抑制糖酵解就可以抑制乳腺癌細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移！

       缺氧依賴型乳腺癌細(xì)胞可通過促進(jìn)糖酵解增強(qiáng)其致瘤性和轉(zhuǎn)移性。N6-甲基腺苷修飾（m6A）是常見的RNA修飾機(jī)制。本研究中，作者發(fā)現(xiàn)腫瘤缺氧可以轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)HIF1α，轉(zhuǎn)錄后抑制miR-16-5p的表達(dá)，促進(jìn)YTHDF1的表達(dá)，并通過上調(diào)m6A修飾的PKM2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞糖酵解，最終增加乳腺癌細(xì)胞的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移潛能。該研究于2022年3月發(fā)表在《Cell Death Disease》，IF：9.0。
技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1. 功能分析確定YTHDF1是乳腺癌致瘤性驅(qū)動(dòng)因子
       作者首先使用TCGA和CPTAC數(shù)據(jù)庫分析得到乳腺癌中YTHDF1蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著高于鄰近正常組織（圖1A和B），114名乳腺癌患者的TCGA數(shù)據(jù)顯示同樣結(jié)果（圖1C）。通過GEPIA2分析發(fā)現(xiàn)，YTHDF1高表達(dá)與乳腺癌患者的低生存率相關(guān)（圖1D）。此外，作者收集的22例乳腺癌患者的癌組織及癌旁組織免疫組化結(jié)果顯示，其中18個(gè)樣本的癌組織中YTHDF1的表達(dá)水平較癌旁組織均有所升高，其余4例差異不明顯甚至低于癌旁（圖1E）。Western blot結(jié)果顯示，YTHDF1在乳腺癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)（圖1F），在MCF10A和多種乳腺癌細(xì)胞中YTHDF1的mRNA和蛋白水平呈現(xiàn)同樣的上調(diào)趨勢（圖1G和H）。這些結(jié)果表明，YTHDF1上調(diào)是乳腺癌的一個(gè)標(biāo)志。

圖1：YTHDF1在乳腺癌中上調(diào)且與預(yù)后不良相關(guān)

2. YTHDF1調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲與凋亡
       為進(jìn)一步闡明 YTHDF1 在乳腺癌中的潛在調(diào)節(jié)作用，作者通過敲除YTHDF1研究其表型變化。靶向YTHDF1的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，YTHDF1蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著下降（圖2A和B）。CCK8檢測結(jié)果顯示，YTHDF1敲低顯著抑制MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞的生長（圖2C）。通過EdU染色進(jìn)一步驗(yàn)證YTHDF1敲低對乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用（圖2D）。另外還發(fā)現(xiàn) YTHDF1 敲低抑制乳腺癌細(xì)胞集落形成（圖 2E）。同時(shí)，細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)表明，YTHDF1敲除后MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著下降（圖2F）。經(jīng)Annexin V/PI染色的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，YTHDF1敲低導(dǎo)致MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞凋亡（圖2G）。以上結(jié)果表明YTHDF1在維持乳腺癌細(xì)胞惡性發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

