單細(xì)胞和空間測(cè)序確定角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞放大銀屑病炎癥反應(yīng)的過(guò)程
銀屑病是一種常見(jiàn)的皮膚慢性炎癥性疾病，其免疫發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。在這里，我們使用單細(xì)胞和空間RNA測(cè)序相結(jié)合的方法，證明了在沒(méi)有中性粒細(xì)胞蛋白酶的情況下，IL-36依賴性放大了IL-17A和TNF炎癥反應(yīng)，這主要發(fā)生在銀屑病表皮的角質(zhì)層上部。我們進(jìn)一步展示了在銀屑病中，SFRP2+成纖維細(xì)胞的一個(gè)亞群通過(guò)轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺谞顟B(tài)而促進(jìn)免疫網(wǎng)絡(luò)的放大。SFRP2+成纖維細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)涉及CCL13、CCL19和CXCL12的產(chǎn)生，通過(guò)配體-受體相互作用與其他空間上鄰近的細(xì)胞類型連接：CCR2+髓系細(xì)胞、CCR7+LAMP3+樹(shù)突狀細(xì)胞和CXCR4分別在CD8+Tc17細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞上表達(dá)。SFRP2+成纖維細(xì)胞也表達(dá)組織蛋白酶S，通過(guò)激活角質(zhì)形成細(xì)胞中的IL-36G進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)提供了對(duì)銀屑病發(fā)病機(jī)制的深入看法，這擴(kuò)大了我們對(duì)關(guān)鍵細(xì)胞參與者的理解，包括炎性成纖維細(xì)胞及其細(xì)胞相互作用。
該研究于2023年6月發(fā)表在《Nature communications》，IF：16.6。
技術(shù)路線
1、對(duì)正常人和銀屑病患者皮膚單細(xì)胞的普查顯示了皮膚細(xì)胞群體的多樣性
為了了解健康和銀屑病人皮膚的無(wú)偏細(xì)胞組成和細(xì)胞狀態(tài)，我們從8個(gè)健康人和14個(gè)銀屑病活檢標(biāo)本中分離了皮膚細(xì)胞的單細(xì)胞懸液。我們還收集了來(lái)自同一批銀屑病患者的11個(gè)活檢標(biāo)本中損傷周圍的皮膚細(xì)胞，總共得到了33個(gè)10X Chromium單細(xì)胞文庫(kù)（8個(gè)健康皮膚文庫(kù)（NS），11個(gè)銀屑病病變周圍皮膚文庫(kù)（PN）和14個(gè)銀屑病病變皮膚文庫(kù)（PP））。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制的銀屑病單細(xì)胞圖譜包括67,378個(gè)細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的平均基因數(shù)為2421個(gè)，轉(zhuǎn)錄本數(shù)為10,953個(gè)（圖1a、b）。為了研究這些細(xì)胞的異質(zhì)性，我們挑選可變基因，并使用統(tǒng)一的流形逼近和投影（UMAP）進(jìn)行降維和R軟件包Seurat進(jìn)行細(xì)胞聚類。通過(guò)將聚類標(biāo)記基因與經(jīng)典細(xì)胞類型定義的特征基因重疊，對(duì)聚類進(jìn)行了驗(yàn)證。我們鑒定出了10個(gè)主要的細(xì)胞類型，包括角質(zhì)形成細(xì)胞（KC；KRT14、KRT1、DMKN）、黑素細(xì)胞（MLNC；DCT、TYRP1、PMEL）、汗腺細(xì)胞（ECG；PIP、DCD、MUCL1）、內(nèi)皮細(xì)胞（EC；PECAM1、CDH5、CLDN5）、成纖維細(xì)胞（FB；DCN、COL1A1、COL1A2）、平滑肌細(xì)胞（SMC；ACTA2、TAGLN、MYL9）、神經(jīng)細(xì)胞（Nerve；MPZ、PLP1、S100B）、T細(xì)胞（TC；CD3D、CD3E、TRAC）、髓系細(xì)胞（ML；CD74、HLADRA、HLA-DPB1）和肥大細(xì)胞（Mast；CPA3、TPSAB1、CTSG）（圖1c）。
在UMAP中，PP角質(zhì)形成細(xì)胞與NS和PN角質(zhì)形成細(xì)胞完全分離，這表明銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄組發(fā)生了根本性的改變（圖1b）。在獲得的細(xì)胞數(shù)量方面，最豐富的細(xì)胞類型是角質(zhì)形成細(xì)胞，其次是成纖維細(xì)胞和T細(xì)胞。對(duì)每種細(xì)胞類型的疾病組成分析顯示，PP中免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的比例增加，而汗腺細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和黑素細(xì)胞的比例減少。這些結(jié)果表明，銀屑病特征包括明顯的角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組變化和免疫細(xì)胞（包括T細(xì)胞和髓系細(xì)胞）的積累。
