動(dòng)脈粥樣硬化的”元兇“--GSDME介導(dǎo)的焦亡

       動(dòng)脈粥樣硬化是一種進(jìn)行性炎癥性疾病，其特征是大動(dòng)脈或大動(dòng)脈內(nèi)的脂質(zhì)積聚和細(xì)胞死亡，可導(dǎo)致心臟、大腦和四肢缺血。巨噬細(xì)胞死亡是動(dòng)脈粥樣硬化病變的決定因素。焦亡是一種炎癥性細(xì)胞死亡，能夠促進(jìn)晚期動(dòng)脈粥樣硬化病變，然而，具體的分子機(jī)制尚不完全清楚。在此，作者通過單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）分析發(fā)現(xiàn)GSDME主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，揭示GSDME在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中的轉(zhuǎn)錄機(jī)制，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)GSDME介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，因此，GSDME介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中的焦亡可能是動(dòng)脈粥樣硬化的潛在治療方法。該研究于2023年2月發(fā)表在《Nature Communications》IF:16.6。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1、焦亡與人和小鼠動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)
       為研究動(dòng)脈粥樣硬化的超微結(jié)構(gòu)，作者從接受頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)的患者身上獲得動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織，通過透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞由于高吞噬負(fù)荷而死亡或破碎（圖1a）。病變組織垂死的巨噬細(xì)胞中的溶酶體內(nèi)充滿未完全降解的細(xì)胞殘留物，質(zhì)膜上形成孔（圖1b）。以上結(jié)果說明大部分巨噬細(xì)胞死于細(xì)胞焦亡而非細(xì)胞凋亡。免疫組化結(jié)果顯示，與對(duì)照血管相比，動(dòng)脈粥樣硬化組織IL-1β、caspase3和GSDME表達(dá)水平升高（圖1c）。隨后，作者使用原位鄰近連接技術(shù)觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中GSDME和Caspase3之間的相互作用，并評(píng)估GSDME激活和Caspase3介導(dǎo)的焦亡，發(fā)現(xiàn)總體蛋白相互作用和免疫組織化學(xué)IL-1β染色信號(hào)的分布模式相似（圖1d），說明焦亡可能與炎癥相關(guān)。此外，作者還觀察到在高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE^?/?小鼠中， TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核通常位于主動(dòng)脈根部的動(dòng)脈粥樣硬化病變處。以上結(jié)果共同說明GSDME介導(dǎo)的焦亡參與動(dòng)脈粥樣硬化炎癥。

圖1 人和小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中發(fā)生焦亡

2、GSDME主要在動(dòng)脈粥樣硬化巨噬細(xì)胞中表達(dá)
       為研究人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的轉(zhuǎn)錄組以及GSDME在動(dòng)脈粥樣硬化中的定位，作者對(duì)鈣化或出血的晚期人頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)GSDME主要在M1巨噬細(xì)胞中表達(dá)（圖2a和2b）。GSDME和巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68的共染色的結(jié)果說明GSDME定位在CD68標(biāo)記的巨噬細(xì)胞，與測(cè)序結(jié)果一致（圖2d）。作者對(duì)巨噬細(xì)胞的發(fā)育時(shí)間進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞處于細(xì)胞發(fā)育的后期（圖2c），說明GSDME主要在巨噬細(xì)胞的后期發(fā)揮作用。

圖2 GSDME主要在動(dòng)脈粥樣硬化巨噬細(xì)胞中表達(dá)

3、GSDME在人和小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)增加
       為探索GSDME表達(dá)是否在人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中發(fā)生改變，作者對(duì)GSE43292數(shù)據(jù)庫(kù)中32個(gè)病人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和鄰近正常組織的基因表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GSDME在人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)顯著增加（圖3a）。Western blot結(jié)果表明，與正常血管和早期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊相比，晚期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中完整的GSDME和活化的GSDME（N-GSDME）蛋白水平顯著增加（圖3b）。此外，作者在動(dòng)脈粥樣易硬化易發(fā)的ApoE^?/?小鼠中，發(fā)現(xiàn)在喂食高脂飲食12周后，GSDME的蛋白和mRNA水平顯著升高（圖3c和3d）。與 GSDME mRNA 水平升高一致，ApoE^?/?小鼠主動(dòng)脈促炎基因IL-1β、TNF、MCP-1 和 IL-6 的 mRNA 水平也顯著升高，說明GSDME在調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成方面至關(guān)重要。