圖2：YTHDF1敲低抑制體外細(xì)胞增殖與侵襲

3. 缺氧導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞中YTHDF1表達(dá)上調(diào)
       缺氧可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞增值與侵襲。為解臨床相關(guān)條件下YTHDF1在乳腺癌組織中的調(diào)控機(jī)制，作者進(jìn)一步研究缺氧對乳腺癌細(xì)胞中YTHDF1表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下YTHDF1的mRNA和蛋白表達(dá)水平在MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞中顯著上調(diào)（圖3A和B）。此外，作者將HIF1α和HIF2α siRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，HIF1α基因的缺失導(dǎo)致YTHDF1表達(dá)中度降低，而HIF2α的缺失對YTHDF1表達(dá)沒有明顯影響。
       缺氧可以通過調(diào)節(jié)microRNAs來介導(dǎo)特異性標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。為研究microRNAs可能參與缺氧介導(dǎo)的YTHDF1表達(dá)的過程，作者在多個(gè)microRNAs數(shù)據(jù)庫搜索篩選了29個(gè)可能與YTHDF1相互作用的microRNAs（圖3C），并進(jìn)一步獲得參與缺氧介導(dǎo)YTHDF1過表達(dá)的10個(gè)microRNAs。然后作者發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，miR-16-5p、miR-15a-5p和miR-23b-3p的表達(dá)水平顯著下降（圖3D）。通過轉(zhuǎn)染microRNAs的mimics，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-16-5pmimics對YTHDF1 mRNA表達(dá)具有最顯著的抑制作用（圖3E）。為進(jìn)一步闡明miR-16-5p在缺氧介導(dǎo)的YTHDF1表達(dá)中的調(diào)控作用，作者構(gòu)建YTHDF1 3’UTR野生型和突變型的雙熒光素酶表達(dá)系統(tǒng)（圖3F），并與miR-16-5pmimics或miR-16-5p抑制劑共轉(zhuǎn)染。熒光素酶活性結(jié)果顯示，在YTHDF1 3’UTR野生型中，miR-16-5抑制劑可以逆轉(zhuǎn)miR-16-5p介導(dǎo)的熒光素酶表達(dá)活性下調(diào)，但不能逆轉(zhuǎn)YTHDF1 3’UTR突變型的熒光素酶活性降低效果（圖3G）。以上結(jié)果表明，腫瘤缺氧微環(huán)境可以通過增強(qiáng)HIF1α的表達(dá)以及抑制內(nèi)源性miR-16-5p的表達(dá)來上調(diào)YTHDF1。

圖3：缺氧誘導(dǎo)YTHDF1在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

4. miRNA-16-5p靶向YTHDF1抑制乳腺癌細(xì)胞生長
       為確定miR-16-5p介導(dǎo)的YTHDF1抑制對乳腺癌細(xì)胞的影響，作者監(jiān)測miR-16-5pmimics及抑制劑轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞后的表型變化。他們首先觀察到miR-16-5p可以高靶向消除YTHDF mRNA和蛋白表達(dá)。然而，pCDNA3.1-YTHDF1×FLAG質(zhì)粒與miR-16-5p模擬物共轉(zhuǎn)染可恢復(fù)乳腺癌細(xì)胞中YTHDF1蛋白表達(dá)水平（圖4A和B）。同時(shí)，CCK8檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-16-5pmimics可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，而miR-16-5p與miR-16-5p抑制劑或YTHDF1表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合使用可緩解miR-16-5p介導(dǎo)的抑制作用（圖4C和D）。EdU染色結(jié)果也支持miR-16-5p對腫瘤的抑制作用和YTHDF1表達(dá)質(zhì)粒的挽救作用（圖4E和F）。作者同時(shí)也觀察到miR-16-5抑制乳腺癌細(xì)胞的克隆、遷移和侵襲，而加入miR-16-5p抑制劑或pCDNA3.1-YTHDF1×FLAG質(zhì)粒則逆轉(zhuǎn)了腫瘤抑制作用（圖4G-J）?；贏nnexin V/ PI染色的流分析進(jìn)一步表明，轉(zhuǎn)染miR-16-5p可有效誘導(dǎo)MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞凋亡，而YTHDF1表達(dá)質(zhì)?？删徑饧?xì)胞凋亡（圖4K和L）。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)表明，miR-16-5p抑制YTHDF1表達(dá)同YTHDF1敲低作用效果一致，均能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的惡性特征和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，使miR-16-5p作為靶向調(diào)控YTHDF1表達(dá)治療形式的應(yīng)用成為可能。