為了定位銀屑病皮膚中的各種細(xì)胞類型，我們對(duì)銀屑病皮膚進(jìn)行了空間測(cè)序。我們從一個(gè)20微米厚的冰凍切片上收集RNA，并將其放置在一個(gè)含有空間條形碼捕獲寡核苷酸的55微米孔陣列上，用于轉(zhuǎn)錄組分析。在經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制步驟后，我們檢測(cè)到987個(gè)空間定義的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域平均檢測(cè)到2782個(gè)基因和11,779個(gè)轉(zhuǎn)錄本（圖1d）。我們通過(guò)將空間基因表達(dá)與單細(xì)胞RNA測(cè)序中主要細(xì)胞類型的基因表達(dá)進(jìn)行反卷積，為每個(gè)區(qū)域標(biāo)注了細(xì)胞類型組成。反卷積結(jié)果顯示在散點(diǎn)餅圖中，每個(gè)空間陣列中含有一個(gè)餅圖。K-means聚類顯示出六個(gè)具有不同平均細(xì)胞類型組成的聚類，代表了角質(zhì)形成細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、汗腺細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、髓系細(xì)胞和T細(xì)胞的聚集體（圖1d）?？臻g測(cè)序中每個(gè)聚類的標(biāo)記基因與通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序確定的細(xì)胞類型標(biāo)記基因一致，表明注釋準(zhǔn)確（圖1e）。角質(zhì)形成細(xì)胞位于表皮中。髓系細(xì)胞、T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞位于靠近表皮的淺表真皮，而成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和汗腺細(xì)胞位于更深層的真皮（圖1d）。我們還觀察到一些空白區(qū)域，其中捕獲到的mRNA數(shù)量較少，代表真皮內(nèi)無(wú)細(xì)胞區(qū)域。同時(shí)，我們對(duì)另外三個(gè)銀屑病和兩個(gè)健康皮膚活檢標(biāo)本進(jìn)行了空間測(cè)序，觀察到類似的細(xì)胞類型和空間細(xì)胞聚集。
2、銀屑病皮膚中不同的角質(zhì)形成細(xì)胞分化狀態(tài)反映了銀屑病中不同的細(xì)胞因子反應(yīng)
PP與NS和PN角質(zhì)形成細(xì)胞的明顯分離表明在患有銀屑病的皮膚中存在重大的表皮功能變化（圖1b）。為了進(jìn)一步描述這一點(diǎn)，我們對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行了亞群聚類，并通過(guò)分化狀態(tài)對(duì)其進(jìn)行了注釋。我們的分析在基底層（COL17A1、DST、KRT15）、棘層（KRT6A、KRT6B、KRT16）和表棘層（SLURP1、KLK7、KRT2）定義了三個(gè)不同的角質(zhì)形成細(xì)胞分化狀態(tài)（圖2a-c）。我們對(duì)每個(gè)表皮分化狀態(tài)內(nèi)的PP和NS角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行差異表達(dá)分析，并確定了在銀屑病皮膚的表棘層中不同表達(dá)的基因（DEGs）數(shù)量最多。我們繪制了每個(gè)分化狀態(tài)的前15個(gè)上調(diào)和下調(diào)基因，并發(fā)現(xiàn)PN角質(zhì)形成細(xì)胞在所有三個(gè)表皮層中表現(xiàn)出介于NS和PP角質(zhì)形成細(xì)胞之間的中間表達(dá)模式（圖2d）。S100A7、S100A8和S100A9在PP的所有三層中明顯過(guò)表達(dá)，與之前的銀屑病研究結(jié)果一致。有趣的是，I型干擾素誘導(dǎo)的基因IFITM3、IFI27和IFI6在PP上調(diào)基因中排名靠前，主要定位于銀屑病皮膚的基底表皮層。KRT6基因和KRT16在棘層和表棘層中排名靠前。值得注意的是，C1orf68，在以前的基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）中被確定為銀屑病的靶基因，特異地在表棘層中表達(dá)（圖2d）。
