單細(xì)胞和空間測序確定角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞放大銀屑病炎癥反應(yīng)的過程
銀屑病是一種常見的皮膚慢性炎癥性疾病，其免疫發(fā)病機制尚不完全清楚。在這里，我們使用單細(xì)胞和空間RNA測序相結(jié)合的方法，證明了在沒有中性粒細(xì)胞蛋白酶的情況下，IL-36依賴性放大了IL-17A和TNF炎癥反應(yīng)，這主要發(fā)生在銀屑病表皮的角質(zhì)層上部。我們進一步展示了在銀屑病中，SFRP2+成纖維細(xì)胞的一個亞群通過轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺谞顟B(tài)而促進免疫網(wǎng)絡(luò)的放大。SFRP2+成纖維細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)涉及CCL13、CCL19和CXCL12的產(chǎn)生，通過配體-受體相互作用與其他空間上鄰近的細(xì)胞類型連接：CCR2+髓系細(xì)胞、CCR7+LAMP3+樹突狀細(xì)胞和CXCR4分別在CD8+Tc17細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞上表達(dá)。SFRP2+成纖維細(xì)胞也表達(dá)組織蛋白酶S，通過激活角質(zhì)形成細(xì)胞中的IL-36G進一步放大炎癥反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)提供了對銀屑病發(fā)病機制的深入看法，這擴大了我們對關(guān)鍵細(xì)胞參與者的理解，包括炎性成纖維細(xì)胞及其細(xì)胞相互作用。
該研究于2023年6月發(fā)表在《Nature communications》，IF：16.6。
技術(shù)路線
1、對正常人和銀屑病患者皮膚單細(xì)胞的普查顯示了皮膚細(xì)胞群體的多樣性
為了了解健康和銀屑病人皮膚的無偏細(xì)胞組成和細(xì)胞狀態(tài)，我們從8個健康人和14個銀屑病活檢標(biāo)本中分離了皮膚細(xì)胞的單細(xì)胞懸液。我們還收集了來自同一批銀屑病患者的11個活檢標(biāo)本中損傷周圍的皮膚細(xì)胞，總共得到了33個10X Chromium單細(xì)胞文庫（8個健康皮膚文庫（NS），11個銀屑病病變周圍皮膚文庫（PN）和14個銀屑病病變皮膚文庫（PP））。經(jīng)過質(zhì)量控制的銀屑病單細(xì)胞圖譜包括67,378個細(xì)胞，每個細(xì)胞檢測到的平均基因數(shù)為2421個，轉(zhuǎn)錄本數(shù)為10,953個（圖1a、b）。為了研究這些細(xì)胞的異質(zhì)性，我們挑選可變基因，并使用統(tǒng)一的流形逼近和投影（UMAP）進行降維和R軟件包Seurat進行細(xì)胞聚類。通過將聚類標(biāo)記基因與經(jīng)典細(xì)胞類型定義的特征基因重疊，對聚類進行了驗證。我們鑒定出了10個主要的細(xì)胞類型，包括角質(zhì)形成細(xì)胞（KC；KRT14、KRT1、DMKN）、黑素細(xì)胞（MLNC；DCT、TYRP1、PMEL）、汗腺細(xì)胞（ECG；PIP、DCD、MUCL1）、內(nèi)皮細(xì)胞（EC；PECAM1、CDH5、CLDN5）、成纖維細(xì)胞（FB；DCN、COL1A1、COL1A2）、平滑肌細(xì)胞（SMC；ACTA2、TAGLN、MYL9）、神經(jīng)細(xì)胞（Nerve；MPZ、PLP1、S100B）、T細(xì)胞（TC；CD3D、CD3E、TRAC）、髓系細(xì)胞（ML；CD74、HLADRA、HLA-DPB1）和肥大細(xì)胞（Mast；CPA3、TPSAB1、CTSG）（圖1c）。
在UMAP中，PP角質(zhì)形成細(xì)胞與NS和PN角質(zhì)形成細(xì)胞完全分離，這表明銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄組發(fā)生了根本性的改變（圖1b）。在獲得的細(xì)胞數(shù)量方面，最豐富的細(xì)胞類型是角質(zhì)形成細(xì)胞，其次是成纖維細(xì)胞和T細(xì)胞。對每種細(xì)胞類型的疾病組成分析顯示，PP中免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的比例增加，而汗腺細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和黑素細(xì)胞的比例減少。這些結(jié)果表明，銀屑病特征包括明顯的角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組變化和免疫細(xì)胞（包括T細(xì)胞和髓系細(xì)胞）的積累。
