凝血酶誘導(dǎo)腦缺血/再灌注過程中ACSL4依賴性鐵死亡

       缺血性中風(fēng)對老年人是一個重大危險。干預(yù)措施只能用于清除血栓，缺血性中風(fēng)期間神經(jīng)元死亡的機制仍存在爭議。鐵死亡是各種器官缺血后細胞死亡的一種機制。我們報道了絲氨酸蛋白酶，凝血酶，通過促進花生四烯酸的動員和隨后的鐵性基因，acyl-CoA合成酶長鏈家族成員4 (ACSL4)的酯化來激發(fā)鐵性信號傳遞。一種無偏多組學(xué)方法確定了凝血酶和ACSL4基因/蛋白質(zhì)，以及它們的前鐵毒phosphatidyl ethanolamine脂質(zhì)產(chǎn)物，在嚙齒動物大腦中動脈閉塞時顯著改變。在基因或藥理學(xué)上抑制該途徑中的多個點，可減弱體外和體內(nèi)缺血模型的結(jié)果。因此，凝血酶-ACSL4軸可能是改善缺血性腦卒中鐵性神經(jīng)元損傷的關(guān)鍵治療靶點。本文于2022年2月發(fā)表于Signal Transduction and Targeted Therapy (IF= 39.3)。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
(1) 急性腦I/R后凝血酶上調(diào)
       由鐵死亡引起的細胞死亡是由于有毒的脂質(zhì)氫過氧化物積累超過細胞解毒的能力。含有phosphatidyl ethanolamine(PEs)的花生四烯酸(AA)特別容易發(fā)生鐵中毒過氧化反應(yīng)。通過對小鼠缺血性中風(fēng)后海馬組織進行高質(zhì)量的非靶向代謝組學(xué)分析(圖1a)，我們發(fā)現(xiàn)了四種磷脂顯著降低，即PC(36:4)、PE(42:8)、PE (38: 6p)和PE(40:7)(圖1b-h)。進一步分析其脂肪酸側(cè)鏈，發(fā)現(xiàn)PC(36:4, 16:0/20:4)、PE(42:8, 22:4/20:4)、PE (38:6p, 18:2p/20:4)脂肪酸側(cè)鏈中均含有AA(圖1i)，且AA(20:4)占主導(dǎo)地位(圖1j)，這與小鼠缺血性腦卒中后海馬組織游離AA顯著增加(腦卒中/對照比=1.49, p=0.0007，圖1k)一致。
       為了探索缺血性卒中后AA升高的蛋白，我們對同一組織進行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析(圖2a-c)。基于差異表達蛋白的富集，血小板激活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和聚集是上調(diào)最多的通路(圖2d, e)。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析也一致指出了相同的途徑(圖2f)，凝血酶原(F2基因編碼凝血酶原，也稱為凝血因子II)，凝血酶酶原是上調(diào)最多的蛋白質(zhì)(圖2g)，western blotting進一步證實了這一點(圖2h)。

圖1：在缺血/再灌注后，磷脂側(cè)鏈上的花生四烯酸被釋放

圖2：急性腦缺血/再灌注后凝血酶上調(diào)

(2) 凝血酶誘導(dǎo)鐵死亡獨立于鐵積累
       凝血酶是缺血性中風(fēng)的主要藥物靶點之一，其作用是促進纖維蛋白的產(chǎn)生和凝血。凝血酶可誘導(dǎo)細胞凋亡。我們發(fā)現(xiàn)凝血酶劑量依賴性誘導(dǎo)N27神經(jīng)元細胞死亡(圖3a)，并伴有AA升高(圖3b)和脂質(zhì)氫過氧化物升高(圖3c, d)，線粒體變小，膜密度增加(圖3e)，這些特征都與鐵死亡一致。凝血酶不影響細胞內(nèi)亞鐵的水平，這不是誘導(dǎo)鐵死亡的必要條件(圖3f)。更重要的是，凝血酶誘導(dǎo)的細胞死亡可以通過鐵死亡抑制劑liproxstatin-1(圖3g)和谷胱甘肽前體N-acetyl-L-cysteine (圖3h)和cPLA2α抑制劑darapladib(圖3i)的治療來阻止。liproxstatin-1同樣可以防止MDA-MB-231細胞(一種人類乳腺癌細胞系)的細胞死亡，這表明了凝血酶在腦外鐵死亡中的作用(圖3j, k)。
       凝血酶作為一種絲氨酸蛋白酶，自發(fā)地激活cPLA2α，它在甘油磷脂的sn-2位置切割A(yù)A,導(dǎo)致AA從膜上釋放。我們的數(shù)據(jù)表明，凝血酶升高是缺血性中風(fēng)后AA動員的上游信號，這會導(dǎo)致鐵死亡。我們發(fā)現(xiàn)達比加群在N27神經(jīng)元培養(yǎng)的I/R氧-葡萄糖剝奪(OGD)模型中保護細胞，神經(jīng)癥狀緩解和減少腦梗死體積(補充圖未展示)。由于OGD和MCAO模型都不涉及可能與凝血酶抑制有關(guān)的血栓形成，這些發(fā)現(xiàn)表明凝血酶誘導(dǎo)的另一種損傷被達比加群阻斷。這些數(shù)據(jù)強調(diào)了凝血酶誘導(dǎo)鐵死亡的可能性，這可能與缺血性中風(fēng)有關(guān)。