圖4：miR-16-5p通過下調(diào)YTHDF1抑制體外乳腺癌細(xì)胞增殖與侵襲

5. YTHDF1調(diào)控PKM2表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞糖酵解
       乳腺癌細(xì)胞通過糖酵解將大量乳酸終產(chǎn)物釋放到腫瘤細(xì)胞外微環(huán)境中導(dǎo)致其酸化?？紤]到缺氧與YTHDF1之間的聯(lián)系，作者首先研究MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞中YTHDF1被抑制后，缺氧條件下細(xì)胞外微環(huán)境的乳酸水平變化。作者發(fā)現(xiàn)YTHDF1敲低明顯改善缺氧時(shí)乳腺癌細(xì)胞外微環(huán)境酸化，同時(shí)顯著降低葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生水平。這說明在乳腺癌細(xì)胞中，YTHDF1敲低可以阻斷葡萄糖代謝。為進(jìn)一步闡明YTHDF1在乳腺癌細(xì)胞糖酵解調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用，作者利用YTHDF1抗體對細(xì)胞做了RIP處理，通過qPCR檢測糖酵解相關(guān)基因在乳腺癌細(xì)胞糖酵解調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PKM2 mRNA被YTHDF1有效富集（圖5A）。由于YTHDF1通過識(shí)別和結(jié)合mRNA的m6A來調(diào)控靶基因表達(dá)，因此作者在RMBase v2.0數(shù)據(jù)庫中檢索了YTHDF1與PKM2 mRNA結(jié)合的m6A修飾基序，以確定YTHDF1與PKM2之間的相互作用。利用RAP-CLIP鑒定出PKM2與YTHDF1結(jié)合的mRNA m6A修飾基序是ATGGACT（圖5B）。關(guān)于YTHDF1識(shí)別m6A修飾位點(diǎn)后對PKM2的調(diào)控機(jī)制，作者發(fā)現(xiàn)敲低YTHDF1對PKM2 mRNA或蛋白的穩(wěn)定性沒有明顯影響。因此，作者推測YTHDF1可能影響PKM2蛋白翻譯過程并通過構(gòu)建靶向PKM2 CDS的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)來驗(yàn)證這一假設(shè)。雙熒光素酶測定結(jié)果顯示，與對照組相比（圖5C），PKM2在YTHDF1敲低細(xì)胞系中的翻譯效率降低約40%。這些結(jié)果表明，YTHDF1主要通過介導(dǎo)PKM2蛋白翻譯過程影響PKM2信號(hào)傳導(dǎo)。
      為進(jìn)一步研究YTHDF1-PKM2軸在乳腺癌發(fā)展過程中的參與作用，作者將YTHDF1敲除后發(fā)現(xiàn)，重新表達(dá)PKM2可以有效恢復(fù)乳腺癌細(xì)胞糖酵解活性（圖5D-G）。即使YTHDF1過表達(dá)，PKM2敲低后仍然抑制糖酵解（圖5H-K）。另外，流式細(xì)胞儀結(jié)果表明，重新表達(dá)PKM2可以逆轉(zhuǎn)YTHDF1敲低所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而PKM2敲低和YTHDF1過表達(dá)聯(lián)合處理仍導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞嚴(yán)重凋亡（圖L和M）。這些結(jié)果表明，YTHDF1通過調(diào)節(jié)PKM2的表達(dá)影響乳腺癌細(xì)胞的糖酵解，從而對乳腺癌細(xì)胞的各種生物學(xué)活性產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

圖5：YTHDF1調(diào)控糖酵解中PKM2的表達(dá)