為了定位銀屑病皮膚中的各種細(xì)胞類型，我們對銀屑病皮膚進行了空間測序。我們從一個20微米厚的冰凍切片上收集RNA，并將其放置在一個含有空間條形碼捕獲寡核苷酸的55微米孔陣列上，用于轉(zhuǎn)錄組分析。在經(jīng)過質(zhì)量控制步驟后，我們檢測到987個空間定義的區(qū)域，每個區(qū)域平均檢測到2782個基因和11,779個轉(zhuǎn)錄本（圖1d）。我們通過將空間基因表達(dá)與單細(xì)胞RNA測序中主要細(xì)胞類型的基因表達(dá)進行反卷積，為每個區(qū)域標(biāo)注了細(xì)胞類型組成。反卷積結(jié)果顯示在散點餅圖中，每個空間陣列中含有一個餅圖。K-means聚類顯示出六個具有不同平均細(xì)胞類型組成的聚類，代表了角質(zhì)形成細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、汗腺細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、髓系細(xì)胞和T細(xì)胞的聚集體（圖1d）?？臻g測序中每個聚類的標(biāo)記基因與通過單細(xì)胞RNA測序確定的細(xì)胞類型標(biāo)記基因一致，表明注釋準(zhǔn)確（圖1e）。角質(zhì)形成細(xì)胞位于表皮中。髓系細(xì)胞、T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞位于靠近表皮的淺表真皮，而成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和汗腺細(xì)胞位于更深層的真皮（圖1d）。我們還觀察到一些空白區(qū)域，其中捕獲到的mRNA數(shù)量較少，代表真皮內(nèi)無細(xì)胞區(qū)域。同時，我們對另外三個銀屑病和兩個健康皮膚活檢標(biāo)本進行了空間測序，觀察到類似的細(xì)胞類型和空間細(xì)胞聚集。
2、銀屑病皮膚中不同的角質(zhì)形成細(xì)胞分化狀態(tài)反映了銀屑病中不同的細(xì)胞因子反應(yīng)
PP與NS和PN角質(zhì)形成細(xì)胞的明顯分離表明在患有銀屑病的皮膚中存在重大的表皮功能變化（圖1b）。為了進一步描述這一點，我們對角質(zhì)形成細(xì)胞進行了亞群聚類，并通過分化狀態(tài)對其進行了注釋。我們的分析在基底層（COL17A1、DST、KRT15）、棘層（KRT6A、KRT6B、KRT16）和表棘層（SLURP1、KLK7、KRT2）定義了三個不同的角質(zhì)形成細(xì)胞分化狀態(tài)（圖2a-c）。我們對每個表皮分化狀態(tài)內(nèi)的PP和NS角質(zhì)形成細(xì)胞進行差異表達(dá)分析，并確定了在銀屑病皮膚的表棘層中不同表達(dá)的基因（DEGs）數(shù)量最多。我們繪制了每個分化狀態(tài)的前15個上調(diào)和下調(diào)基因，并發(fā)現(xiàn)PN角質(zhì)形成細(xì)胞在所有三個表皮層中表現(xiàn)出介于NS和PP角質(zhì)形成細(xì)胞之間的中間表達(dá)模式（圖2d）。S100A7、S100A8和S100A9在PP的所有三層中明顯過表達(dá)，與之前的銀屑病研究結(jié)果一致。有趣的是，I型干擾素誘導(dǎo)的基因IFITM3、IFI27和IFI6在PP上調(diào)基因中排名靠前，主要定位于銀屑病皮膚的基底表皮層。KRT6基因和KRT16在棘層和表棘層中排名靠前。值得注意的是，C1orf68，在以前的基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）中被確定為銀屑病的靶基因，特異地在表棘層中表達(dá)（圖2d）。
接下來，我們使用Ingenuity通路分析（IPA）評估了每個表皮層內(nèi)差異表達(dá)基因（DEGs）的富集通路和上游調(diào)控因子的細(xì)胞因子。這表明在銀屑病皮膚中，干擾素信號通路在基底層和棘層中是最重要的調(diào)控因子，而在表棘層中的作用較小。IL-17通路主要富集在表棘層中，而在棘層和基底層中富集較少。銀屑病皮膚中其他上游炎癥反應(yīng)的富集包括OSM、TNF、IL-36、IL-6、IL-1、IL-18、IL-21、IL-22和IL-27。
