(圖8c、d)。H&E染色數(shù)據(jù)表明，IOX1或CCL28處理可減輕I/R誘導(dǎo)的腎損傷(圖8e、f)。接下來，我們檢測腎組織中Treg、中性粒細胞和巨噬細胞的百分比。在IOX1和CCL28治療組中發(fā)現(xiàn)Treg募集增加(圖8g, h)。相應(yīng)地，與未治療的IRI小鼠相比，IOX1或CCL28治療組中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)量減少(圖8i)。

結(jié)論
       我們的研究表明，Alkbh5缺乏通過增加CCL28 mRNA m6A甲基化來上調(diào)CCL28的水平，從而增加CCL28 mRNA的穩(wěn)定性。通過增加CCL28水平募集Treg，保護腎臟免受炎癥細胞浸潤的抑制。我們的工作將豐富目前對AKI中m6A甲基化和ALKBH5分子機制知之甚少的知識。我們還發(fā)現(xiàn)了ALKBH5/CCL28/Treg軸在I/R誘導(dǎo)的AKI中的調(diào)控作用?？偟膩碚f，我們的發(fā)現(xiàn)有望為治療I/R誘導(dǎo)的AKI提供一種潛在的策略。

實驗方法
腺病毒(Ad)轉(zhuǎn)導(dǎo)，小鼠腎IRI模型構(gòu)建，Masson’s trichrome染色，Sirius Red染色，RT-qPCR，Western blot，PAS染色，HE染色，免疫組化，免疫熒光，流式，ELISA，m6A點印記，Transwell，雙熒光素酶報告實驗，MeRIP，RIP，MeRIP-seq，RNA-seq。
參考文獻
Chen J, Xu C, Yang K, Gao R, Cao Y, Liang L, Chen S, Xu S, Rong R, Wang J, Zhu T. Inhibition of ALKBH5 attenuates I/R-induced renal injury in male mice by promoting Ccl28 m6A modification and increasing Treg recruitment. Nat Commun. 2023 Mar 1;14(1):1161. doi: 10.1038/s41467-023-36747-y.