miR-92a-1-5p富集的前列腺癌細胞外囊泡調(diào)節(jié)破骨細胞功能

       我們之前報道過，來自成骨細胞、破骨細胞和混合前列腺癌細胞的細胞外囊泡(EVs)通過轉(zhuǎn)移miR-92a-1-5p促進破骨細胞分化，抑制成骨細胞分化。在本研究中，我們專注于將miR-92a-1-5p工程化到EVs中，并確定工程化EVs的任何治療作用和機制。qPCR證實，miRNA-92a-5p穩(wěn)定過表達的細胞與EV上調(diào)該microRNA相關(guān)。此外，miR-92a-1-5p富集的EVs通過降低MAPK1和FoxO1的表達來促進體外破骨細胞分化，通過TRAP染色和破骨細胞功能基因mRNA表達顯示，這與破骨細胞功能增加有關(guān)。靶向MAPK1或FoxO1的siRNA導(dǎo)致類似的破骨細胞功能增加。在體內(nèi)，通過靜脈注射給予miR-92a-1-5p富集的EVs促進骨溶解，這與骨髓中MAPK1和FoxO1表達的降低有關(guān)。這些實驗表明，miR-92a-1-5p富集的EVs通過減少MAPK1和FoxO1來調(diào)節(jié)破骨細胞的功能。本文于2023年6月發(fā)表于Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF=11.3）上。
技術(shù)路線

結(jié)果
1）miR?92a?1?5p富集的EVs的產(chǎn)生
       通過慢病毒載體（pHBLV-U6-miR-92a-1-5pEF1-fLUC-T2A-Pro）轉(zhuǎn)染，miR-92a-1.5p在MDA PCa 2b細胞中穩(wěn)定過表達。通過qPCR證實miR-92a1-5p過表達約為兩倍（圖1A）。為了收集miR-92a-1-5p富集的EVs，將穩(wěn)定表達的細胞在貧化培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。來自EVs的總RNA顯示miR-92a-1.5p增加了兩倍（圖1B）。接下來，將miR-92a-1-5p+EVs添加到Raw264.7細胞的培養(yǎng)基中，并在共培養(yǎng)后90分鐘內(nèi)觀察到它們的快速內(nèi)化（圖1C）。在這種情況下，成熟miR-92a-1-5p的表達在24小時和48小時增加（圖1D），而pre-miR-92a-1.5p的水平?jīng)]有變化（圖1E）。這些結(jié)果表明，表達的增加是由于成熟的miR-92a-1-5p通過miR-92a-1.5p+EVs的轉(zhuǎn)移。

2）富含miR-92a-1-5p的EVs促進破骨細胞分化
       我們之前的研究報告稱，前列腺癌EVs可以促進破骨細胞分化和減弱成骨細胞分化，兩者至少部分通過轉(zhuǎn)移miR-92a-1-5p介導(dǎo)。在這里，我們打算研究miR-92a-1-5p+EVs在骨穩(wěn)態(tài)中的作用。在不存在RANKL的情況下，將Raw264.7細胞與對照EVs或miR92a-1-5p+EVs孵育24和48小時，然后進行qPCR分析，結(jié)果顯示miR-92a-1-5p+EVs顯著誘導(dǎo)了細胞中Ctsk和Trap的mRNA表達（圖2A-B）。此外，在不存在RANKL的情況下，共培養(yǎng)6天后，通過Trap染色，miR-92a-1-5p+EVs在Raw264.7細胞和骨髓巨噬細胞（BMM）中顯著促進破骨細胞分化（圖2C-D）。

3）MAPK1是miR?92a?1?5p的直接靶標(biāo)
       為了闡明上述作用的分子機制，我們通過生信分析確定miR-92a1-5p的靶基因是MAPK1。qPCR分析顯示，當(dāng)miR-92a-1-5p過表達時，Raw264.7細胞中的MAPK1 mRNA表達顯著降低（圖3A），并且蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，在Lv-92a-1-5p處理的Raw264-7細胞中，MAPK1的水平降低，而不是磷酸化的MAPK1（pMAPK1）的水平降低（圖3B）。通過使用免疫標(biāo)記進一步證實了這些結(jié)果（圖3C）。通過計算機分析，我們發(fā)現(xiàn)MAPK1 3′-UTR區(qū)域包含miR-92a-1-5p的匹配位點（圖3D）。使用雙熒光素酶報告基因分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-92a-1-5p共轉(zhuǎn)染的MAPK1 wt組的酶活性顯著較低（圖3E）。這一結(jié)果表明miR-92a-1-5p直接靶向MAPK1。