為了追蹤這些細(xì)胞因子的來源，我們計算了每種細(xì)胞類型在不同疾病狀態(tài)（NS、PN、PP）下這些基因的平均表達(dá)水平。這些炎癥介質(zhì)的大多數(shù)由特定的細(xì)胞類型表達(dá)，例如，角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)IL18和IL36G；T細(xì)胞表達(dá)IL17A、TNF、IL21和IL22；髓系細(xì)胞表達(dá)IFNB1、IL1A、IL1B和IL27。值得注意的是，與PN和NS相比，IL36G、IL17A、IL21、IL22和IL27在相應(yīng)的細(xì)胞類型中在PP中的表達(dá)最高。為了驗證這些關(guān)鍵上游調(diào)控因子，我們計算了通過單個促炎細(xì)胞因子（包括I型干擾素（IFN-α）、IL-17A、IL-36γ和TNF）刺激培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞中誘導(dǎo)基因的模塊得分（圖2e）。與DEGs的富集分析一致，IFN-α得分在所有三個層次中從NS逐漸增加到PN再到PP，在基底層得分最高，棘層略有下降，表棘層進一步下降。IL-17A得分在NS和PN中在所有三個層次上相似，但在PP角質(zhì)形成細(xì)胞中從基底層到棘層再到表棘層有顯著增加。類似地，在PP表皮中，IL-36γ得分在表棘層中比基底層和棘層更高。為了驗證這些反應(yīng)的空間特異性，我們計算了角質(zhì)形成細(xì)胞亞型模塊得分以及IL-17A和IL-36γ模塊得分。與scRNA-seq結(jié)果一致，IL-17A和IL-36γ模塊得分與表棘層模塊得分最高相關(guān)，而與棘層或基底層模塊得分的相關(guān)性較低。這些結(jié)果表明，在銀屑病中，不同的表皮組織受促炎細(xì)胞因子的影響程度不同。
為了研究IL-36在激活I(lǐng)L-17和TNF反應(yīng)中的作用，我們使用CRISPR-Cas9在角質(zhì)形成細(xì)胞中敲除（KO）IL36A、IL36G和IL1RL2（IL-36R），并測量IL-17和TNF誘導(dǎo)的四個抗菌和促炎基因的表達(dá)：DEFB4、S100A7、IL36G和IL36RN（圖2f）。敲除IL36G或IL1RL2都導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞中這四個基因的顯著減少，表明在中性粒細(xì)胞蛋白酶不存在的情況下，IL-36G和IL-36R直接增強表皮中IL17A和TNF的反應(yīng)（圖2f）。值得注意的是，與之形成鮮明對比，從抗菌基因DEFB4和S100A7的mRNA表達(dá)來看，IL36A KO導(dǎo)致增強IL-17A和TNF的反應(yīng)（圖2f）。
鑒于角質(zhì)形成細(xì)胞在銀屑病炎癥反應(yīng)中的重要性，我們試圖確定銀屑病皮膚中三個表皮層之間的配體-受體相互作用。為此，我們對所有NS角質(zhì)形成細(xì)胞亞型和所有PP角質(zhì)形成細(xì)胞亞型運行了CellPhoneDB，并分析了在PP中與NS相比具有較高相互作用得分的配對。三個層次中最豐富的配體-受體對出現(xiàn)在ephrin配體家族和其受體之間，這在表皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起到關(guān)鍵的信號傳導(dǎo)作用（圖3a-c）。Notch信號通路在角質(zhì)形成細(xì)胞層之間也是顯著的，并且已經(jīng)報道在表皮生長和分化中發(fā)揮重要功能。有趣的是，IL-36信號僅在銀屑病患者的表棘層觀察到，與scRNA-seq和空間-seq的表達(dá)數(shù)據(jù)一致，它通過誘導(dǎo)表棘層角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子CXCL1和CXCL8進一步促進白細(xì)胞浸潤，尤其是中性粒細(xì)胞的浸潤到表皮中（圖3d）。
