m6A甲基化閱讀器IGF2BP2促進肺腺癌血管生成和轉移

       肺腺癌(LUAD)是一種常見的肺癌類型，具有較高的轉移風險，但轉移的確切分子機制尚不清楚。我們構建了來自原發(fā)性和轉移性LUAD的93,610個細胞的總體單細胞景觀，發(fā)現(xiàn)IGF2BP2在LUAD細胞亞群(稱為LUAD_IGF2BP2)和內皮細胞亞群(稱為En_IGF2BP2)中都有特異性表達。LUAD_IGF2BP2亞群在轉移進化過程中逐漸形成并主導轉移性LUAD的生態(tài)。IGF2BP2優(yōu)先由LUAD_IGF2BP2亞群中的外泌體分泌，在腫瘤微環(huán)境中被En_IGF2BP2亞群吸收。隨后，IGF2BP2通過m6A修飾提高FLT4的RNA穩(wěn)定性，從而激活PI3K-Akt信號通路，最終促進血管生成和轉移。臨床數(shù)據(jù)分析顯示，IGF2BP2與LUAD患者較差的總生存期和無復發(fā)生存期有關?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)為原發(fā)性和轉移性LUAD的多細胞生態(tài)系統(tǒng)提供了新的見解，并證明了特定的LUAD_IGF2BP2亞群是促進血管生成和轉移的關鍵協(xié)調者，對LUAD轉移進化的基因調控機制具有意義，代表它們是潛在的抗血管生成靶點。本文于2023年6月發(fā)表于“Molecular Cancer”（IF=37.3）上。
技術路線

結果
1）原發(fā)性和轉移性LUAD的單細胞景觀
       在本研究中，CD34的表達被用來表征腫瘤血管生成的病理狀態(tài)。免疫熒光結果顯示，CD34在轉移性LUAD中的表達高于原發(fā)性LUAD(圖1A)。本研究的分析流程如圖1B所示。我們從GSE131907數(shù)據(jù)集中獲得了11個遠端正常肺組織、11個原發(fā)性LUAD組織和4個轉移性LUAD組織的scRNA-seq數(shù)據(jù)，以進一步探索原發(fā)性和轉移性LUAD的生態(tài)圖譜。經(jīng)過數(shù)據(jù)預處理和質量控制，共捕獲93,610個優(yōu)質單細胞，并將其聚類為19種細胞類型，包括LUAD細胞(LUAD)、內皮細胞(En)、巨噬細胞(Mac)等(圖1C)。在細胞簇中陽性表達的標記與近期scRNA-seq和實驗室研究等發(fā)表的基因特征一致，也與相應細胞的表型特征一致(圖1D)。LUAD腫瘤細胞發(fā)生多重或低拷貝數(shù)事件(圖1E)。進一步的分析顯示，轉移性LUAD代表了一個不同于對照肺和原發(fā)性LUAD的多細胞生態(tài)系統(tǒng)(圖1F)。值得注意的是，在轉移性LUAD中觀察到LUAD細胞豐度的急劇增加。綜上所述，我們通過單細胞分析初步構建了原發(fā)性和轉移性LUAD的總體單細胞景觀，并探索了不同樣本類型中細胞生態(tài)的改變。

2）轉移性LUAD腫瘤細胞的克隆進化軌跡
       腫瘤細胞的克隆進化過程往往是腫瘤發(fā)展的關鍵。因此，為了探索轉移性LUAD細胞的克隆進化軌跡，我們首先分析了LUAD細胞的類型。值得注意的是，與原發(fā)性腫瘤相比，LUAD細胞在轉移性LUAD中非常豐富，因此我們對LUAD細胞進行了亞群分析，并構建了單細胞圖譜(圖2A)。在探索原發(fā)性和轉移性LUAD中LUAD細胞亞群的細胞生態(tài)學中，LUAD_FAM83A和LUAD_IGF2BP2亞群的豐度在轉移性LUAD中明顯高于原發(fā)腫瘤(圖2B)。隨后在單細胞譜中證實了FAM83A和IGF2BP2的表達(圖2C)，熒光結果證明IGF2BP2在CD34高表達的LUAD腫瘤中的表達明顯高于CD34低表達的LUAD腫瘤(圖2D)，揭示了IGF2BP2與血管生成之間的密切關系。為了進一步探索潛在的轉移分子機制，我們鑒定了原發(fā)性和轉移性LUAD之間LUAD細胞亞群中的DEGs(圖2E)。根據(jù)LUAD細胞的擬時間軌跡分析(圖2F)，確定了從原發(fā)性LUAD到轉移性LUAD的進化趨勢，這表明LUAD細胞亞群從原發(fā)性LUAD到自然選擇和轉移性疾病的潛在結構變化(圖2G)。通過功能富集分析，探索了所提出的與時間相關的DEGs所涉及的信號通路和生物學功能。LUAD_IGF2BP2亞群通過囊泡合成和信號分泌顯著富集(圖2H)。綜上所述，本研究推斷了轉移性LUAD細胞亞群的起源和克隆進化軌跡，鑒定了參與進化過程的基因及其生物學功能。

