m6A甲基化閱讀器IGF2BP2促進(jìn)肺腺癌血管生成和轉(zhuǎn)移

       肺腺癌(LUAD)是一種常見的肺癌類型，具有較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，但轉(zhuǎn)移的確切分子機(jī)制尚不清楚。我們構(gòu)建了來自原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性LUAD的93,610個(gè)細(xì)胞的總體單細(xì)胞景觀，發(fā)現(xiàn)IGF2BP2在LUAD細(xì)胞亞群(稱為LUAD_IGF2BP2)和內(nèi)皮細(xì)胞亞群(稱為En_IGF2BP2)中都有特異性表達(dá)。LUAD_IGF2BP2亞群在轉(zhuǎn)移進(jìn)化過程中逐漸形成并主導(dǎo)轉(zhuǎn)移性LUAD的生態(tài)。IGF2BP2優(yōu)先由LUAD_IGF2BP2亞群中的外泌體分泌，在腫瘤微環(huán)境中被En_IGF2BP2亞群吸收。隨后，IGF2BP2通過m6A修飾提高FLT4的RNA穩(wěn)定性，從而激活PI3K-Akt信號(hào)通路，最終促進(jìn)血管生成和轉(zhuǎn)移。臨床數(shù)據(jù)分析顯示，IGF2BP2與LUAD患者較差的總生存期和無復(fù)發(fā)生存期有關(guān)。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)為原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性LUAD的多細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)提供了新的見解，并證明了特定的LUAD_IGF2BP2亞群是促進(jìn)血管生成和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵協(xié)調(diào)者，對(duì)LUAD轉(zhuǎn)移進(jìn)化的基因調(diào)控機(jī)制具有意義，代表它們是潛在的抗血管生成靶點(diǎn)。本文于2023年6月發(fā)表于“Molecular Cancer”（IF=37.3）上。
技術(shù)路線

結(jié)果
1）原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性LUAD的單細(xì)胞景觀
       在本研究中，CD34的表達(dá)被用來表征腫瘤血管生成的病理狀態(tài)。免疫熒光結(jié)果顯示，CD34在轉(zhuǎn)移性LUAD中的表達(dá)高于原發(fā)性LUAD(圖1A)。本研究的分析流程如圖1B所示。我們從GSE131907數(shù)據(jù)集中獲得了11個(gè)遠(yuǎn)端正常肺組織、11個(gè)原發(fā)性LUAD組織和4個(gè)轉(zhuǎn)移性LUAD組織的scRNA-seq數(shù)據(jù)，以進(jìn)一步探索原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性LUAD的生態(tài)圖譜。經(jīng)過數(shù)據(jù)預(yù)處理和質(zhì)量控制，共捕獲93,610個(gè)優(yōu)質(zhì)單細(xì)胞，并將其聚類為19種細(xì)胞類型，包括LUAD細(xì)胞(LUAD)、內(nèi)皮細(xì)胞(En)、巨噬細(xì)胞(Mac)等(圖1C)。在細(xì)胞簇中陽性表達(dá)的標(biāo)記與近期scRNA-seq和實(shí)驗(yàn)室研究等發(fā)表的基因特征一致，也與相應(yīng)細(xì)胞的表型特征一致(圖1D)。LUAD腫瘤細(xì)胞發(fā)生多重或低拷貝數(shù)事件(圖1E)。進(jìn)一步的分析顯示，轉(zhuǎn)移性LUAD代表了一個(gè)不同于對(duì)照肺和原發(fā)性LUAD的多細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)(圖1F)。值得注意的是，在轉(zhuǎn)移性LUAD中觀察到LUAD細(xì)胞豐度的急劇增加。綜上所述，我們通過單細(xì)胞分析初步構(gòu)建了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性LUAD的總體單細(xì)胞景觀，并探索了不同樣本類型中細(xì)胞生態(tài)的改變。