為了確定三種角質(zhì)形成細(xì)胞亞型的空間位置，我們試圖通過scRNA-seq分析中定義的亞型表達(dá)特征來解析spatial-seq中的角質(zhì)形成細(xì)胞斑點。預(yù)測得分準(zhǔn)確反映了表皮三個層次的空間位置，棘上角質(zhì)形成細(xì)胞位于最外層，棘狀角質(zhì)形成細(xì)胞位于中間層，基底層角質(zhì)形成細(xì)胞位于最內(nèi)層。我們對PP角質(zhì)形成細(xì)胞斑點和NS角質(zhì)形成細(xì)胞斑點進行差異表達(dá)分析，并得到了與scRNA-seq相似的一組DEGs（圖3e）。兩個代表性基因S100A7和IL36G的空間定位圖顯示了它們在PP中的上調(diào)表達(dá)和在表皮中的特定位置（圖3f），這一結(jié)果也得到了scRNA-seq數(shù)據(jù)集的驗證。值得注意的是，IL36G主要在被預(yù)測為表棘層角質(zhì)形成細(xì)胞的斑點中被檢測到，與我們的scRNA-seq分析中觀察到的細(xì)胞因子反應(yīng)結(jié)果一致。體外培養(yǎng)的銀屑病皮膚活檢標(biāo)本中遷移的角質(zhì)形成細(xì)胞的scrna-seq檢測也檢測到了IL36G。我們還在spatial-seq樣本中繪制了IL-17、IL-36和TNF模塊得分，并驗證了IL36G和S100A7表達(dá)與這些細(xì)胞因子反應(yīng)的共定位（圖3f）。
UMAP分析將NS和PP角質(zhì)形成細(xì)胞分開，顯示了在健康和疾病條件下存在不同的角質(zhì)形成細(xì)胞分化途徑（圖2b）。為了表征這些分化途徑，我們分別對NS和PP角質(zhì)形成細(xì)胞進行了Monocle的擬時序分析。Monocle擬時序分析將細(xì)胞排列成一個線性軌跡，其方向沿著從基底層到棘層再到表棘層的方向排列，這對于NS和PP角質(zhì)形成細(xì)胞都適用。為了確定推動分化的潛在細(xì)胞因子，我們將可變基因沿著擬時序分成五個表達(dá)模式，分別針對NS和PP軌跡。接下來，我們使用IPA推斷了每個表達(dá)模式中基因的上游調(diào)控因子。對于每個上游調(diào)控因子，我們使用五種表達(dá)模式的所有目標(biāo)基因計算模塊得分。然后，我們計算了每個上游調(diào)控因子的模塊得分與Monocle分析定義的擬時序之間的相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)，只有OSM和IL-4模塊得分與NS角質(zhì)形成細(xì)胞的擬時序呈正相關(guān)，而包括IL-22、IL-1β、IL-17A、IL-13和TNF在內(nèi)的多種細(xì)胞因子的模塊得分與PP角質(zhì)形成細(xì)胞的擬時序高度相關(guān)。為了驗證驅(qū)動PP角質(zhì)形成細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，我們使用由單個細(xì)胞因子（包括IL-1β、IL-17A、IL-13和TNF）刺激培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞中誘導(dǎo)的基因計算了模塊得分。這四種細(xì)胞因子的模塊得分與PP角質(zhì)形成細(xì)胞的擬時序高度相關(guān)，與IPA推斷的結(jié)果一致。這些結(jié)果表明，在銀屑病中，角質(zhì)形成細(xì)胞的分化受到多種細(xì)胞因子的局部產(chǎn)生的驅(qū)動，尤其是IL-1β、IL-22、IL-17A、IL-13和TNF。
角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖是銀屑病的一個顯著特征。為了解決角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖問題，我們研究了NS、PN和PP之間的細(xì)胞周期效應(yīng)，通過添加被排除在我們最初評估之外的增殖角質(zhì)形成細(xì)胞，以便于分析細(xì)胞的異質(zhì)性。預(yù)期地，與NS或PN樣本相比，來源于PP樣本的增殖角質(zhì)形成細(xì)胞超過50%。我們在spatial-seq樣本中繪制了細(xì)胞周期得分，發(fā)現(xiàn)表皮的增殖效應(yīng)最強，特別是在表皮的基底層。我們還發(fā)現(xiàn)，在PP樣本中存在著比NS樣本更厚的增殖角質(zhì)形成細(xì)胞層，從而證實了我們的spatial-seq數(shù)據(jù)中PP的高增殖表型。
3、SFRP2+成纖維細(xì)胞在銀屑病炎癥中的作用與其促纖維化作用不同