圖3 動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)GSDME表達(dá)增加

4、GSDME缺失可減輕ApoE^?/?小鼠飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化
       結(jié)合之前的結(jié)論GSDME在動(dòng)脈粥樣硬化中的表達(dá)增加，作者想知道缺失GSDME是否會(huì)抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。因此，作者設(shè)置ApoE^?/?對(duì)照小鼠和GSDME ^?/?/ApoE^?/?小鼠高脂飲食喂養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)兩組小鼠血清中總膽固醇、HDL（高密度膽固醇）和LDL（低密度膽固醇）水平?jīng)]有明顯差異（圖3a-3c）。但是油紅O染色和HE染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，GSDME ^?/?小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變面積減少28%（圖4d），主動(dòng)脈竇和頭臂動(dòng)脈病變大小和面積也顯著減少（圖4e和4f）。除此之外，作者還發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，GSDME ^?/?小鼠主動(dòng)脈促炎因子TNF，IL-1β，IL-6和MCP-1的mRNA水平顯著降低。綜上所述，說明GSDME缺失減輕ApoE^?/?小鼠飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化和炎癥。

圖4 GSDME缺失減弱動(dòng)脈粥樣硬化病變面積和大小

5、ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中的GSDME表達(dá)和焦亡
       為進(jìn)一步評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化刺激對(duì)體外GSDME表達(dá)的影響，作者將原代腹膜巨噬細(xì)胞（PMs）和骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMDMs）與ox-LDL孵育，在體外模擬動(dòng)脈粥樣硬化的條件。發(fā)現(xiàn)經(jīng)ox-LDL處理后，PMs和BMDMs細(xì)胞中GSDME蛋白表達(dá)水平和mRNA顯著升高（圖5a-5d）。有研究表明GSDME在被Caspase3切割后在質(zhì)膜上形成孔，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)細(xì)胞從凋亡到焦亡的轉(zhuǎn)變。IP實(shí)驗(yàn)表明GSDME和Caspase3之間存在明顯結(jié)合（圖5e），說明GSDME的確能夠被Caspase3所切割。為評(píng)估ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡的程度，作者測(cè)量釋放到培養(yǎng)基中的乳酸脫氫酶（LDH）的活性來表征焦亡程度。發(fā)現(xiàn)ox-LDL以劑量依賴性方式促進(jìn)細(xì)胞死亡，GSDME缺失減弱LDH的釋放，說明GSDME是ox-LDL誘導(dǎo)的焦亡所必需的。綜上所述，ox-LDL可以上調(diào)GSDME的表達(dá)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。

圖5 ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞GSDME表達(dá)

