USP48的藥理激活——USP48-GSDME軸促進(jìn)癌細(xì)胞焦亡
焦亡是一種細(xì)胞程序性死亡，其特征是炎癥caspase的激活和Gasdermin蛋白的裂解。焦亡可以抑制腫瘤發(fā)展，誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，激活焦亡是一種潛在的治療癌癥的策略。本研究中，作者通過(guò)CRISPR-Cas9篩選，發(fā)現(xiàn)USP48（一種去泛素化酶）的缺失顯著抑制了細(xì)胞焦亡。USP48通過(guò)Gasdermin E （GSDME）促進(jìn)焦亡。該研究于2023年4月發(fā)表在《Cancer Research》，IF：11.2。
技術(shù)路線
主要研究結(jié)果
1. USP48參與焦亡的調(diào)控
顯微鏡下觀察人宮頸癌HeLa細(xì)胞經(jīng)raptinal處理后的形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞中出現(xiàn)焦亡的球囊細(xì)胞膜，證實(shí)raptinal可以誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞焦亡（圖lA）。在HeLa細(xì)胞中進(jìn)行CRISPR-Cas9基因篩選，以raptinal處理后LDH的分泌量為讀取值，并通過(guò)單siRNA篩選技術(shù)進(jìn)一步篩選和驗(yàn)證獲得的基因（圖1B）。根據(jù)轉(zhuǎn)染sgRNA后LDH分泌的倍數(shù)變化，選擇36個(gè)基因作為主要基因。其中，17個(gè)候選基因的沉默使LDH的分泌增加2倍以上，而其他19個(gè)基因的沉默則抑制了LDH的分泌（圖1C-D）。干擾USP48對(duì)細(xì)胞內(nèi)LDH的釋放有明顯的抑制作用（圖1E）。用raptinal處理細(xì)胞，檢測(cè)USP48沉默對(duì)HeLa細(xì)胞LDH、IL-1β和IL-18的影響（圖1F-H）。結(jié)果表明，USP48沉默可顯著抑制HeLa細(xì)胞中LDH、IL-1β和IL-18的釋放。通過(guò)延時(shí)顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染USP48特異性siRNA （si-USP48）的HeLa細(xì)胞，結(jié)果顯示USP48沉默顯著抑制raptinal誘導(dǎo)的焦亡和SYTOX Green吸收（圖1I-J）。USP48沉默抑制raptinal誘導(dǎo)的HMGB1釋放（圖1K）。綜上所述，初步確認(rèn)USP48可能參與焦亡調(diào)控。
圖1. USP48參與焦亡的調(diào)控
2. USP48調(diào)控GSDM的表達(dá)
檢測(cè)6種不同人源性細(xì)胞系中USP48的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)USP48在293T細(xì)胞中低表達(dá)，在HeLa細(xì)胞中高表達(dá)（圖2A）。在293T細(xì)胞系中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)USP48，在HeLa細(xì)胞系中穩(wěn)定敲低USP48（圖2B）。將質(zhì)譜和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果結(jié)合分析，獲得8個(gè)相關(guān)蛋白（圖2D和E）。檢測(cè)過(guò)表達(dá)USP48和敲低USP48后這8種蛋白的表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)GSDME相比其他幾種蛋白的變化更為顯著和穩(wěn)定（圖2F和G）。圖2H進(jìn)一步證實(shí)GSDME的表達(dá)與USP48的表達(dá)呈正相關(guān)，但GSDMD和USP48的表達(dá)狀態(tài)不存在顯著相關(guān)。催化失活突變體USP48 （USP48/C98A）的過(guò)表達(dá)不會(huì)影響GSDME的表達(dá)（圖2I）。通過(guò)CO-IP進(jìn)一步證實(shí)USP48與GSDME之間的相互作用（圖2J-K）。此外，作者還發(fā)現(xiàn)USP48不影響GSDME的裂解（圖2L）。綜上，USP48可以調(diào)節(jié)GSDME的表達(dá)（但不影響其裂解），并且與GSDME有直接的相互作用。
圖2. GSDME是USP48的下游靶蛋白
3. USP48通過(guò)調(diào)控GSDM的表達(dá)影響焦亡