考慮到根據(jù)scRNA-seq數(shù)據(jù)定義的銀屑病病變中第二常見的細(xì)胞類型是成纖維細(xì)胞。我們將所有成纖維細(xì)胞分成了12個亞群（圖4a-c）?；谙惹鞍l(fā)表的皮膚成纖維細(xì)胞標(biāo)記基因，我們將亞群注釋為四個亞型：SFRP2+、COL11A1+、SFRP4+和RAMP1+成纖維細(xì)胞（圖4b）。我們通過免疫組織化學(xué)（IHC）在銀屑病皮損中確認(rèn)了主要成纖維細(xì)胞亞型的存在。SFRP2+成纖維細(xì)胞是皮膚中最大的成纖維細(xì)胞亞群，與先前的研究結(jié)果一致。盡管SFRP2+成纖維細(xì)胞包含來自PP、PN和NS的細(xì)胞，值得注意的是，使用UMAP進行降維時，PP成纖維細(xì)胞主要與PN和NS成纖維細(xì)胞分開（圖4c）。為了確定推動這種在銀屑病成纖維細(xì)胞中的轉(zhuǎn)變的機制，我們確定了PP和PN成纖維細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因，并使用IPA進行富集分析。激活的上游調(diào)控因子分析確定了I型干擾素、干擾素-γ和TNF作為促進SFRP2+成纖維細(xì)胞亞群中銀屑病相關(guān)變化的top級介導(dǎo)因子（圖4d）。有趣的是，通過比較PP和PN細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)這些上游調(diào)控因子在三個角質(zhì)形成細(xì)胞亞型中也被激活，這表明這些是促使成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞從PN到PP轉(zhuǎn)變的共同驅(qū)動因子。
在SFRP2+成纖維細(xì)胞中，有四個亞群主要由PP成纖維細(xì)胞組成，分別是亞群3、0、6和2（圖4c，e）。有趣的是，差異表達(dá)分析顯示PP SFRP2+成纖維細(xì)胞存在顯著的異質(zhì)性，亞群3標(biāo)記物中包括膠原基因（例如COL1A1和COL3A1），而亞群6標(biāo)記物中則包括一組促炎細(xì)胞因子（例如CCL19、IL33、IL34）以及蛋白酶CTSS（圖4f）。這些趨化因子和蛋白酶在上皮表皮層和真皮乳頭尖部的成纖維細(xì)胞中表達(dá)最為明顯，這是通過空間-seq映射和免疫熒光（圖4g）揭示的。對成纖維細(xì)胞亞群3和亞群6標(biāo)記基因的上游調(diào)控因子分析顯示，關(guān)鍵的銀屑病相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、TNF、IL-1β、OSM和IL-17A的激活z分?jǐn)?shù)增加最多，而與纖維化相關(guān)的IL-5、EDN1和IL-4的激活z分?jǐn)?shù)降低（圖4h）。綜上所述，這些結(jié)果揭示了PP SFRP2+成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性，包括膠原基質(zhì)成分的產(chǎn)生者以及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的非基質(zhì)產(chǎn)生的促炎區(qū)域。
4、CD8+Tc17是銀屑病皮膚中IL17A的主要來源
長期以來，產(chǎn)生IL-17的T細(xì)胞一直被認(rèn)為是銀屑病發(fā)病機制的核心。為了定義T細(xì)胞亞型在銀屑病中的作用，我們對T細(xì)胞進行了亞群聚類，并使用經(jīng)典的T細(xì)胞譜系標(biāo)記對亞群進行了注釋（圖5a、b）。我們在正常皮膚（NS）、健康對照皮膚（PN）和銀屑病皮膚（PP）中鑒定出了七種T細(xì)胞亞型：原始T細(xì)胞（亞群0和7；RGCC、CCR7、IL7R）、應(yīng)激T細(xì)胞（亞群1和2；DNAJB1、HSPA1A、HSPH1）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）（亞群3；FOXP3、TIGIT、BAFT）、細(xì)胞毒性T細(xì)胞（亞群4；CCL5、NKG7、GZMK）、分泌IL17的CD8 T細(xì)胞（Tc17細(xì)胞）（亞群5；IL17A、IL17F、CCL20）、γδT細(xì)胞（亞群6；TRDC、FCER1G、TYROBP）和IFN T細(xì)胞（亞群8；IFI6、MX1、IFIT3）。值得注意的是，大部分T細(xì)胞來源于銀屑病皮膚樣本，與已知T細(xì)胞在銀屑病皮膚中的大量滲入一致（圖5b）。對每個亞群的疾病組成分析顯示，在銀屑病中，Tregs、Tc17細(xì)胞和IFN T細(xì)胞的比例增加（圖5c）。與角質(zhì)細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)一致，PP中呈現(xiàn)出IFN特征的T細(xì)胞比例增加，表明在銀屑病皮膚中，強烈的IFN反應(yīng)不僅影響角質(zhì)細(xì)胞，還影響其他細(xì)胞類型。