接下來(lái)，我們使用Ingenuity通路分析（IPA）評(píng)估了每個(gè)表皮層內(nèi)差異表達(dá)基因（DEGs）的富集通路和上游調(diào)控因子的細(xì)胞因子。這表明在銀屑病皮膚中，干擾素信號(hào)通路在基底層和棘層中是最重要的調(diào)控因子，而在表棘層中的作用較小。IL-17通路主要富集在表棘層中，而在棘層和基底層中富集較少。銀屑病皮膚中其他上游炎癥反應(yīng)的富集包括OSM、TNF、IL-36、IL-6、IL-1、IL-18、IL-21、IL-22和IL-27。
為了追蹤這些細(xì)胞因子的來(lái)源，我們計(jì)算了每種細(xì)胞類型在不同疾病狀態(tài)（NS、PN、PP）下這些基因的平均表達(dá)水平。這些炎癥介質(zhì)的大多數(shù)由特定的細(xì)胞類型表達(dá)，例如，角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)IL18和IL36G；T細(xì)胞表達(dá)IL17A、TNF、IL21和IL22；髓系細(xì)胞表達(dá)IFNB1、IL1A、IL1B和IL27。值得注意的是，與PN和NS相比，IL36G、IL17A、IL21、IL22和IL27在相應(yīng)的細(xì)胞類型中在PP中的表達(dá)最高。為了驗(yàn)證這些關(guān)鍵上游調(diào)控因子，我們計(jì)算了通過(guò)單個(gè)促炎細(xì)胞因子（包括I型干擾素（IFN-α）、IL-17A、IL-36γ和TNF）刺激培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞中誘導(dǎo)基因的模塊得分（圖2e）。與DEGs的富集分析一致，IFN-α得分在所有三個(gè)層次中從NS逐漸增加到PN再到PP，在基底層得分最高，棘層略有下降，表棘層進(jìn)一步下降。IL-17A得分在NS和PN中在所有三個(gè)層次上相似，但在PP角質(zhì)形成細(xì)胞中從基底層到棘層再到表棘層有顯著增加。類似地，在PP表皮中，IL-36γ得分在表棘層中比基底層和棘層更高。為了驗(yàn)證這些反應(yīng)的空間特異性，我們計(jì)算了角質(zhì)形成細(xì)胞亞型模塊得分以及IL-17A和IL-36γ模塊得分。與scRNA-seq結(jié)果一致，IL-17A和IL-36γ模塊得分與表棘層模塊得分最高相關(guān)，而與棘層或基底層模塊得分的相關(guān)性較低。這些結(jié)果表明，在銀屑病中，不同的表皮組織受促炎細(xì)胞因子的影響程度不同。
為了研究IL-36在激活I(lǐng)L-17和TNF反應(yīng)中的作用，我們使用CRISPR-Cas9在角質(zhì)形成細(xì)胞中敲除（KO）IL36A、IL36G和IL1RL2（IL-36R），并測(cè)量IL-17和TNF誘導(dǎo)的四個(gè)抗菌和促炎基因的表達(dá)：DEFB4、S100A7、IL36G和IL36RN（圖2f）。敲除IL36G或IL1RL2都導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞中這四個(gè)基因的顯著減少，表明在中性粒細(xì)胞蛋白酶不存在的情況下，IL-36G和IL-36R直接增強(qiáng)表皮中IL17A和TNF的反應(yīng)（圖2f）。值得注意的是，與之形成鮮明對(duì)比，從抗菌基因DEFB4和S100A7的mRNA表達(dá)來(lái)看，IL36A KO導(dǎo)致增強(qiáng)IL-17A和TNF的反應(yīng)（圖2f）。
鑒于角質(zhì)形成細(xì)胞在銀屑病炎癥反應(yīng)中的重要性，我們?cè)噲D確定銀屑病皮膚中三個(gè)表皮層之間的配體-受體相互作用。為此，我們對(duì)所有NS角質(zhì)形成細(xì)胞亞型和所有PP角質(zhì)形成細(xì)胞亞型運(yùn)行了CellPhoneDB，并分析了在PP中與NS相比具有較高相互作用得分的配對(duì)。三個(gè)層次中最豐富的配體-受體對(duì)出現(xiàn)在ephrin配體家族和其受體之間，這在表皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起到關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)作用（圖3a-c）。Notch信號(hào)通路在角質(zhì)形成細(xì)胞層之間也是顯著的，并且已經(jīng)報(bào)道在表皮生長(zhǎng)和分化中發(fā)揮重要功能。有趣的是，IL-36信號(hào)僅在銀屑病患者的表棘層觀察到，與scRNA-seq和空間-seq的表達(dá)數(shù)據(jù)一致，它通過(guò)誘導(dǎo)表棘層角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子CXCL1和CXCL8進(jìn)一步促進(jìn)白細(xì)胞浸潤(rùn)，尤其是中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)到表皮中（圖3d）。