3）轉移性LUAD的內皮細胞景觀
       癌癥進展的特點是內皮細胞的激活，這反過來又促進了腫瘤血管生成。因此，在單細胞圖譜中鑒定了內皮細胞亞群(圖3A)，并且在原發(fā)性和轉移性LUAD中觀察到每個內皮細胞亞群的獨特細胞生態(tài)。值得注意的是，在原發(fā)性LUAD向轉移的過程中，En_S100A9、En_ KRT19和En_IGF2BP2亞群顯著增加(圖3B)。IGF2BP2在LUAD_IGF2BP2和En_IGF2BP2亞群中同時表達(圖3C、D)，表明這兩個亞群之間存在相互作用。隨后，LUAD_IGF2BP2和En_IGF2BP2亞群共享的標記基因被進一步鑒定，包括IGF2BP2、IGF2BP3、SOX4、ID1、WASF2、ADGRG6和FKBP1A(圖3E)。富集分析(圖3F、G)顯示，這些特定的細胞亞群表現(xiàn)出重要的生物功能激活，如內吞作用。進一步的GSEA分析顯示，血管生成、外泌體、上皮間質轉化(EMT)和m6A在特定細胞亞群中顯著富集(圖3H)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們初步構建了轉移性LUAD的內皮細胞景觀。

4）靶向IGF2BP2可減輕LUAD細胞的遷移、侵襲和血管生成
       接下來，我們研究了IGF2BP2對LUAD細胞生物學行為的影響。為了實現(xiàn)瞬時轉染，我們設計了3種靶向IGF2BP2的特異性siRNA，其中si-IGF2BP2#1對A549和NCI-H1299細胞的干擾效果最佳(圖4A-C)。根據(jù)傷口愈合實驗，si-IGF2BP2顯著降低了A549和NCI-H1299細胞的遷移(圖4D-F)。此外，我們的transwell實驗結果表明，si-IGF2BP2顯著抑制A549和NCI-H1299細胞的侵襲(圖4G, H)。將si-IGF2BP2轉染的A549細胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs后，分支點和毛細血管長度都顯著減弱(圖4I-K)，表明LUAD細胞中IGF2BP2的下調抑制了血管生成。

5）LUAD細胞來源的外泌體介導IGF2BP2轉移到微環(huán)境內皮細胞，激活PI3K-Akt信號，促進血管生成
       我們的上述研究表明轉移性LUAD可能通過外泌體實現(xiàn)血管生成。因此，為了研究LUAD細胞源性外泌體在腫瘤微環(huán)境中向內皮細胞轉移的機制，我們構建了血管生成特異性生態(tài)型的總體調控格局，并獲得了從LUAD_IGF2BP2到En_IGF2BP2亞群的綜合調控網(wǎng)絡(圖5A)。隨后，外泌體標記基因(CD9、CD63、TSG01和CD81)均在所有LUAD亞群中高表達。證實了LUAD細胞中外泌體的形成(圖5B)。結合IGF2BP2在LUAD_IGF2BP2和En_IGF2BP2亞群中的表達，推斷LUAD細胞來源的外泌體IGF2BP2細胞內化進入內皮細胞。此外，研究發(fā)現(xiàn)，在En_IGF2BP2亞群中激活了LUAD血管生成和轉移的PI3K-Akt信號通路(圖5C)。這些結果表明LUAD細胞可能將外泌體IGF2BP2傳遞給內皮細胞，激活PI3K-Akt信號，最終促進血管生成。

