靶向IGF1R信號(hào)可增強(qiáng)食管鱗狀細(xì)胞癌順鉑的敏感性

       以順鉑(DDP)為基礎(chǔ)的化療是食管鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)患者常用的一線治療方案，但其較高的耐藥率限制了其臨床應(yīng)用，其作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在闡明缺氧條件下異常信號(hào)傳遞和代謝在OSCC耐藥中的作用，并尋找增強(qiáng)DDP化療敏感性的靶向藥物。通常，腫瘤細(xì)胞存在于缺氧微環(huán)境中。通過(guò)基因組分析，我們確定IGF1R在低氧條件下在OSCC中上調(diào)。臨床上，IGF1R表達(dá)增強(qiáng)與OSCC患者腫瘤分期高、預(yù)后差相關(guān)，其抑制劑linsitinib在體內(nèi)和體外均與DDP治療有協(xié)同作用。由于缺氧經(jīng)常導(dǎo)致代謝重編程，我們通過(guò)代謝組學(xué)分析進(jìn)一步了解到，異常的IGF1R通路通過(guò)c-MYC的轉(zhuǎn)錄活性促進(jìn)代謝酶ASS1和PYCR1的表達(dá)。具體而言，ASS1的表達(dá)增強(qiáng)促進(jìn)精氨酸代謝以進(jìn)行生物合成代謝，而PYCR1則激活脯氨酸代謝以維持氧化還原平衡，從而在缺氧條件下維持DDP治療期間OSCC細(xì)胞的增殖能力。靶向IGF1R信號(hào)的Linsitinib可能為DDP耐藥的OSCC患者帶來(lái)有希望的聯(lián)合治療選擇。本文于2023年3月發(fā)表于Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF=11.3）上。
技術(shù)路線

結(jié)果
1）IGF1R在OSCC中過(guò)表達(dá)，與疾病進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)
       我們首先分析了TCGA的數(shù)據(jù)。其中，IGF1R、MET、EGFR、FGFR2、FGFR3、PDGFRB的表達(dá)水平在OSCC中較非癌組織顯著上調(diào)，其中IGF1R表達(dá)差異最顯著(圖1A)。同時(shí)，通過(guò)RNA-seq，在OSCC患者組織中也發(fā)現(xiàn)MET和IGF1R過(guò)表達(dá)(圖1B左)。為了進(jìn)一步分析在模擬缺氧(1%)條件下RTKs失調(diào)對(duì)化學(xué)耐藥的作用，我們最初考慮選擇對(duì)DDP具有最大抗性的OSCC細(xì)胞系。最近的研究表明KYSE150細(xì)胞對(duì)DDP的藥物敏感性最低。我們選擇IC50值最高的KYSE150和ECA109細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)RNA測(cè)序(圖1B右)。在缺氧條件下，只有IGF1R顯著上調(diào)。通過(guò)整合臨床組織和細(xì)胞系樣本的RNA-seq，我們將后續(xù)的研究重點(diǎn)放在了IGF1R上(圖1C)。與上述RNA-seq結(jié)果一致，在缺氧條件下，RTKs中只有IGF1R以濃度(圖1D)和時(shí)間(圖1E)依賴(lài)的方式持續(xù)表達(dá)水平升高。
       在臨床上，TMA(圖1F-H)和WB(圖1I)分析結(jié)果反映了上述差異，其中腫瘤組織中IGF1R蛋白表達(dá)高于癌旁組織。此外，在79例OSCC患者中，IGF1R高表達(dá)水平與腫瘤分期呈正相關(guān)(圖1F-G)，與總生存期預(yù)后不良正相關(guān)(圖1H)。具體而言，與鄰近正常組織相比，早期食管癌組織中IGF1R蛋白豐度中度升高(圖1J-K)，這可能為早期診斷和治療提供指導(dǎo)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明IGF1R在人類(lèi)OSCC中過(guò)表達(dá)，這可能具有預(yù)后意義，并與缺氧下DDP抵抗有關(guān)。

2）抑制IGF1R可增強(qiáng)OSCC在體內(nèi)和體外對(duì)DDP的敏感性
       為了探索異常表達(dá)的IGF1R在DDP耐藥中的作用，我們最初干擾了IGF1R的表達(dá)(圖2A)，在體外(圖2B)和體內(nèi)(圖2C-E)均發(fā)現(xiàn)了適度抑制OSCC增殖的能力。此外，IGF1R抑制劑linsitinib可以在接近IC50的濃度下有效抑制p-IGF1R的表達(dá)(圖2F)。隨后，將linsitinib與DDP聯(lián)合治療(圖2G)，說(shuō)明linsitinib與DDP聯(lián)用可協(xié)同抑制OSCC細(xì)胞的增殖。這些協(xié)同效應(yīng)在體外(圖2H)和體內(nèi)(圖2I-J)也有體現(xiàn)?？偟膩?lái)說(shuō)，抑制IGF1R表達(dá)可能顯著增加OSCC細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。接下來(lái)，我們將探討潛在的機(jī)制。