6. YTHDF1下調(diào)抑制乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)的生長
       為驗(yàn)證YTHDF1在乳腺癌發(fā)展中的作用，作者利用皮下乳腺腫瘤的BALB / c小鼠進(jìn)一步研究YTHDF1敲低對乳腺癌細(xì)胞致瘤的影響，并通過向4周齡雌性BALB / c小鼠注射YTHDF1 shRNA處理的4T1細(xì)胞構(gòu)建相關(guān)模型。與對照組相比，作者觀察到Y(jié)THDF1缺失引起腫瘤體積明顯減小，細(xì)胞凋亡群體增加，并伴隨有腫瘤組織中PKM2表達(dá)降低（圖6A-C），這表明YTHDF1敲低通過抑制PKM2可有效抑制小鼠乳腺腫瘤生長。同時(shí)YTHDF1沉默也顯著減少小鼠乳腺腫瘤的肺轉(zhuǎn)移（圖6J）。此外，作者將YTHDF1過表達(dá)轉(zhuǎn)染的4T1細(xì)胞轉(zhuǎn)入4周齡雌性BALB / C小鼠中，通過監(jiān)測腫瘤大小變化來評估YTHDF1過表達(dá)對BALB/C小鼠中乳腺癌細(xì)胞致癌性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，YTHDF1過表達(dá)導(dǎo)致皮下乳腺癌組織的大小和PKM2表達(dá)水平增加（圖6D-F）。同時(shí)，YTHDF1過表達(dá)也顯著增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移能力（圖6K），具體表現(xiàn)在YTHDF1 過表達(dá)處理組轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量增加。這些結(jié)果均表明，YTHDF1是介導(dǎo)下游PKM2信號(hào)調(diào)控乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的正向調(diào)節(jié)因子?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果，作者利用同樣的方法評估了miR-16-5p介導(dǎo)的YTHDF1抑制以及體內(nèi)抗腫瘤作用。與陰性對照相比，miR-16-5p處理組誘導(dǎo)腫瘤組織中YTHDF1和PKM2的表達(dá)顯著降低。而且miR-16-5p處理組的腫瘤生長受到明顯抑制，給藥24天后，平均腫瘤體積大小約為對照組的1/4（圖6G-I），其肺轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他兩組（圖6L）。對提取的腫瘤組織進(jìn)行Western blot分析，其結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，即YTHDF1缺失抑制了小鼠異種移植腫瘤中PKM2表達(dá)。作者通過免疫組化進(jìn)一步研究患者來源的乳腺腫瘤和鄰近正常組織中YTHDF1和PKM2表達(dá)水平，結(jié)果表明YTHDF1和PKM2在腫瘤組織中均上調(diào)，且兩者之間呈正相關(guān)（圖6M）。綜上所述， YTHDF1在促進(jìn)乳腺腫瘤生長和體內(nèi)轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，而miR-16-5p通過選擇性抑制YTHDF1表現(xiàn)出潛在的抗腫瘤作用。

圖6：YTHDF1作為小鼠中調(diào)控乳腺癌細(xì)胞致瘤性和轉(zhuǎn)移性的治療靶標(biāo)

結(jié)論
      綜上所述， YTHDF1表達(dá)水平上調(diào)可以通過調(diào)控PKM2蛋白翻譯促進(jìn)糖酵解來增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。YTHDF1 介導(dǎo)的 m6A 甲基化修飾可能成為開發(fā)更先進(jìn)的乳腺癌療法靶標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞培養(yǎng)，免疫組化，菌落形成測定，細(xì)胞遷移和入侵實(shí)驗(yàn)，siRNA 、shRNA或microRNA 轉(zhuǎn)染，CCK8，EdU染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，Western blot，RT-PCR，RIP，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，transwell入侵試驗(yàn)，小鼠動(dòng)物模型，TCGA、CPTAC數(shù)據(jù)庫分析，葡萄糖和乳酸濃度測定
參考文獻(xiàn)
Yao X, Li W, Li L, Li M, Zhao Y, Fang D, Zeng X, Luo Z. YTHDF1 upregulation mediates hypoxia-dependent breast cancer growth and metastasis through regulating PKM2 to affect glycolysis. Cell Death Dis. 2022 Mar 23;13(3):258. doi: 10.1038/s41419-022-04711-1. PMID: 35319018; PMCID: PMC8940925.