2）轉(zhuǎn)移性LUAD腫瘤細(xì)胞的克隆進(jìn)化軌跡
       腫瘤細(xì)胞的克隆進(jìn)化過程往往是腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵。因此，為了探索轉(zhuǎn)移性LUAD細(xì)胞的克隆進(jìn)化軌跡，我們首先分析了LUAD細(xì)胞的類型。值得注意的是，與原發(fā)性腫瘤相比，LUAD細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性LUAD中非常豐富，因此我們對(duì)LUAD細(xì)胞進(jìn)行了亞群分析，并構(gòu)建了單細(xì)胞圖譜(圖2A)。在探索原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性LUAD中LUAD細(xì)胞亞群的細(xì)胞生態(tài)學(xué)中，LUAD_FAM83A和LUAD_IGF2BP2亞群的豐度在轉(zhuǎn)移性LUAD中明顯高于原發(fā)腫瘤(圖2B)。隨后在單細(xì)胞譜中證實(shí)了FAM83A和IGF2BP2的表達(dá)(圖2C)，熒光結(jié)果證明IGF2BP2在CD34高表達(dá)的LUAD腫瘤中的表達(dá)明顯高于CD34低表達(dá)的LUAD腫瘤(圖2D)，揭示了IGF2BP2與血管生成之間的密切關(guān)系。為了進(jìn)一步探索潛在的轉(zhuǎn)移分子機(jī)制，我們鑒定了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性LUAD之間LUAD細(xì)胞亞群中的DEGs(圖2E)。根據(jù)LUAD細(xì)胞的擬時(shí)間軌跡分析(圖2F)，確定了從原發(fā)性LUAD到轉(zhuǎn)移性LUAD的進(jìn)化趨勢，這表明LUAD細(xì)胞亞群從原發(fā)性LUAD到自然選擇和轉(zhuǎn)移性疾病的潛在結(jié)構(gòu)變化(圖2G)。通過功能富集分析，探索了所提出的與時(shí)間相關(guān)的DEGs所涉及的信號(hào)通路和生物學(xué)功能。LUAD_IGF2BP2亞群通過囊泡合成和信號(hào)分泌顯著富集(圖2H)。綜上所述，本研究推斷了轉(zhuǎn)移性LUAD細(xì)胞亞群的起源和克隆進(jìn)化軌跡，鑒定了參與進(jìn)化過程的基因及其生物學(xué)功能。

3）轉(zhuǎn)移性LUAD的內(nèi)皮細(xì)胞景觀
       癌癥進(jìn)展的特點(diǎn)是內(nèi)皮細(xì)胞的激活，這反過來又促進(jìn)了腫瘤血管生成。因此，在單細(xì)胞圖譜中鑒定了內(nèi)皮細(xì)胞亞群(圖3A)，并且在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性LUAD中觀察到每個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞亞群的獨(dú)特細(xì)胞生態(tài)。值得注意的是，在原發(fā)性LUAD向轉(zhuǎn)移的過程中，En_S100A9、En_ KRT19和En_IGF2BP2亞群顯著增加(圖3B)。IGF2BP2在LUAD_IGF2BP2和En_IGF2BP2亞群中同時(shí)表達(dá)(圖3C、D)，表明這兩個(gè)亞群之間存在相互作用。隨后，LUAD_IGF2BP2和En_IGF2BP2亞群共享的標(biāo)記基因被進(jìn)一步鑒定，包括IGF2BP2、IGF2BP3、SOX4、ID1、WASF2、ADGRG6和FKBP1A(圖3E)。富集分析(圖3F、G)顯示，這些特定的細(xì)胞亞群表現(xiàn)出重要的生物功能激活，如內(nèi)吞作用。進(jìn)一步的GSEA分析顯示，血管生成、外泌體、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和m6A在特定細(xì)胞亞群中顯著富集(圖3H)。基于這些發(fā)現(xiàn)，我們初步構(gòu)建了轉(zhuǎn)移性LUAD的內(nèi)皮細(xì)胞景觀。