3）缺氧條件下，代謝酶ASS1/PYCR1在OSCC中上調(diào)
       代謝適應(yīng)有助于癌細(xì)胞在缺氧微環(huán)境中的發(fā)育。具體來(lái)說(shuō)，代謝酶的改變是整個(gè)代謝途徑異常的關(guān)鍵。因此，通過(guò)整合代謝組學(xué)和基因組分析(圖3G)，我們有望在缺氧條件下找到活化的代謝酶。一方面，作為精氨酸代謝關(guān)鍵酶的ASS1和負(fù)責(zé)脯氨酸合成的PYCR1在腫瘤組織(圖3A左)和限氧條件下的細(xì)胞系(圖3A右)中均有高表達(dá)。另一方面，我們進(jìn)行了非靶向代謝組學(xué)分析(圖3B)，在缺氧條件下的KYSE150細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了45種異常積累的代謝物(圖3C)。通過(guò)the Small Molecule Pathway Database分析，發(fā)現(xiàn)這些代謝物與多種代謝途徑密切相關(guān)(圖3D)。我們發(fā)現(xiàn)TCA循環(huán)和FAO被抑制，同時(shí)伴隨著糖酵解的增強(qiáng)(圖3E)。值得注意的是，天冬氨酸-精氨酸-脯氨酸代謝也增強(qiáng)了(圖3F)。我們主要關(guān)注通過(guò)ASS1和PYCR1改變的精氨酸/脯氨酸代謝(圖3G)。

4）ASS1和PYCR1的表達(dá)改變與IGF1R相關(guān)
       我們初步驗(yàn)證了ASS1和PYCR1在OSCC中的表達(dá)水平。與IGF1R一致，ASS1和PYCR1在KYSE150和ECA109細(xì)胞系中表達(dá)最高(圖3H-I)。此外，缺氧也以時(shí)間依賴(lài)性的方式刺激了這兩種酶的表達(dá)(圖3J-K)。此外，TMA(圖4A-D)和WB(圖F)顯示，與癌旁組織相比，OSCC患者組織中ASS1/PYCR1蛋白表達(dá)上調(diào)。臨床上，ASS1/PYCR1的高表達(dá)與腫瘤分期相關(guān)(圖4A-D)，即使在EOC中與正常組織樣本相比(圖4G-H)，以及OSCC患者的無(wú)進(jìn)展生存期(圖4E)。此外，我們發(fā)現(xiàn)TMA中ASS1和PYCR1的表達(dá)與IGF1R呈正相關(guān)(圖5A)。因此，我們想知道ASS1和PYCR1是否受IGF1R的調(diào)節(jié)。

5）IGF1R通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路- cMYC軸調(diào)控ASS1和PYCR1的表達(dá)
       為了進(jìn)一步探索IGF1R調(diào)控ASS1和PYCR1表達(dá)的機(jī)制，我們首先抑制IGF1R的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ASS1/PYCR1下調(diào)(圖5B)。此前，IGF1R已被證明在促進(jìn)多種細(xì)胞功能的兩個(gè)主要信號(hào)通路(即PI3K/AKT和Ras/MAPK通路)中負(fù)責(zé)下游級(jí)聯(lián)蛋白的磷酸化。因此，我們抑制IGF1R表達(dá)來(lái)檢測(cè)各種信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)Ras/MAPK通路和JAK/STAT通路(圖5C)的磷酸化水平顯著降低。此外，JAK和ERK1/2的下調(diào)伴隨著ASS1/PYCR1表達(dá)的降低(圖5D)，證實(shí)IGF1R通過(guò)這兩條信號(hào)通路調(diào)控ASS1/PYCR1。為了確定IGF1R通路與ASS1/PYCR1之間的橋梁，多種轉(zhuǎn)錄因子(TF)引起了我們的注意，并且它們的轉(zhuǎn)錄活性可以通過(guò)RTK通路的磷酸化而增強(qiáng)。因此，在幾種常見(jiàn)的TF中，只有磷酸化的c-MYC與ASS1/PYCR1 (圖5E)和IGF1R通路(圖5F)表現(xiàn)出明確的調(diào)控關(guān)系。為了確定c-MYC與ASS1/PYCR1之間的直接調(diào)控，我們進(jìn)行了JASPAR分析(圖5 G)，結(jié)果表明ASS1 (圖5H)和PYCR1 (圖5I)在啟動(dòng)子區(qū)域都有c-MYC結(jié)合序列。對(duì)c-MYC進(jìn)行ChIP檢測(cè)，然后進(jìn)行定量PCR，證實(shí)c-MYC直接與ASS1(圖5J)和PYCR1(圖5K)啟動(dòng)子結(jié)合。此外，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，c-MYC可以促進(jìn)ASS1(圖5L, N)和PYCR1(圖5M, O)的轉(zhuǎn)錄激活。綜上所述，這些結(jié)果表明，缺氧條件下ASS1和PYCR1表達(dá)的改變是由IGF1R信號(hào)通路- c-MYC軸誘導(dǎo)的(圖5P)。