圖3：凝血酶誘導(dǎo)神經(jīng)元鐵死亡

(3)氧依賴性鐵死亡發(fā)生在腦I/R損傷
       為了證實缺血性中風(fēng)中鐵死亡的發(fā)生，我們調(diào)整了MCAO/R的條件，并研究了其生化和行為變化。小鼠和大鼠在MCAO/R后(再灌注后24小時)，與對側(cè)“對照”半球相比，同側(cè)“卒中”半球受影響的海馬和皮層區(qū)域的脂質(zhì)過氧化物(LPO)和丙二醛(MDA)(脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物)水平顯著升高(小鼠：圖4a, b；大鼠：補充圖未展示)。透射電鏡(TEM)圖像顯示，MCAO/R后24 h同側(cè)皮層區(qū)域的這些特征伴有神經(jīng)元線粒體收縮，鐵脫鐵特征(補充圖未展示)。
       在MCAO/R后立即給藥的亞毒性劑量RSL3 (GPx4抑制劑)和erastin (Xc^?抑制劑) 增強鐵性傾向，顯著加重小鼠腦I/R損傷，表現(xiàn)為MDA水平顯著升高(圖4c)，神經(jīng)行為缺陷(圖4d)，梗死體積增加(MCAO/R后24小時；圖4e)。脂基捕獲劑和原型鐵死亡抑制劑liproxstatin-1和ferrostatin-1可有效減弱MCAO小鼠模型中的腦I/R損傷。然而，這些抑制劑不能挽救MCAO(即無再灌注)造成的神經(jīng)元損傷(圖4f, g)，因為鐵死亡依賴于氧氣，進一步表明鐵死亡可能發(fā)生在再灌注階段。
       我們在I/R的氧葡萄糖剝奪(OGD)細胞培養(yǎng)模型中證實了神經(jīng)元鐵死亡的發(fā)生。N27神經(jīng)元細胞經(jīng)OGD處理2小時(圖4h)死亡前，細胞內(nèi)Fe²⁺水平升高(圖4i)，脂質(zhì)過氧化物(圖4j, k)，脂質(zhì)氫過氧化物，以及細胞內(nèi)總ROS和MDA(補充圖未展示)。與對照細胞相比，OGD處理的N27細胞中的線粒體也顯著變小，但膜密度增加(補充圖未展示)。Liproxstatin-1治療挽救了OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡(圖1l)，顯示了鐵死亡的參與。