建立一個(gè)同時(shí)表達(dá)USP48和靶向GSDME的shRNA的293T細(xì)胞系（圖3A）。GSDME的下調(diào)大大挽救了raptinal處理后293T細(xì)胞中USP48過(guò)表達(dá)對(duì)LDH（圖3B）、IL-1B（圖3C）和IL-18（圖3D）的促進(jìn)作用。相反，在同時(shí)表達(dá)shUSP48和GSDME的HeLa細(xì)胞系中（圖3E），也證實(shí)了過(guò)表達(dá)GSDME可以恢復(fù)USP48敲低對(duì)293T細(xì)胞經(jīng)raptinal處理后產(chǎn)生LDH（圖3F）、IL-1β（圖3G）和IL-18（圖3H）的抑制作用。用延時(shí)顯微鏡觀察表達(dá)USP48和shRNA靶向GSDME的293T細(xì)胞系經(jīng)raptinal處理后SYTOX Green的形態(tài)和吸收情況，得到了一致的結(jié)果（圖3I-J）。綜上所述，證實(shí)USP48可能以不依賴于caspase-3的方式促進(jìn)GSDME的表達(dá)，從而促進(jìn)GSDME的表達(dá)發(fā)生焦亡。
圖3. USP48通過(guò)GSDME調(diào)控焦亡
4. USP48通過(guò)去泛素化防止GSDME降解
為進(jìn)一步確認(rèn)USP48是否會(huì)影響GSDME的穩(wěn)定性，作者發(fā)現(xiàn)蛋白酶體特異性抑制劑MG132可以有效逆轉(zhuǎn)USP48敲低對(duì)GSDME的影響（圖4A），通過(guò)環(huán)已酰亞胺（CHX）追蹤分析評(píng)價(jià)USP48調(diào)節(jié)GSDME蛋白腫瘤速率的潛力，結(jié)果表明USP48水平的降低與GSDME半衰期的縮短明顯相關(guān)（圖4B）。用Dox誘導(dǎo)的野生型USP48 （USP48/WT）和催化失活突變型USP4S （USP48/C98A）建立293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)只有野生型USP48以Dox劑量依賴的方式逐漸增加GSDME水平（圖4C），而表達(dá)USP48/C98A的細(xì)胞中未檢測(cè)到GSDME蛋白水平的顯著變化（圖4D）。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)野生型USP48顯著降低GSDME的泛素化水平，而表達(dá)USP48/C98A的293T細(xì)胞對(duì)GSDME的泛素化沒(méi)有影響（圖4E）。相反，敲低USP48會(huì)導(dǎo)致泛素化GSDME的積累（圖4F）。作者還發(fā)現(xiàn)USP48影響GSDME中K48連接的泛素，但對(duì)K63連接的泛素化沒(méi)有影響（圖4G）。體外泛素化實(shí)驗(yàn)表明，泛素K48在K30、K120和K189位點(diǎn)使GSDME泛素化 （圖4H和I）。接下來(lái)，為鑒定USP48修飾的GSDME的靶殘基，在GSDME的K30、K120和K189位點(diǎn)構(gòu)建相應(yīng)的點(diǎn)突變體（圖4J），結(jié)果顯示，USP48在K120處抑制GSDME的K48連鎖泛素化（圖4K）。綜上所述，USP48通過(guò)抑制GSDME K120位點(diǎn)的K48連鎖泛素化來(lái)阻止GSDME的降解。
圖4. USP48通過(guò)去泛素化抑制GSDME的降解
5. USP48通過(guò)調(diào)節(jié)GSDME的表達(dá)影響抗腫瘤免疫
為了進(jìn)一步證明USP48的功能，建立USP48缺陷小鼠自發(fā)性胰腺腫瘤發(fā)生（KUC）模型。免疫組化和免疫熒光結(jié)果顯示USP48的表達(dá)水平與GSDME的表達(dá)呈正相關(guān)（圖5A-F）。此外，小鼠組織中USP48的缺失對(duì)GSDMD的表達(dá)也沒(méi)有影響（圖5G和H）。免疫熒光結(jié)果顯示，KUC小鼠腫瘤浸潤(rùn)性CD8+和CD4+T細(xì)胞明顯減少（圖5I-J）。自然殺傷細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T殺傷細(xì)胞的比例明顯降低，而腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例則顯著增加（圖5K）。綜上所述， USP48可以通過(guò)調(diào)節(jié)GSDME的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞的抗腫瘤免疫。
圖5. USP48參與抗腫瘤免疫的調(diào)節(jié)
6. 單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)闡明USP48對(duì)抗腫瘤免疫的調(diào)控作用
對(duì)KC和KUC小鼠的胰腺組織進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，所有細(xì)胞CD45基因（PTPRC）均呈陽(yáng)性（圖6A）。大小聚類算法顯示KC和KUC小鼠胰腺腫瘤組織中的細(xì)胞分布（圖6B）。將細(xì)胞分組，定義捕獲TAM的5個(gè)細(xì)胞群，即樹(shù)突狀細(xì)胞（dc）、T細(xì)胞、單核細(xì)胞-1細(xì)胞和單核細(xì)胞-2細(xì)胞（圖6C）。比較KC和KUC胰腺癌組織中細(xì)胞亞群的差異，發(fā)現(xiàn)USP48表達(dá)的下調(diào)顯著增加了TAM和單核細(xì)-2的數(shù)量（圖6D）。通過(guò)熱圖和點(diǎn)陣圖 （圖6E和F），得到KC和KUC胰腺癌組織中各細(xì)胞亞組的數(shù)量和比例（圖6G）。