為了確定三種角質(zhì)形成細(xì)胞亞型的空間位置，我們?cè)噲D通過(guò)scRNA-seq分析中定義的亞型表達(dá)特征來(lái)解析spatial-seq中的角質(zhì)形成細(xì)胞斑點(diǎn)。預(yù)測(cè)得分準(zhǔn)確反映了表皮三個(gè)層次的空間位置，棘上角質(zhì)形成細(xì)胞位于最外層，棘狀角質(zhì)形成細(xì)胞位于中間層，基底層角質(zhì)形成細(xì)胞位于最內(nèi)層。我們對(duì)PP角質(zhì)形成細(xì)胞斑點(diǎn)和NS角質(zhì)形成細(xì)胞斑點(diǎn)進(jìn)行差異表達(dá)分析，并得到了與scRNA-seq相似的一組DEGs（圖3e）。兩個(gè)代表性基因S100A7和IL36G的空間定位圖顯示了它們?cè)赑P中的上調(diào)表達(dá)和在表皮中的特定位置（圖3f），這一結(jié)果也得到了scRNA-seq數(shù)據(jù)集的驗(yàn)證。值得注意的是，IL36G主要在被預(yù)測(cè)為表棘層角質(zhì)形成細(xì)胞的斑點(diǎn)中被檢測(cè)到，與我們的scRNA-seq分析中觀察到的細(xì)胞因子反應(yīng)結(jié)果一致。體外培養(yǎng)的銀屑病皮膚活檢標(biāo)本中遷移的角質(zhì)形成細(xì)胞的scrna-seq檢測(cè)也檢測(cè)到了IL36G。我們還在spatial-seq樣本中繪制了IL-17、IL-36和TNF模塊得分，并驗(yàn)證了IL36G和S100A7表達(dá)與這些細(xì)胞因子反應(yīng)的共定位（圖3f）。
UMAP分析將NS和PP角質(zhì)形成細(xì)胞分開(kāi)，顯示了在健康和疾病條件下存在不同的角質(zhì)形成細(xì)胞分化途徑（圖2b）。為了表征這些分化途徑，我們分別對(duì)NS和PP角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行了Monocle的擬時(shí)序分析。Monocle擬時(shí)序分析將細(xì)胞排列成一個(gè)線性軌跡，其方向沿著從基底層到棘層再到表棘層的方向排列，這對(duì)于NS和PP角質(zhì)形成細(xì)胞都適用。為了確定推動(dòng)分化的潛在細(xì)胞因子，我們將可變基因沿著擬時(shí)序分成五個(gè)表達(dá)模式，分別針對(duì)NS和PP軌跡。接下來(lái)，我們使用IPA推斷了每個(gè)表達(dá)模式中基因的上游調(diào)控因子。對(duì)于每個(gè)上游調(diào)控因子，我們使用五種表達(dá)模式的所有目標(biāo)基因計(jì)算模塊得分。然后，我們計(jì)算了每個(gè)上游調(diào)控因子的模塊得分與Monocle分析定義的擬時(shí)序之間的相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)，只有OSM和IL-4模塊得分與NS角質(zhì)形成細(xì)胞的擬時(shí)序呈正相關(guān)，而包括IL-22、IL-1β、IL-17A、IL-13和TNF在內(nèi)的多種細(xì)胞因子的模塊得分與PP角質(zhì)形成細(xì)胞的擬時(shí)序高度相關(guān)。為了驗(yàn)證驅(qū)動(dòng)PP角質(zhì)形成細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，我們使用由單個(gè)細(xì)胞因子（包括IL-1β、IL-17A、IL-13和TNF）刺激培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞中誘導(dǎo)的基因計(jì)算了模塊得分。這四種細(xì)胞因子的模塊得分與PP角質(zhì)形成細(xì)胞的擬時(shí)序高度相關(guān)，與IPA推斷的結(jié)果一致。這些結(jié)果表明，在銀屑病中，角質(zhì)形成細(xì)胞的分化受到多種細(xì)胞因子的局部產(chǎn)生的驅(qū)動(dòng)，尤其是IL-1β、IL-22、IL-17A、IL-13和TNF。
角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖是銀屑病的一個(gè)顯著特征。為了解決角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖問(wèn)題，我們研究了NS、PN和PP之間的細(xì)胞周期效應(yīng)，通過(guò)添加被排除在我們最初評(píng)估之外的增殖角質(zhì)形成細(xì)胞，以便于分析細(xì)胞的異質(zhì)性。預(yù)期地，與NS或PN樣本相比，來(lái)源于PP樣本的增殖角質(zhì)形成細(xì)胞超過(guò)50%。我們?cè)趕patial-seq樣本中繪制了細(xì)胞周期得分，發(fā)現(xiàn)表皮的增殖效應(yīng)最強(qiáng)，特別是在表皮的基底層。我們還發(fā)現(xiàn)，在PP樣本中存在著比NS樣本更厚的增殖角質(zhì)形成細(xì)胞層，從而證實(shí)了我們的spatial-seq數(shù)據(jù)中PP的高增殖表型。
3、SFRP2+成纖維細(xì)胞在銀屑病炎癥中的作用與其促纖維化作用不同