我們檢查了之前報道與銀屑病有關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)IL17A、IL17F、IL26、CCL20、CXCL13、IL22和IL23R專門由Tc17細(xì)胞表達(dá)。傳統(tǒng)上，認(rèn)為產(chǎn)生IL-17的T細(xì)胞主要是CD4+ T細(xì)胞，然而最近的觀察為銀屑病中產(chǎn)生IL-17的CD8+ T細(xì)胞提供了越來越多的證據(jù)。從皮膚中鑒定到CD4+和CD8+ T細(xì)胞使得我們能夠直接比較這些T細(xì)胞亞群及其在銀屑病皮膚中對IL-17反應(yīng)的貢獻。在這里，我們的數(shù)據(jù)表明CD8+ T細(xì)胞是銀屑病中IL17A的主要來源。為了進一步表征這一點，我們檢查了IL17A與CD4、CD8A和IFNG的共表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)IL17A表達(dá)細(xì)胞與CD8A和IFNG表達(dá)細(xì)胞呈正相關(guān)，但很少觀察到CD4+ IL17A+細(xì)胞（圖5d）。此外，我們的數(shù)據(jù)表明，IL17A產(chǎn)生的T細(xì)胞數(shù)量比IL17F產(chǎn)生的多，盡管大部分細(xì)胞同時表達(dá)這兩個因子（圖5f）。我們將T細(xì)胞標(biāo)記基因映射到空間測序樣本中，并揭示出盡管在表皮中鮮有檢測到IL-17或TNF產(chǎn)生的T細(xì)胞，大部分T細(xì)胞在皮膚真皮表皮交界處檢測到（圖5e），這一結(jié)果在免疫熒光染色中得到了驗證。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)IL-17受體基因（IL17RA）和TNF受體基因（TNFRSF1A）在PP樣本的表皮中高表達(dá)（圖5e），與在角質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的局部細(xì)胞因子反應(yīng)結(jié)果一致。
5、單細(xì)胞RNA測序確定銀屑病患者獨特的髓系亞群
為了檢查銀屑病皮膚中髓系細(xì)胞的細(xì)胞異質(zhì)性，我們對髓系細(xì)胞進行了亞群聚類，并注釋了六個髓系亞群：朗格漢斯細(xì)胞（LC；CD207和CD1A）、經(jīng)典1型樹突狀細(xì)胞（cDC1；CLEC9A和IRF8）、經(jīng)典2型樹突狀細(xì)胞A亞群（cDC2A；LAMP3和CD1B）、經(jīng)典2型樹突狀細(xì)胞B亞群（cDC2B；CLEC10A和IL1B）、CD16+樹突狀細(xì)胞（CD16+ DC；FCGR3A和HES1）和周圍血管巨噬細(xì)胞（PVM；CD163和SELENOP）（圖6a、b）。對每個亞型的疾病組成分析顯示，在PP中LC的比例減少（圖6c）。先前的研究表明在銀屑病皮膚中LC的遷移和功能受損，我們的分析結(jié)果與此一致，顯示PP中LC的數(shù)量減少。值得注意的是，cDC2A僅來源于PN和PP皮膚，其中PP皮膚中的數(shù)量更多。先前的研究報告顯示IL15和IL32在銀屑病中表達(dá)增加，這兩種細(xì)胞因子都作為促炎介質(zhì)，并且主要由cDC2A髓系細(xì)胞表達(dá)（圖6d）。我們還發(fā)現(xiàn)CCL17、CCL19及其受體CCR7主要由cDC2A表達(dá)（圖6d）。抑制CCL19/CCR7軸在病損皮膚中被報道為TNF阻斷誘導(dǎo)的銀屑病患者臨床緩解的關(guān)鍵事件。此外，cDC2A高表達(dá)共刺激分子CD200、CD80和CD274，表明這些細(xì)胞可能在銀屑病皮膚中引導(dǎo)和推動T細(xì)胞活性和擴增（圖6d）。CD16+ DC主要來源于PP樣本（圖6c）。CD16+ DC具有與cDC2B類似的表達(dá)模式，包括CLEC10A、IL1B和CXCL2，但也表達(dá)FCGR3A（CD16）、CD14和HES1，這表明它們可能起源于循環(huán)CD14+ CD16+單核細(xì)胞（圖6b）。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)CXCL9和CXCL10主要由CD16+ DC表達(dá)，這兩種趨化因子已被證明通過STAT1、STAT4和STAT5激活驅(qū)動效應(yīng)性Th1/Th17細(xì)胞極化（圖6b）。這些數(shù)據(jù)在銀屑病和正常皮膚中通過免疫組織化學(xué)染色得到驗證，并顯示了這些亞群在銀屑病皮膚中的不同定位，CLEC9A和LAMP3主要定位于真皮中的淋巴樣結(jié)構(gòu)中，CLEC10A和CD16主要位于真皮乳頭的頂部（圖6e）。在正常皮膚中找不到LAMP3+和CD16+細(xì)胞。PVM位于真皮乳頭的周血管位置，而LC主要位于真皮乳頭的真皮-表皮交界處（圖6e）。