圖4：腦再灌注損傷的氧依賴性鐵死亡

(4) 缺血性中風(fēng)后血小板活化
       凝血功能的激活是缺血性腦卒中神經(jīng)元損傷的主要原因。抑制凝血酶有可能預(yù)防和治療腦梗死，并降低腦卒中后殘余神經(jīng)功能缺損的程度。凝血酶抑制劑的臨床試驗是基于其抗凝血作用進行的。然而，我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元中的凝血酶也可以通過其絲氨酸蛋白酶活性引發(fā)鐵死亡。這種凝血酶升高的來源值得研究。為了研究缺血性腦卒中期間凝血系統(tǒng)的變化，我們收集了59份血清樣本，包括27例健康對照組和32例缺血性腦卒中患者，在去除血清中高豐度蛋白后，進行TMT標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)分析(圖5a-e)。84.7%的樣本相關(guān)值大于0.98，相關(guān)值范圍在0.968-0.993之間(圖5a)，表明結(jié)果具有可重復(fù)性。在分析中，我們總共鑒定出584個蛋白質(zhì)，其中424個蛋白質(zhì)可以得到≥2個多肽的支持，平均數(shù)量為8.31個(圖5c)。評估了不同樣本中蛋白質(zhì)的分布，我們發(fā)現(xiàn)超過50%的樣本中有362種蛋白質(zhì)被定量(圖5d)?；诎?62個蛋白質(zhì)的隨機森林估算數(shù)據(jù)的tSNE分析驗證了不存在批效應(yīng)(圖5e)。
       我們在缺血性卒中血清中共鑒定出28個蛋白上調(diào)，21個蛋白下調(diào)(圖5f)。其中，缺血性腦卒中患者血清中纖維蛋白凝塊形成明顯上調(diào)(圖5g-k)，這與小鼠大腦中血小板聚集增加一致(圖2f)。然而，與健康對照組相比，血清中凝血酶水平?jīng)]有明顯升高(圖5l)，這表明我們在大腦中觀察到的升高(圖2h)可能不是來自血液。因此，如果達比加群具有缺血性卒中后的神經(jīng)保護作用(補充圖未展示)，其有益作用不太可能來自于其在血液中的抑制凝血活性。相反，缺血性中風(fēng)患者血液中凝血酶沒有升高，這表明抗凝血酶藥物的任何益處都可能是由于大腦中凝血酶的升高(圖2h)。考慮到凝血酶在調(diào)動強鐵脂肪酸AA方面的額外作用，我們假設(shè)凝血酶可能會誘導(dǎo)缺血性中風(fēng)后的鐵死亡。

圖5：缺血性中風(fēng)后血小板活化

(5) ACSL4介導(dǎo)凝血酶神經(jīng)毒性
       Acyl-CoA合成酶長鏈家族成員4 (ACSL4)是一種重要的脂質(zhì)代謝酶，通過將游離AA轉(zhuǎn)化為花生四烯醛-CoA生成脂質(zhì)氫過氧化物來參與鐵死亡。與游離AA通過促進其泛素化和蛋白酶體降解抑制ACSL4水平一致，凝血酶處理后N27細胞中的ACSL4降低(圖6a)，而不影響ACSL4 mRNA的表達(補充圖未展示)。I/R后6 h，缺血區(qū)海馬區(qū)ACSL4蛋白表達明顯下降，而ACSL4 mRNA表達在同一時間點無明顯變化(補充圖未展示)。由于缺血性卒中后小鼠海馬區(qū)游離AA顯著增加(圖1k)，這些數(shù)據(jù)進一步表明，在I/R過程中ACSL4的降低可能是翻譯后修飾的結(jié)果。通過western blot(圖6b)或組織學(xué)(圖6c)檢測，我們還發(fā)現(xiàn)MCAO/R后大鼠同側(cè)海馬ACSL4的表達隨著時間的推移相似地下降。在i/R后3小時，ACLS4明顯減少，這是在i/R后6小時開始海馬神經(jīng)元損失之前(圖6d, e)。大鼠的結(jié)果與MCAO后小鼠的結(jié)果一致(補充圖未展示)。然而，凝血酶在缺血早期明顯升高(圖6f)。這些數(shù)據(jù)表明，ACSL4下調(diào)是腦I/R的早期事件，獨立于神經(jīng)元死亡而發(fā)生，這可能是對凝血酶誘導(dǎo)應(yīng)激的保護性反應(yīng)。
       為了闡明凝血酶細胞毒性是否由ACSL4介導(dǎo)，我們使用基于CRISPR-Cas9的基因編輯生成了ACSL4敲除(KO) N27細胞，使用含有ACSL4表達框的慢病毒載體pLenti-OE-rACSL4生成了ACSL4過表達(OE)細胞。western blotting證實了這兩種調(diào)制(圖6g，上圖)。我們發(fā)現(xiàn)凝血酶依賴于ACSL4引起毒性，因為凝血酶的細胞毒性因ACSL4的還原而恢復(fù)，并因ACSL4的過表達而加重(圖6g)。ACSL4抑制劑吡格列酮(PIO)也能阻斷凝血酶的細胞毒性(補充圖未展示)。這些結(jié)果表明，凝血酶可能通過促進ACSL4依賴的鐵死亡而導(dǎo)致神經(jīng)元細胞死亡，而ACSL4的降低可能有助于抑制凝血酶引起的鐵死亡損傷。