考慮到根據(jù)scRNA-seq數(shù)據(jù)定義的銀屑病病變中第二常見(jiàn)的細(xì)胞類型是成纖維細(xì)胞。我們將所有成纖維細(xì)胞分成了12個(gè)亞群（圖4a-c）。基于先前發(fā)表的皮膚成纖維細(xì)胞標(biāo)記基因，我們將亞群注釋為四個(gè)亞型：SFRP2+、COL11A1+、SFRP4+和RAMP1+成纖維細(xì)胞（圖4b）。我們通過(guò)免疫組織化學(xué)（IHC）在銀屑病皮損中確認(rèn)了主要成纖維細(xì)胞亞型的存在。SFRP2+成纖維細(xì)胞是皮膚中最大的成纖維細(xì)胞亞群，與先前的研究結(jié)果一致。盡管SFRP2+成纖維細(xì)胞包含來(lái)自PP、PN和NS的細(xì)胞，值得注意的是，使用UMAP進(jìn)行降維時(shí)，PP成纖維細(xì)胞主要與PN和NS成纖維細(xì)胞分開(kāi)（圖4c）。為了確定推動(dòng)這種在銀屑病成纖維細(xì)胞中的轉(zhuǎn)變的機(jī)制，我們確定了PP和PN成纖維細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因，并使用IPA進(jìn)行富集分析。激活的上游調(diào)控因子分析確定了I型干擾素、干擾素-γ和TNF作為促進(jìn)SFRP2+成纖維細(xì)胞亞群中銀屑病相關(guān)變化的top級(jí)介導(dǎo)因子（圖4d）。有趣的是，通過(guò)比較PP和PN細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)這些上游調(diào)控因子在三個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞亞型中也被激活，這表明這些是促使成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞從PN到PP轉(zhuǎn)變的共同驅(qū)動(dòng)因子。
在SFRP2+成纖維細(xì)胞中，有四個(gè)亞群主要由PP成纖維細(xì)胞組成，分別是亞群3、0、6和2（圖4c，e）。有趣的是，差異表達(dá)分析顯示PP SFRP2+成纖維細(xì)胞存在顯著的異質(zhì)性，亞群3標(biāo)記物中包括膠原基因（例如COL1A1和COL3A1），而亞群6標(biāo)記物中則包括一組促炎細(xì)胞因子（例如CCL19、IL33、IL34）以及蛋白酶CTSS（圖4f）。這些趨化因子和蛋白酶在上皮表皮層和真皮乳頭尖部的成纖維細(xì)胞中表達(dá)最為明顯，這是通過(guò)空間-seq映射和免疫熒光（圖4g）揭示的。對(duì)成纖維細(xì)胞亞群3和亞群6標(biāo)記基因的上游調(diào)控因子分析顯示，關(guān)鍵的銀屑病相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、TNF、IL-1β、OSM和IL-17A的激活z分?jǐn)?shù)增加最多，而與纖維化相關(guān)的IL-5、EDN1和IL-4的激活z分?jǐn)?shù)降低（圖4h）。綜上所述，這些結(jié)果揭示了PP SFRP2+成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性，包括膠原基質(zhì)成分的產(chǎn)生者以及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的非基質(zhì)產(chǎn)生的促炎區(qū)域。
4、CD8+Tc17是銀屑病皮膚中IL17A的主要來(lái)源
長(zhǎng)期以來(lái)，產(chǎn)生IL-17的T細(xì)胞一直被認(rèn)為是銀屑病發(fā)病機(jī)制的核心。為了定義T細(xì)胞亞型在銀屑病中的作用，我們對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行了亞群聚類，并使用經(jīng)典的T細(xì)胞譜系標(biāo)記對(duì)亞群進(jìn)行了注釋（圖5a、b）。我們?cè)谡Ｆつw（NS）、健康對(duì)照皮膚（PN）和銀屑病皮膚（PP）中鑒定出了七種T細(xì)胞亞型：原始T細(xì)胞（亞群0和7；RGCC、CCR7、IL7R）、應(yīng)激T細(xì)胞（亞群1和2；DNAJB1、HSPA1A、HSPH1）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）（亞群3；FOXP3、TIGIT、BAFT）、細(xì)胞毒性T細(xì)胞（亞群4；CCL5、NKG7、GZMK）、分泌IL17的CD8 T細(xì)胞（Tc17細(xì)胞）（亞群5；IL17A、IL17F、CCL20）、γδT細(xì)胞（亞群6；TRDC、FCER1G、TYROBP）和IFN T細(xì)胞（亞群8；IFI6、MX1、IFIT3）。值得注意的是，大部分T細(xì)胞來(lái)源于銀屑病皮膚樣本，與已知T細(xì)胞在銀屑病皮膚中的大量滲入一致（圖5b）。