6）IGF2BP2介導FLT4的m6A修飾，激活PI3K-Akt信號通路
       我們進一步探討IGF2BP2如何激活PI3K-Akt信號從而促進血管生成。FLT4被確定為IGF2BP2可能靶向激活PI3K-Akt信號通路的基因。免疫熒光實驗顯示，CD34高表達的LUAD樣本局灶內皮細胞中FLT4的RNA水平(圖6A)和蛋白水平(圖6B)明顯高于CD34低表達的LUAD樣本。通過分子對接預測了IGF2BP2蛋白與FLT4 mRNA的結合潛力，對接能量為-750 kj/mol，表明兩者之間有很大的靶向結合潛力(圖6C)。多重免疫熒光也顯示了FLT4 RNA與IGF2BP2蛋白的共表達(圖6D)。IGF2BP2的敲低顯著降低了A549和NCI-H1299細胞中FLT4的m6A水平(圖6E, F)。在IGF2BP2敲除的A549和NCI-H1299細胞中，F(xiàn)LT4蛋白水平顯著下調(圖6G-J)。這說明IGF2BP2可以通過介導FLT4的m6A修飾而上調FLT4的表達。此外，IGF2BP2敲低的A549和NCI-H1299細胞中PI3K和AKT蛋白水平顯著降低(圖6K, L)，表明IGF2BP2參與了PI3K-AKT信號通路的激活。這些結果表明，在轉移性LUAD的克隆進化過程中，IGF2BP2過表達的LUAD細胞亞群將IGF2BP2擴散到腫瘤微環(huán)境中，并通過細胞內化被內皮細胞吸收，進而通過m6A修飾增強FLT4的RNA穩(wěn)定性，從而激活PI3K-Akt信號通路，促進血管生成(圖6M)。

7）基于IGF2BP2的LUAD預后評分系統(tǒng)的構建
       我們進一步構建了IGF2BP2-FLT4-PI3K-Akt信號通路-血管生成的總體調控網(wǎng)絡(圖7A)。然后評估這些網(wǎng)絡基因預測LUAD預后的潛力。在TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集中探討了關鍵網(wǎng)絡基因與臨床指標的相關性，發(fā)現(xiàn)它們與臨床參數(shù)，特別是OS和無復發(fā)生存率(RFS)顯著相關(圖7B)?；陉P鍵網(wǎng)絡基因(包括IGF2BP2、FLT1、FLT4、PIK3R3、PIK3CB和PIK3CD)，建立了基于IGF2BP2的多變量cox回歸模型，即基于IGF2BP2的預后評分系統(tǒng)。并根據(jù)中位值將患者分為低、高分組。生存分析顯示，低評分組的OS和RFS結果明顯優(yōu)于高評分組(圖7C, D)。時間無關的ROC曲線顯示了該模型在預測OS和RFS方面的出色性能(圖7E)?；贗GF2BP2的預后評分系統(tǒng)在外部驗證數(shù)據(jù)集(GSE72094)中得到了驗證(圖7F, G)。結合單變量和多變量cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)基于IGF2BP2的模型和分期是LUAD預后的獨立危險因素(圖H, I)。我們建立了包含兩個獨立危險因素的nomogram(圖7J)。校準曲線表明，nomogram可以準確預測1年、3年和5年的OS結果(圖7K-M)。這些結果表明IGF2BP2-FLT4-PI3K-Akt信號-血管生成網(wǎng)絡在LUAD預后中起著至關重要的作用，為LUAD患者的準確風險分層提供了理論依據(jù)。

結論
       本研究通過單細胞轉錄組學分析構建了原發(fā)性和轉移性LUAD的總體單細胞格局，揭示了基于IGF2BP2的LUAD血管生成和轉移機制，為闡明LUAD轉移的相關細胞動力學和分子特征提供了機會。

實驗方法
免疫熒光，原位雜交，單細胞測序分析，RT?qPCR，傷口愈合試驗，transwell，管形成實驗，MeRIP?qPCR，WB。
參考文獻
Fang H, Sun Q, Zhou J, Zhang H, Song Q, Zhang H, Yu G, Guo Y, Huang C, Mou Y, Jia C, Song Y, Liu A, Song K, Lu C, Tian R, Wei S, Yang D, Chen Y, Li T, Wang K, Yu Y, Lv Y, Mo K, Sun P, Yu X, Song X. m6A methylation reader IGF2BP2 activates endothelial cells to promote angiogenesis and metastasis of lung adenocarcinoma. Mol Cancer. 2023 Jun 23;22(1):99. doi: 10.1186/s12943-023-01791-1.