圖6：凝血酶誘導(dǎo)急性腦缺血/再灌注后ACSL4下調(diào)

(6) 調(diào)節(jié)ACSL4表達改變急性缺血性腦損傷的結(jié)局
       為了確定ACSL4是否影響腦I/R后的預(yù)后，我們通過單次注射腺相關(guān)病毒載體，即AAV8-mACSL4(過表達，OE)和AAV8-EF-Cas9+AAV8-mACSL4-sp.g3(敲除，KO)，在小鼠左海馬CA3區(qū)域(小鼠對MCAO/R最脆弱的區(qū)域)選擇性過表達或敲除Acsl4，并檢查了MCAO嚙齒動物模型的影響(圖7a)。以AAV8-EGFP(綠色熒光蛋白增強型AAV8)為對照。免疫熒光染色證實了轉(zhuǎn)導(dǎo)的有效性(圖7b)。與EGFP小鼠相比，再灌注后5天，在相同的30分鐘MCAO/R條件下，ACSL4 OE小鼠表現(xiàn)出明顯的梗死體積增加(灌注后24小時，圖7c)，神經(jīng)評分惡化(圖7d)，旋轉(zhuǎn)運動性能變差(圖7e)。相比之下，與EGFP小鼠相比，ACSL4 KO小鼠對I/R損傷有保護作用，梗死體積減小(圖7f)，神經(jīng)評分(圖7g)和運動協(xié)調(diào)性(圖7h)也有顯著改善。與鐵死亡抑制劑一致，ACSL4 KO小鼠MCAO后神經(jīng)元損傷與對照小鼠無差異(圖7i, j)，這強烈提示在該模型中，鐵死亡發(fā)生在再灌注期間。
       這些在小鼠中的結(jié)果在大鼠中得到了復(fù)制，因為實驗性中風(fēng)研究的一個主要問題是動物模型的可重復(fù)性。激光散斑信號顯示敲除ACSL4對MCAO/R后大鼠皮層血流無影響(圖7k, l)，證實ACSL4 KO不是單純通過影響血流動力學(xué)而起到保護作用。AAV輔助ACSL4敲除大鼠皮層對I/R誘導(dǎo)的功能損傷具有顯著保護作用(神經(jīng)評分；圖7m)和腦梗死體積(TTC染色；圖7 n)。
       我們發(fā)現(xiàn)ACSL4 KO細胞對RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡有保護作用，而ACSL4 OE細胞對同樣的毒素脆弱(補充圖未展示)。然后我們將這些細胞進行OGD/再氧化，發(fā)現(xiàn)ACSL4 KO細胞對OGD相關(guān)毒性具有抗性，而ACSL4 OE細胞更容易受到OGD相關(guān)毒性的影響(補充圖未展示)。使用triacsin C或PIO對ACSL4進行藥物抑制，可預(yù)防I/R損傷，神經(jīng)評分顯著改善和灌注后24小時梗死體積減少證明了這一點(補充圖未展示)。在正常的N27細胞中，PIO也被發(fā)現(xiàn)能在體外預(yù)防OGD，但對ACSL4 KO細胞(補充圖未展示)沒有作用。

圖7：調(diào)節(jié)ACSL4表達改變急性缺血性腦損傷的結(jié)局

結(jié)論
       抗凝血酶療法可能通過抑制鐵死亡而對中風(fēng)再灌注后有益，也可能對涉及鐵死亡的其他疾病有用。

圖8：原理的假設(shè)

實驗方法
細胞活力測定，局灶性腦缺血模型，旋轉(zhuǎn)跑步機試驗，梗死體積分析，小鼠花生四烯酸的檢測，細胞死亡測量，免疫熒光，蛋白質(zhì)組學(xué)LC-MS/MS分析，脂質(zhì)組學(xué)LC-MS/MS分析，脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)搜索
參考文獻
Tuo, Q. Z., Liu, Y., Xiang, Z., Yan, H. F., Zou, T., Shu, Y., Ding, X. L., Zou, J. J., Xu, S., Tang, F., Gong, Y. Q., Li, X. L., Guo, Y. J., Zheng, Z. Y., Deng, A. P., Yang, Z. Z., Li, W. J., Zhang, S. T., Ayton, S., Bush, A. I., … Lei, P. (2022). Thrombin induces ACSL4-dependent ferroptosis during cerebral ischemia/reperfusion. Signal transduction and targeted therapy, 7(1), 59. https://doi.org/10.1038/s41392-022-00917-z.

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