對(duì)每個(gè)亞群的疾病組成分析顯示，在銀屑病中，Tregs、Tc17細(xì)胞和IFN T細(xì)胞的比例增加（圖5c）。與角質(zhì)細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)一致，PP中呈現(xiàn)出IFN特征的T細(xì)胞比例增加，表明在銀屑病皮膚中，強(qiáng)烈的IFN反應(yīng)不僅影響角質(zhì)細(xì)胞，還影響其他細(xì)胞類型。我們檢查了之前報(bào)道與銀屑病有關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)IL17A、IL17F、IL26、CCL20、CXCL13、IL22和IL23R專門(mén)由Tc17細(xì)胞表達(dá)。傳統(tǒng)上，認(rèn)為產(chǎn)生IL-17的T細(xì)胞主要是CD4+ T細(xì)胞，然而最近的觀察為銀屑病中產(chǎn)生IL-17的CD8+ T細(xì)胞提供了越來(lái)越多的證據(jù)。從皮膚中鑒定到CD4+和CD8+ T細(xì)胞使得我們能夠直接比較這些T細(xì)胞亞群及其在銀屑病皮膚中對(duì)IL-17反應(yīng)的貢獻(xiàn)。在這里，我們的數(shù)據(jù)表明CD8+ T細(xì)胞是銀屑病中IL17A的主要來(lái)源。為了進(jìn)一步表征這一點(diǎn)，我們檢查了IL17A與CD4、CD8A和IFNG的共表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)IL17A表達(dá)細(xì)胞與CD8A和IFNG表達(dá)細(xì)胞呈正相關(guān)，但很少觀察到CD4+ IL17A+細(xì)胞（圖5d）。此外，我們的數(shù)據(jù)表明，IL17A產(chǎn)生的T細(xì)胞數(shù)量比IL17F產(chǎn)生的多，盡管大部分細(xì)胞同時(shí)表達(dá)這兩個(gè)因子（圖5f）。我們將T細(xì)胞標(biāo)記基因映射到空間測(cè)序樣本中，并揭示出盡管在表皮中鮮有檢測(cè)到IL-17或TNF產(chǎn)生的T細(xì)胞，大部分T細(xì)胞在皮膚真皮表皮交界處檢測(cè)到（圖5e），這一結(jié)果在免疫熒光染色中得到了驗(yàn)證。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)IL-17受體基因（IL17RA）和TNF受體基因（TNFRSF1A）在PP樣本的表皮中高表達(dá)（圖5e），與在角質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的局部細(xì)胞因子反應(yīng)結(jié)果一致。
5、單細(xì)胞RNA測(cè)序確定銀屑病患者獨(dú)特的髓系亞群
為了檢查銀屑病皮膚中髓系細(xì)胞的細(xì)胞異質(zhì)性，我們對(duì)髓系細(xì)胞進(jìn)行了亞群聚類，并注釋了六個(gè)髓系亞群：朗格漢斯細(xì)胞（LC；CD207和CD1A）、經(jīng)典1型樹(shù)突狀細(xì)胞（cDC1；CLEC9A和IRF8）、經(jīng)典2型樹(shù)突狀細(xì)胞A亞群（cDC2A；LAMP3和CD1B）、經(jīng)典2型樹(shù)突狀細(xì)胞B亞群（cDC2B；CLEC10A和IL1B）、CD16+樹(shù)突狀細(xì)胞（CD16+ DC；FCGR3A和HES1）和周圍血管巨噬細(xì)胞（PVM；CD163和SELENOP）（圖6a、b）。對(duì)每個(gè)亞型的疾病組成分析顯示，在PP中LC的比例減少（圖6c）。先前的研究表明在銀屑病皮膚中LC的遷移和功能受損，我們的分析結(jié)果與此一致，顯示PP中LC的數(shù)量減少。值得注意的是，cDC2A僅來(lái)源于PN和PP皮膚，其中PP皮膚中的數(shù)量更多。先前的研究報(bào)告顯示IL15和IL32在銀屑病中表達(dá)增加，這兩種細(xì)胞因子都作為促炎介質(zhì)，并且主要由cDC2A髓系細(xì)胞表達(dá)（圖6d）。我們還發(fā)現(xiàn)CCL17、CCL19及其受體CCR7主要由cDC2A表達(dá)（圖6d）。抑制CCL19/CCR7軸在病損皮膚中被報(bào)道為T(mén)NF阻斷誘導(dǎo)的銀屑病患者臨床緩解的關(guān)鍵事件。此外，cDC2A高表達(dá)共刺激分子CD200、CD80和CD274，表明這些細(xì)胞可能在銀屑病皮膚中引導(dǎo)和推動(dòng)T細(xì)胞活性和擴(kuò)增（圖6d）。CD16+ DC主要來(lái)源于PP樣本（圖6c）。CD16+ DC具有與cDC2B類似的表達(dá)模式，包括CLEC10A、IL1B和CXCL2，但也表達(dá)FCGR3A（CD16）、CD14和HES1，這表明它們可能起源于循環(huán)CD14+ CD16+單核細(xì)胞（圖6b）。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)CXCL9和CXCL10主要由CD16+ DC表達(dá)，這兩種趨化因子已被證明通過(guò)STAT1、STAT4和STAT5激活驅(qū)動(dòng)效應(yīng)性Th1/Th17細(xì)胞極化（圖6b）。這些數(shù)據(jù)在銀屑病和正常皮膚中通過(guò)免疫組織化學(xué)染色得到驗(yàn)證，并顯示了這些亞群在銀屑病皮膚中的不同定位，CLEC9A和LAMP3主要定位于真皮中的淋巴樣結(jié)構(gòu)中，CLEC10A和CD16主要位于真皮乳頭的頂部（圖6e）。在正常皮膚中找不到LAMP3+和CD16+細(xì)胞。PVM位于真皮乳頭的周血管位置，而LC主要位于真皮乳頭的真皮-表皮交界處（圖6e）。