6、單細(xì)胞RNA測序突出銀屑病相關(guān)遺傳風(fēng)險變異的細(xì)胞類型特異性
為了確定與銀屑病相關(guān)的遺傳變異相關(guān)的基因及其細(xì)胞位置，我們檢查了GWAS在銀屑病中檢測到的65個單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點。使用人體皮膚的表達(dá)定量性狀位點（eQTL）數(shù)據(jù)庫，共鑒定了與這些SNP相關(guān)的46個基因。為了增加與SNP位點相關(guān)的基因數(shù)量，我們還考慮了人類基因組中與SNP位點最近的基因，共得到65個相關(guān)基因。在去除低表達(dá)基因后，我們得到27個與eQTL相關(guān)的基因和57個最近基因。我們計算了這些基因在NS、PN和PP中每個細(xì)胞類型中的平均表達(dá)，并確定了表達(dá)每個基因的細(xì)胞類型。值得注意的結(jié)果包括C1orf68基因在角質(zhì)細(xì)胞中的主要表達(dá)，且從NS到PN再到PP呈遞減趨勢。IL23R基因在PN和PP的T細(xì)胞中主要表達(dá)，已被證明促進銀屑病中的IL-17反應(yīng)。這些結(jié)果為功能研究提供了寶貴的資源，旨在了解與銀屑病相關(guān)的遺傳位點及其關(guān)鍵細(xì)胞群體的機制。
7、配體-受體分析顯示銀屑病的細(xì)胞類型特異性網(wǎng)絡(luò)
鑒于觀察到與健康皮膚相比，銀屑病皮膚中的細(xì)胞類型和亞型組成發(fā)生了變化，我們分析了隨著銀屑病的發(fā)展細(xì)胞間的相互通訊如何改變。為此，我們首先進一步對內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和黑素細(xì)胞進行了亞群聚，并分別使用CellPhoneDB在NS特定的亞群聚和PP特定的亞群聚上進行配體-受體分析。為評估銀屑病中發(fā)生的變化，我們分析了在PP中與NS相比具有更高相互作用分?jǐn)?shù)的配體-受體對。在銀屑病皮膚中，配體-受體對變化最多的細(xì)胞類型有四種：角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、髓樣細(xì)胞和T細(xì)胞（圖7a）。我們認(rèn)為空間位置上的鄰近性將促進細(xì)胞間的通訊。為此，我們統(tǒng)計了每對細(xì)胞類型的相鄰斑點數(shù)，如散點-餅圖所示（圖7b）。結(jié)果表明，角質(zhì)細(xì)胞具有最多的免疫細(xì)胞鄰居（T細(xì)胞和髓樣細(xì)胞），成纖維細(xì)胞分布在許多其他細(xì)胞類型中，內(nèi)皮細(xì)胞與免疫細(xì)胞相鄰（圖7c）。通過匯總配體-受體對變化的數(shù)量和空間鄰近性分析，我們將分析重點放在角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、髓樣細(xì)胞和T細(xì)胞之間的相互作用上。
值得注意的是，角質(zhì)細(xì)胞預(yù)測的相互作用包括CCL2和CCL7與髓樣細(xì)胞中的CCR2的相互作用，CCL20與髓樣細(xì)胞和T細(xì)胞中的CCR6和IL7與IL7R的相互作用，以及類胰島素生長因子家族配體（IGFL1、IGFL2、IGFL3）與其受體（IGFLR1）在T細(xì)胞上的相互作用（圖7d），這表明角質(zhì)細(xì)胞在調(diào)控銀屑病中的免疫反應(yīng)中起著重要作用。此外，角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)了血小板源性生長因子（PDGFA、PDGFC）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGFB1）、表皮生長因子（TGFA）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA、VEGFB），這些因子能夠與成纖維細(xì)胞上的相應(yīng)受體發(fā)生相互作用（圖7d）。