4）MAPK1下調(diào)促進破骨細胞分化
       為了闡明MAPK1下調(diào)如何影響破骨細胞分化，我們將MAPK1 siRNA轉(zhuǎn)染到Raw264.7細胞中，并使用qPCR證實MAPK1表達降低（圖4A）。值得注意的是，用Mapk1 siRNA轉(zhuǎn)染Raw264.7細胞上調(diào)了Ctsk和Trap mRNA的表達（圖4B-C），并在RANKL存在的情況下增加了Trap+破骨細胞（圖4D-E）。此外，在RANKL存在的情況下，通過用Mapk1 siRNA轉(zhuǎn)染后6天的免疫標(biāo)記證實了Ctsk和Trap水平的增加（圖4F-G）。

5）FoxO1抑制在MAPK1下調(diào)促進破骨細胞分化中的潛在作用
       在過表達Lv-92a-1-5p的Raw264.7細胞中，我們還無意中通過蛋白質(zhì)印跡發(fā)現(xiàn)FoxO1下調(diào)（圖5A）。然而，在使用TargetScan進行的生物信息學(xué)分析中，F(xiàn)oxO1未被鑒定為miR-92a-1-5p的潛在靶標(biāo)。因此，我們構(gòu)建了FoxO1 siRNA，以確定FoxO1是否在破骨細胞分化中發(fā)揮作用。盡管用Mapk1 siRNA轉(zhuǎn)染后FoxO1 mRNA表達降低（圖5B），但Mapk1 mRNA表達不受FoxO1 siRNA的影響，這表明FoxO1可能是破骨細胞分化中Mapk1的下游分子。在Raw264.7細胞中，用FoxO1 siRNA轉(zhuǎn)染上調(diào)了Ctsk和Trap mRNA的表達（圖5C-D），并增加了Trap+破骨細胞（圖5E-F）。此外，通過免疫標(biāo)記證實了Ctsk和Trap水平的增加（圖5G-H）。Mapk1和FoxO1 siRNA誘導(dǎo)的破骨細胞分化也通過測量Trap活性得到證實（圖5I）。接下來，我們研究了Mapk1 siRNA介導(dǎo)的破骨細胞分化是否依賴于FoxO1。無論FoxO1融合蛋白存在與否，破骨細胞的分化都得到促進（圖5J）。這一發(fā)現(xiàn)表明，盡管FoxO1的表達在對Mapk1 siRNA的反應(yīng)中被抑制，并且FoxO1下調(diào)影響破骨細胞分化，F(xiàn)oxO1對于由Mapk1 siRNA誘導(dǎo)的破骨細胞的分化不是必需的。

6）富含miR-92a-1-5p的EVs在體內(nèi)促進骨溶解
       最后，我們研究了miR-92a-1-5p+EVs在體內(nèi)的作用（圖6A）。微計算機斷層掃描（micro-CT）的結(jié)果顯示，miR-92a-1-5p EVs組每骨體積骨表面積(BS/BV)增加，小梁厚度(Tb.Th)減少，兩者均表明骨中存在骨溶解（圖6B-C）。此外，Trap染色顯示miR-92a-1-5p+EVs組中破骨細胞增加（6圖D），同時MAPK1和FoxO1減少（圖6E-F）。

結(jié)論
       總之，我們報道了一種富含miRNA的EVs構(gòu)建系統(tǒng)，以構(gòu)建富含miR-92a-1-5p的PCa-EVs亞群。進一步，我們闡明了這種設(shè)計的EVs在骨溶解中的作用和機制：富含miR-92a-1-5p的PCa EVs通過MAPK1和FoxO1介導(dǎo)破骨細胞分化，這可能有利于未來成骨細胞性骨病的治療。

實驗方法
細胞外囊泡分離，WB，qPCR，熒光素酶報告試驗，動物研究，Micro?CT。
參考文獻
Yu L, Sui B, Zhang X, Liu J, Hao X, Zheng L. miR-92a-1-5p enriched prostate cancer extracellular vesicles regulate osteoclast function via MAPK1 and FoxO1. J Exp Clin Cancer Res. 2023 May 2;42(1):109. doi: 10.1186/s13046-023-02685-2.