6、單細(xì)胞RNA測(cè)序突出銀屑病相關(guān)遺傳風(fēng)險(xiǎn)變異的細(xì)胞類型特異性
為了確定與銀屑病相關(guān)的遺傳變異相關(guān)的基因及其細(xì)胞位置，我們檢查了GWAS在銀屑病中檢測(cè)到的65個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)。使用人體皮膚的表達(dá)定量性狀位點(diǎn)（eQTL）數(shù)據(jù)庫(kù)，共鑒定了與這些SNP相關(guān)的46個(gè)基因。為了增加與SNP位點(diǎn)相關(guān)的基因數(shù)量，我們還考慮了人類基因組中與SNP位點(diǎn)最近的基因，共得到65個(gè)相關(guān)基因。在去除低表達(dá)基因后，我們得到27個(gè)與eQTL相關(guān)的基因和57個(gè)最近基因。我們計(jì)算了這些基因在NS、PN和PP中每個(gè)細(xì)胞類型中的平均表達(dá)，并確定了表達(dá)每個(gè)基因的細(xì)胞類型。值得注意的結(jié)果包括C1orf68基因在角質(zhì)細(xì)胞中的主要表達(dá)，且從NS到PN再到PP呈遞減趨勢(shì)。IL23R基因在PN和PP的T細(xì)胞中主要表達(dá)，已被證明促進(jìn)銀屑病中的IL-17反應(yīng)。這些結(jié)果為功能研究提供了寶貴的資源，旨在了解與銀屑病相關(guān)的遺傳位點(diǎn)及其關(guān)鍵細(xì)胞群體的機(jī)制。
7、配體-受體分析顯示銀屑病的細(xì)胞類型特異性網(wǎng)絡(luò)
鑒于觀察到與健康皮膚相比，銀屑病皮膚中的細(xì)胞類型和亞型組成發(fā)生了變化，我們分析了隨著銀屑病的發(fā)展細(xì)胞間的相互通訊如何改變。為此，我們首先進(jìn)一步對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和黑素細(xì)胞進(jìn)行了亞群聚，并分別使用CellPhoneDB在NS特定的亞群聚和PP特定的亞群聚上進(jìn)行配體-受體分析。為評(píng)估銀屑病中發(fā)生的變化，我們分析了在PP中與NS相比具有更高相互作用分?jǐn)?shù)的配體-受體對(duì)。在銀屑病皮膚中，配體-受體對(duì)變化最多的細(xì)胞類型有四種：角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、髓樣細(xì)胞和T細(xì)胞（圖7a）。我們認(rèn)為空間位置上的鄰近性將促進(jìn)細(xì)胞間的通訊。為此，我們統(tǒng)計(jì)了每對(duì)細(xì)胞類型的相鄰斑點(diǎn)數(shù)，如散點(diǎn)-餅圖所示（圖7b）。結(jié)果表明，角質(zhì)細(xì)胞具有最多的免疫細(xì)胞鄰居（T細(xì)胞和髓樣細(xì)胞），成纖維細(xì)胞分布在許多其他細(xì)胞類型中，內(nèi)皮細(xì)胞與免疫細(xì)胞相鄰（圖7c）。通過(guò)匯總配體-受體對(duì)變化的數(shù)量和空間鄰近性分析，我們將分析重點(diǎn)放在角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、髓樣細(xì)胞和T細(xì)胞之間的相互作用上。
值得注意的是，角質(zhì)細(xì)胞預(yù)測(cè)的相互作用包括CCL2和CCL7與髓樣細(xì)胞中的CCR2的相互作用，CCL20與髓樣細(xì)胞和T細(xì)胞中的CCR6和IL7與IL7R的相互作用，以及類胰島素生長(zhǎng)因子家族配體（IGFL1、IGFL2、IGFL3）與其受體（IGFLR1）在T細(xì)胞上的相互作用（圖7d），這表明角質(zhì)細(xì)胞在調(diào)控銀屑病中的免疫反應(yīng)中起著重要作用。此外，角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)了血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGFA、PDGFC）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGFB1）、表皮生長(zhǎng)因子（TGFA）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGFA、VEGFB），這些因子能夠與成纖維細(xì)胞上的相應(yīng)受體發(fā)生相互作用（圖7d）。