對(duì)KC和KUC胰腺癌組織中的T細(xì)胞進(jìn)行亞群分析（圖7A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， Tex細(xì)胞和Treg細(xì)胞在KUC胰腺癌組織中的比例顯著增加，表明USP48表達(dá)的降低抑制腫瘤免疫的發(fā)生（圖7B）。使用UMAP顯示T細(xì)胞亞群分類標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記基因的表達(dá)以及T細(xì)胞亞群在KC和KUC胰腺癌組織中的比例，進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果（圖7C-D）。使用多色免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KC和KUC小鼠胰腺癌組織中Tex細(xì)胞和Treg細(xì)胞的分布，得到的結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致（圖7E和F）。敲低USP48顯著增加TAM亞群的比例（圖7G和H）。多色免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)USP48的缺失增加TAM在胰腺癌組織中的分布（圖7I）。綜上所述， USP48缺失抑制胰腺癌細(xì)胞的抗腫瘤免疫。
圖6. 胰腺癌中KC和KC；USP48-/-CD45+細(xì)胞的單細(xì)胞分析
圖7. 敲除USP48可增加浸潤(rùn)胰腺癌的去勢(shì)T細(xì)胞、Treg和TAM的比例
7. USP48-GSDME調(diào)節(jié)小鼠對(duì)抗PD -1免疫治療的敏感性
將過(guò)表達(dá)USP48的Pan02細(xì)胞或空載體皮下植入C57/B6小鼠。在第7天、第11天和第15天用抗aPD-1處理小鼠，連續(xù)觀察小鼠的生長(zhǎng)情況，并在第30天處死小鼠（圖8A）。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)USP48可顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，而過(guò)表達(dá)USP48突變體（USP48/C98A）對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。過(guò)表達(dá)USP48也顯著提高小鼠對(duì)抗PD -1治療的敏感性（圖8B-E）。在過(guò)表達(dá)USP48的Pan02細(xì)胞中表達(dá)shGSDME或scramble，并皮下注射到C57/B6小鼠體內(nèi)。與預(yù)期結(jié)果一致，在USP48過(guò)表達(dá)的Pan02小鼠中，敲低GSDME的表達(dá)可有效逆轉(zhuǎn)USP48過(guò)表達(dá)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用和促進(jìn)抗PD -1治療的敏感性（圖8F-I）。對(duì)小鼠腫瘤進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果與之前的結(jié)果一致 （圖8J-K）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)USP48-GSDME通路在抗腫瘤免疫中的重要作用，并發(fā)現(xiàn)其在腫瘤免疫治療中的關(guān)鍵調(diào)控作用。
圖8. USP48-GSDME影響小鼠對(duì)抗PD-1免疫療法的敏感性
結(jié)論
綜上所述，本研究確定了USP48對(duì)焦亡的關(guān)鍵調(diào)控作用，并闡明了其分子機(jī)制以及USP48在抗腫瘤免疫和免疫治療中的作用。因此，特異性靶向USP48或USP48-GSDME軸可能是未來(lái)潛在的治療策略。
實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞培養(yǎng)，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染， CRISPR敲除，免疫組化，多重免疫熒光，WB，Co-IP，體外泛素化實(shí)驗(yàn)，qRT-PCR，流式細(xì)胞術(shù)，SYTOX green 染色，LDH檢測(cè)，IL-18和IL-1β檢測(cè)，RNA-seq文庫(kù)構(gòu)建，腫瘤異種移植。
參考文獻(xiàn)
Ren Y, Feng M, Hao X, Liu X, Li J, Li P, Gao J, Qi Q, Du L, Wang C, Wang Q, Wang Y. USP48 Stabilizes Gasdermin E to Promote Pyroptosis in Cancer. Cancer Res. 2023 Apr 4;83（7）:1074-1093. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-22-1812. PMID: 36607699.