令人驚訝的是，成纖維細(xì)胞通過推測的配體-受體相互作用與許多細(xì)胞類型相連接。成纖維細(xì)胞產(chǎn)生了許多趨化因子（CCL13、CCL19、CCL2、CCL8、CXCL1、CXCL12、CXCL2、CXCL3），與髓樣細(xì)胞和T細(xì)胞表達(dá)的受體相結(jié)合，提示成纖維細(xì)胞在銀屑病中招募免疫細(xì)胞方面起著重要作用（圖7e）。成纖維細(xì)胞還產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-7和IL-15，與T細(xì)胞上的IL-7受體和IL-15受體相互作用，促進T細(xì)胞增殖和成熟。成纖維細(xì)胞通過表達(dá)與其受體結(jié)合的成纖維細(xì)胞生長因子（FGF10、FGF2、FGF7），具有誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞過度增殖的能力。我們通過免疫組織化學(xué)（IHC）在銀屑病斑塊皮膚中驗證了成纖維細(xì)胞生長因子FGF2和FGF7以及它們的受體FGFR2和FGFR3的表達(dá)。
髓樣細(xì)胞表達(dá)多種趨化因子，進一步促進其他白細(xì)胞向銀屑病部位的招募（圖7f）。這些趨化因子還與角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá)的非典型趨化因子受體（ACKR2、ACKR3、ACKR4）相互作用，引發(fā)過度的Th17反應(yīng)并放大皮膚炎癥。此外，髓樣細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子（IL15、IL1A、IL1B、IL6）抑制角質(zhì)細(xì)胞的凋亡。T細(xì)胞表達(dá)與角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá)的非典型趨化因子受體相互作用的細(xì)胞因子（CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL5、CXCL13）（圖7g）。此外，T細(xì)胞表達(dá)的IL17A、IL17F和IL22與髓樣細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合，已知在銀屑病中促進炎癥。
因此，通過整合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)、上游調(diào)節(jié)因子分析、配體-受體結(jié)果以及不同細(xì)胞類型的空間位置，我們能夠創(chuàng)建一個突出成纖維細(xì)胞在銀屑病皮膚中作用的模型。在銀屑病中，SFRP2+成纖維細(xì)胞從纖維化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檠装Y狀態(tài)。這些炎癥性成纖維細(xì)胞表達(dá)CCL13和CCL19，能夠招募表達(dá)相關(guān)趨化因子受體的細(xì)胞：CCR2+髓樣細(xì)胞和CCR7+LAMP3+經(jīng)典型2型樹突狀細(xì)胞A。這些炎癥性成纖維細(xì)胞還高水平表達(dá)CXCL1，已知能夠招募中性粒細(xì)胞，以及CXCL12，已知能夠招募CXCR4+Tc17細(xì)胞。CXCL12還可以通過其在表皮上的受體CXCR4作用誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞增殖。在表皮中，Tc17分泌的IL-17引發(fā)炎癥，通過上皮角質(zhì)層內(nèi)的IL-36循環(huán)進一步放大，觸發(fā)CCL20的釋放，CCL20可以招募CCR6+Tc17以及CXCL1和CXCL8可以招募中性粒細(xì)胞，與上皮角質(zhì)層中的微膿腫一致。
實驗方法
免疫組織化學(xué)、scRNA-seq、Seurat、亞型細(xì)分、擬時序分析、銀屑病相關(guān)遺傳風(fēng)險變異分析、配體-受體相互作用分析、Spatial-seq、CRISPR/Cas9、qRT-PCR、Seq-Scope樣品處理和分。
參考文獻
Ma, F., Plazyo, O., Billi, A.C. et al. Single cell and spatial sequencing define processes by which keratinocytes and fibroblasts amplify inflammatory responses in psoriasis. Nat Commun 14, 3455 (2023).