令人驚訝的是，成纖維細(xì)胞通過(guò)推測(cè)的配體-受體相互作用與許多細(xì)胞類型相連接。成纖維細(xì)胞產(chǎn)生了許多趨化因子（CCL13、CCL19、CCL2、CCL8、CXCL1、CXCL12、CXCL2、CXCL3），與髓樣細(xì)胞和T細(xì)胞表達(dá)的受體相結(jié)合，提示成纖維細(xì)胞在銀屑病中招募免疫細(xì)胞方面起著重要作用（圖7e）。成纖維細(xì)胞還產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-7和IL-15，與T細(xì)胞上的IL-7受體和IL-15受體相互作用，促進(jìn)T細(xì)胞增殖和成熟。成纖維細(xì)胞通過(guò)表達(dá)與其受體結(jié)合的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF10、FGF2、FGF7），具有誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增殖的能力。我們通過(guò)免疫組織化學(xué)（IHC）在銀屑病斑塊皮膚中驗(yàn)證了成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF2和FGF7以及它們的受體FGFR2和FGFR3的表達(dá)。
髓樣細(xì)胞表達(dá)多種趨化因子，進(jìn)一步促進(jìn)其他白細(xì)胞向銀屑病部位的招募（圖7f）。這些趨化因子還與角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá)的非典型趨化因子受體（ACKR2、ACKR3、ACKR4）相互作用，引發(fā)過(guò)度的Th17反應(yīng)并放大皮膚炎癥。此外，髓樣細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子（IL15、IL1A、IL1B、IL6）抑制角質(zhì)細(xì)胞的凋亡。T細(xì)胞表達(dá)與角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá)的非典型趨化因子受體相互作用的細(xì)胞因子（CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL5、CXCL13）（圖7g）。此外，T細(xì)胞表達(dá)的IL17A、IL17F和IL22與髓樣細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合，已知在銀屑病中促進(jìn)炎癥。
因此，通過(guò)整合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)、上游調(diào)節(jié)因子分析、配體-受體結(jié)果以及不同細(xì)胞類型的空間位置，我們能夠創(chuàng)建一個(gè)突出成纖維細(xì)胞在銀屑病皮膚中作用的模型。在銀屑病中，SFRP2+成纖維細(xì)胞從纖維化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檠装Y狀態(tài)。這些炎癥性成纖維細(xì)胞表達(dá)CCL13和CCL19，能夠招募表達(dá)相關(guān)趨化因子受體的細(xì)胞：CCR2+髓樣細(xì)胞和CCR7+LAMP3+經(jīng)典型2型樹(shù)突狀細(xì)胞A。這些炎癥性成纖維細(xì)胞還高水平表達(dá)CXCL1，已知能夠招募中性粒細(xì)胞，以及CXCL12，已知能夠招募CXCR4+Tc17細(xì)胞。CXCL12還可以通過(guò)其在表皮上的受體CXCR4作用誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞增殖。在表皮中，Tc17分泌的IL-17引發(fā)炎癥，通過(guò)上皮角質(zhì)層內(nèi)的IL-36循環(huán)進(jìn)一步放大，觸發(fā)CCL20的釋放，CCL20可以招募CCR6+Tc17以及CXCL1和CXCL8可以招募中性粒細(xì)胞，與上皮角質(zhì)層中的微膿腫一致。
實(shí)驗(yàn)方法
免疫組織化學(xué)、scRNA-seq、Seurat、亞型細(xì)分、擬時(shí)序分析、銀屑病相關(guān)遺傳風(fēng)險(xiǎn)變異分析、配體-受體相互作用分析、Spatial-seq、CRISPR/Cas9、qRT-PCR、Seq-Scope樣品處理和分。
參考文獻(xiàn)
Ma, F., Plazyo, O., Billi, A.C. et al. Single cell and spatial sequencing define processes by which keratinocytes and fibroblasts amplify inflammatory responses in psoriasis. Nat Commun 14, 3455 (2023).