6、GSDME缺失抑制巨噬細(xì)胞遷移和炎癥反應(yīng)
       基于上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，GSDME缺失抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，GSDME結(jié)合Caspase 3誘導(dǎo)ox- LDL處理的巨噬細(xì)胞焦亡，作者進(jìn)一步提出假設(shè)，GSDME缺失是否能夠減輕巨噬細(xì)胞的炎癥行為。作者用ox-LDL處理WT或GSDME ^{- / -}小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，GSDME ^{- / -}小鼠的細(xì)胞粘附相關(guān)基因Lama2、Pcdhb和Itga7表達(dá)顯著下降（圖6a和6b），GO分析也證實(shí)這一結(jié)論（圖6c）。前人的研究表明通過特定的粘附點(diǎn)粘附到底物上在細(xì)胞遷移過程中是必不可少的。Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GSDME缺失顯著減少巨噬細(xì)胞的遷移能力（圖6d和6e）。由于動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)炎癥是由促炎細(xì)胞因子、炎癥信號(hào)通路和粘附分子所介導(dǎo)的，作者檢測(cè)WT和GSDME ^{- / -}小鼠PMs細(xì)胞經(jīng)ox-LDL處理后的炎癥反應(yīng)，結(jié)果顯示ox-LDL處理后，GSDME ^{- / -}組PMs細(xì)胞的TNF, IL-1β 和 MCP-1的mRNA表達(dá)水平顯著降低（圖6f）。WB結(jié)果顯示GSDME ^{- / -}組PMs細(xì)胞釋放成熟IL-1β的水平降低（圖6g），說明GSDME是IL-1β釋放的通道。除此之外，作者使用TNF 和環(huán)己亞胺誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，測(cè)量不同時(shí)期PMs培養(yǎng)基中的LDH活性，發(fā)現(xiàn)GSDME ^{- / -}組死亡率顯著降低（圖6h），說明GSDME決定細(xì)胞從凋亡到焦亡的轉(zhuǎn)變。綜上所述，GSDME缺失抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)和焦亡。

圖6 巨噬細(xì)胞GSDME缺失抑制巨噬細(xì)胞炎癥和焦亡

7、STAT3上調(diào)GSDME表達(dá)
       前人研究表明STAT3在動(dòng)脈粥樣硬化過程中是必須的，并且STAT3激活參與動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)，因此，靶向抑制STAT3可能是一種潛在治療策略。前期結(jié)果表明高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE^?/?小鼠主動(dòng)脈中p-STAT和GSDME蛋白表達(dá)水平都顯著升高（圖3c），說明二者之間可能存在某種聯(lián)系。隨后作者發(fā)現(xiàn)與GSDME一樣，STAT3也能在人動(dòng)脈粥樣硬化巨噬細(xì)胞中表達(dá)（圖7a），在ox-LDL或Caspase3激活劑TNF處理的PMs細(xì)胞中，GSDME和p-STAT3蛋白水平同時(shí)升高（圖7b和7c），說明STAT3可能參與GSDME的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。為驗(yàn)證這一猜想，作者設(shè)計(jì)敲低和過表達(dá)STAT3實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)STAT3和GSDME的表達(dá)直接相關(guān)（圖7d-7g）。對(duì)GSDME基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)存在4個(gè)STAT3的結(jié)合位點(diǎn)（圖7h）。染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)果證實(shí)STAT3與包含一致序列TTCTGAGAAG的4個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合增加（圖7i）。此外，STAT3還增加GSDME啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性（圖7j）。綜上所述，STAT3 在 GSDME 轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮重要功能。

圖7 STAT3靶向GSDME啟動(dòng)子并激活GSDME轉(zhuǎn)錄

結(jié)論
       GSDME表達(dá)在動(dòng)脈粥樣硬化過程中上調(diào)，GSDME缺失減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中焦亡相關(guān)的促炎細(xì)胞因子釋放。ox-LDL或TNF通過磷酸化激活STAT3，活化的STAT3促進(jìn)GSDME轉(zhuǎn)錄。隨后上調(diào)的GSDME增強(qiáng)Caspase3活性并促進(jìn)細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)化為焦亡（圖8）。

圖8 GSDME促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)的機(jī)制

實(shí)驗(yàn)方法
鄰近連接實(shí)驗(yàn)、免疫組化、免疫熒光染色、RT-PCR、Western blot、Co-IP、ChIP、TUNEL細(xì)胞凋亡測(cè)定、乳酸脫氫酶（LDH）活性測(cè)定、Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)、油紅O染色、HE染色。
參考文獻(xiàn)
Wei Y, Lan B, Zheng T, Yang L, Zhang X, Cheng L, Tuerhongjiang G, Yuan Z, Wu Y. GSDME-mediated pyroptosis promotes the progression and associated inflammation of atherosclerosis. Nat Commun. 2023 Feb 18;14(1):929.