6）IGF1R通過(guò)靶向精氨酸代謝降低OSCC細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性
       為了進(jìn)一步研究ASS1和PYCR1增強(qiáng)在DDP耐藥中的作用，我們首先干擾ASS1(圖6A)和PYCR1(圖6C)的表達(dá)，分別觀察到體外(圖6B, D)和體內(nèi)(圖6E-G)的增殖能力略有抑制。與IGF1R抑制劑linsitinib的作用一致，shASS1/PYCR1在體外(圖H-I)和體內(nèi)(圖6J-L)均表現(xiàn)出與DDP協(xié)同抑制腫瘤增殖的作用。接下來(lái)，我們還進(jìn)行了代謝組學(xué)分析，以研究ASS1(圖7A)和PYCR1(圖7D)在代謝重編程中的作用。ASS1(圖7B、C、G)和PYCR1(圖7E、F、H)抑制誘導(dǎo)的異常與精氨酸/脯氨酸代謝密切相關(guān)。更具體地說(shuō)，shRNA-PYCR1細(xì)胞中的脯氨酸水平降低，shRNA-ASS1細(xì)胞中的精氨酸水平降低(圖7I)。此外，為了揭示精氨酸的作用，我們進(jìn)行了拯救實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照+ DDP組相比，shASS1 + DDP或linsitinib + DDP組被抑制的增殖能力通過(guò)補(bǔ)充外源性精氨酸得到部分恢復(fù)(圖7J)。這些數(shù)據(jù)表明，IGF1R通過(guò)在缺氧條件下調(diào)節(jié)ASS1促進(jìn)精氨酸代謝，導(dǎo)致精氨酸積累，作為維持化療期間增殖能力的生物合成前體。

7）IGF1R通過(guò)靶向脯氨酸代謝降低OSCC細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性
       與精氨酸相比，外源性脯氨酸在shPYCR1 + DDP或linsitinib + DDP組中未能挽救增殖(圖7K)。眾所周知，PYCR1催化脯氨酸合成伴隨著NAD+的生物合成，在維持氧化還原平衡中起著關(guān)鍵作用。我們想知道通過(guò)PYCR1增強(qiáng)脯氨酸代謝的NAD +是否補(bǔ)償了TCA循環(huán)。正如預(yù)期的那樣，PYCR1表達(dá)減弱抑制了NAD +水平(圖7L)。最后，我們?cè)贒DP + shPYCR1組中添加了額外的外源性丙酮酸，它可以支持TCA循環(huán)中中間代謝物的積累；結(jié)果，外源性丙酮酸逆轉(zhuǎn)了shPYCR1 + DDP處理引起的增殖抑制(圖7K)。綜上所述，IGF1R通過(guò)調(diào)節(jié)PYCR1促進(jìn)脯氨酸代謝，提供足夠的NAD +維持TCA循環(huán)中的氧化還原平衡，最終支持化療期間的細(xì)胞增殖。

結(jié)論
       我們發(fā)現(xiàn)激活的IGF1R通路在低氧微環(huán)境下的OSCC化療耐藥中發(fā)揮重要作用。靶向IGF1R和相關(guān)的精氨酸/脯氨酸代謝可能是減輕DDP耐藥的關(guān)鍵方法。這些發(fā)現(xiàn)提高了我們對(duì)DDP耐藥性中的信號(hào)傳遞和代謝重編程的理解。DDP和IGF1R抑制劑聯(lián)合治療可能有利于OSCC的治療。

實(shí)驗(yàn)方法
CCK-8，RT?qPCR，RNA測(cè)序，WB，ChIP，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，IHC，TMA，代謝組學(xué)分析，NAD +和ATP水平的測(cè)定。
參考文獻(xiàn)
Fang K, Sun M, Leng Z, Chu Y, Zhao Z, Li Z, Zhang Y, Xu A, Zhang Z, Zhang L, Chen T, Xu M. Targeting IGF1R signaling enhances the sensitivity of cisplatin by inhibiting proline and arginine metabolism in oesophageal squamous cell carcinoma under hypoxia. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Mar 28;42(1):73. doi: 10.1186/s13046-023-02623-2.