4）靶向IGF2BP2可減輕LUAD細(xì)胞的遷移、侵襲和血管生成
       接下來，我們研究了IGF2BP2對(duì)LUAD細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。為了實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，我們?cè)O(shè)計(jì)了3種靶向IGF2BP2的特異性siRNA，其中si-IGF2BP2#1對(duì)A549和NCI-H1299細(xì)胞的干擾效果最佳(圖4A-C)。根據(jù)傷口愈合實(shí)驗(yàn)，si-IGF2BP2顯著降低了A549和NCI-H1299細(xì)胞的遷移(圖4D-F)。此外，我們的transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，si-IGF2BP2顯著抑制A549和NCI-H1299細(xì)胞的侵襲(圖4G, H)。將si-IGF2BP2轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs后，分支點(diǎn)和毛細(xì)血管長度都顯著減弱(圖4I-K)，表明LUAD細(xì)胞中IGF2BP2的下調(diào)抑制了血管生成。

5）LUAD細(xì)胞來源的外泌體介導(dǎo)IGF2BP2轉(zhuǎn)移到微環(huán)境內(nèi)皮細(xì)胞，激活PI3K-Akt信號(hào)，促進(jìn)血管生成
       我們的上述研究表明轉(zhuǎn)移性LUAD可能通過外泌體實(shí)現(xiàn)血管生成。因此，為了研究LUAD細(xì)胞源性外泌體在腫瘤微環(huán)境中向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制，我們構(gòu)建了血管生成特異性生態(tài)型的總體調(diào)控格局，并獲得了從LUAD_IGF2BP2到En_IGF2BP2亞群的綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖5A)。隨后，外泌體標(biāo)記基因(CD9、CD63、TSG01和CD81)均在所有LUAD亞群中高表達(dá)。證實(shí)了LUAD細(xì)胞中外泌體的形成(圖5B)。結(jié)合IGF2BP2在LUAD_IGF2BP2和En_IGF2BP2亞群中的表達(dá)，推斷LUAD細(xì)胞來源的外泌體IGF2BP2細(xì)胞內(nèi)化進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞。此外，研究發(fā)現(xiàn)，在En_IGF2BP2亞群中激活了LUAD血管生成和轉(zhuǎn)移的PI3K-Akt信號(hào)通路(圖5C)。這些結(jié)果表明LUAD細(xì)胞可能將外泌體IGF2BP2傳遞給內(nèi)皮細(xì)胞，激活PI3K-Akt信號(hào)，最終促進(jìn)血管生成。

6）IGF2BP2介導(dǎo)FLT4的m6A修飾，激活PI3K-Akt信號(hào)通路
       我們進(jìn)一步探討IGF2BP2如何激活PI3K-Akt信號(hào)從而促進(jìn)血管生成。FLT4被確定為IGF2BP2可能靶向激活PI3K-Akt信號(hào)通路的基因。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，CD34高表達(dá)的LUAD樣本局灶內(nèi)皮細(xì)胞中FLT4的RNA水平(圖6A)和蛋白水平(圖6B)明顯高于CD34低表達(dá)的LUAD樣本。通過分子對(duì)接預(yù)測了IGF2BP2蛋白與FLT4 mRNA的結(jié)合潛力，對(duì)接能量為-750 kj/mol，表明兩者之間有很大的靶向結(jié)合潛力(圖6C)。多重免疫熒光也顯示了FLT4 RNA與IGF2BP2蛋白的共表達(dá)(圖6D)。IGF2BP2的敲低顯著降低了A549和NCI-H1299細(xì)胞中FLT4的m6A水平(圖6E, F)。在IGF2BP2敲除的A549和NCI-H1299細(xì)胞中，F(xiàn)LT4蛋白水平顯著下調(diào)(圖6G-J)。這說明IGF2BP2可以通過介導(dǎo)FLT4的m6A修飾而上調(diào)FLT4的表達(dá)。此外，IGF2BP2敲低的A549和NCI-H1299細(xì)胞中PI3K和AKT蛋白水平顯著降低(圖6K, L)，表明IGF2BP2參與了PI3K-AKT信號(hào)通路的激活。這些結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)移性LUAD的克隆進(jìn)化過程中，IGF2BP2過表達(dá)的LUAD細(xì)胞亞群將IGF2BP2擴(kuò)散到腫瘤微環(huán)境中，并通過細(xì)胞內(nèi)化被內(nèi)皮細(xì)胞吸收，進(jìn)而通過m6A修飾增強(qiáng)FLT4的RNA穩(wěn)定性，從而激活PI3K-Akt信號(hào)通路，促進(jìn)血管生成(圖6M)。

7）基于IGF2BP2的LUAD預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)的構(gòu)建
       我們進(jìn)一步構(gòu)建了IGF2BP2-FLT4-PI3K-Akt信號(hào)通路-血管生成的總體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖7A)。然后評(píng)估這些網(wǎng)絡(luò)基因預(yù)測LUAD預(yù)后的潛力。在TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集中探討了關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)基因與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)它們與臨床參數(shù)，特別是OS和無復(fù)發(fā)生存率(RFS)顯著相關(guān)(圖7B)?；陉P(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)基因(包括IGF2BP2、FLT1、FLT4、PIK3R3、PIK3CB和PIK3CD)，建立了基于IGF2BP2的多變量cox回歸模型，即基于IGF2BP2的預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)。并根據(jù)中位值將患者分為低、高分組。生存分析顯示，低評(píng)分組的OS和RFS結(jié)果明顯優(yōu)于高評(píng)分組(圖7C, D)。時(shí)間無關(guān)的ROC曲線顯示了該模型在預(yù)測OS和RFS方面的出色性能(圖7E)?；贗GF2BP2的預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)在外部驗(yàn)證數(shù)據(jù)集(GSE72094)中得到了驗(yàn)證(圖7F, G)。結(jié)合單變量和多變量cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)基于IGF2BP2的模型和分期是LUAD預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(圖H, I)。我們建立了包含兩個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素的nomogram(圖7J)。校準(zhǔn)曲線表明，nomogram可以準(zhǔn)確預(yù)測1年、3年和5年的OS結(jié)果(圖7K-M)。這些結(jié)果表明IGF2BP2-FLT4-PI3K-Akt信號(hào)-血管生成網(wǎng)絡(luò)在LUAD預(yù)后中起著至關(guān)重要的作用，為LUAD患者的準(zhǔn)確風(fēng)險(xiǎn)分層提供了理論依據(jù)。

結(jié)論
       本研究通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析構(gòu)建了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性LUAD的總體單細(xì)胞格局，揭示了基于IGF2BP2的LUAD血管生成和轉(zhuǎn)移機(jī)制，為闡明LUAD轉(zhuǎn)移的相關(guān)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)和分子特征提供了機(jī)會(huì)。

實(shí)驗(yàn)方法
免疫熒光，原位雜交，單細(xì)胞測序分析，RT?qPCR，傷口愈合試驗(yàn)，transwell，管形成實(shí)驗(yàn)，MeRIP?qPCR，WB。
參考文獻(xiàn)
Fang H, Sun Q, Zhou J, Zhang H, Song Q, Zhang H, Yu G, Guo Y, Huang C, Mou Y, Jia C, Song Y, Liu A, Song K, Lu C, Tian R, Wei S, Yang D, Chen Y, Li T, Wang K, Yu Y, Lv Y, Mo K, Sun P, Yu X, Song X. m6A methylation reader IGF2BP2 activates endothelial cells to promote angiogenesis and metastasis of lung adenocarcinoma. Mol Cancer. 2023 Jun 23;22(1):99. doi: 10.1186/s12943-023-01791-1.