METTL16促進(jìn)糖酵解代謝重編程和結(jié)直腸癌進(jìn)展

       糖酵解是癌癥的關(guān)鍵標(biāo)志，維持惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。m6A修飾在糖酵解中的作用在很大程度上是未知的。本研究探討了m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL16在糖酵解代謝中的生物學(xué)功能，揭示了結(jié)直腸癌(CRC)進(jìn)展的新機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，SOGA1是METTL16的直接下游靶點(diǎn)，參與METTL16介導(dǎo)的糖酵解和CRC進(jìn)展。METTL16通過結(jié)合IGF2BP1顯著增強(qiáng)SOGA1的表達(dá)和mRNA的穩(wěn)定性。隨后，SOGA1促進(jìn)AMPK復(fù)合體泛素化，抑制其表達(dá)和磷酸化，從而上調(diào)PDK4。此外，YY1可以通過直接結(jié)合METTL16的啟動子，通過轉(zhuǎn)錄抑制其在CRC細(xì)胞中的表達(dá)。臨床資料顯示，METTL16表達(dá)與SOGA1、PDK4呈正相關(guān)，與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良有關(guān)。我們的研究結(jié)果表明METTL16/SOGA1/PDK4軸可能是CRC的有希望的治療靶點(diǎn)。本文于2023年6月發(fā)表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=11.3）上。
技術(shù)路線

結(jié)果
1）METTL16過表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良相關(guān)
       通過對數(shù)據(jù)集的分析，我們發(fā)現(xiàn)在METTL家族成員中，METTL16是CRC細(xì)胞存活最重要的基因(圖1A, B)。重要的是，在m6A的主要調(diào)控因子中，METTL16也在CRC的存活中顯示出重要作用(圖1C, D)，說明其在CRC中的功能意義。TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫顯示，與正常組織相比，METTL16在結(jié)直腸癌組織中顯著上調(diào)(圖1E、F)。此外，TGGA數(shù)據(jù)顯示與METTL16表達(dá)和CRC的臨床病理變量相關(guān)。如圖1G-I所示，METTL16表達(dá)升高與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期分級顯著相關(guān)。METTL16 mRNA在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)也高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(圖1J)。同樣，METTL16蛋白在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)也普遍高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(圖1K、L)。免疫組化(IHC)對結(jié)直腸癌樣本和癌旁組織的染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了METTL16在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)增強(qiáng)(圖1M和N)。METTL16蛋白表達(dá)的增加與結(jié)直腸癌患者的低生存率相關(guān)(圖1O)。此外，多變量Cox回歸分析顯示，METTL16蛋白表達(dá)可能是結(jié)直腸癌患者生存的獨(dú)立預(yù)測因子(圖1P)?？偟膩碚f，METTL16在CRC中上調(diào)，可能在CRC進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

2）METTL16促進(jìn)CRC進(jìn)展
       為了研究METTL16在結(jié)直腸癌進(jìn)展中的作用，我們分別使用兩種shRNA (shM161、shM16-2)和pHBLV-METTL16載體(OEM16)在結(jié)直腸癌細(xì)胞中敲低和過表達(dá)METTL16的表達(dá)。敲低METTL16可降低CRC細(xì)胞的增殖和集落形成，而過表達(dá)METTL16則具有相反的作用(圖2A-D)。同樣，METTL16敲低抑制了CRC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而METTL16過表達(dá)促進(jìn)了CRC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移(圖2E、F)。在METTL16敲低和過表達(dá)的CRC異種移植物中進(jìn)一步評估了METTL116的功能，結(jié)果表明METTL116促進(jìn)腫瘤生長，而抑制METTL16則抑制腫瘤生長，這可以通過腫瘤的大小、體積和重量反映出來(圖2G-L)。此外，METTL16敲低降低了Ki67的表達(dá)，而METTL16過表達(dá)則促進(jìn)了Ki67在體內(nèi)的表達(dá)(圖2M, N)。綜上所述，這些結(jié)果表明METTL16在促進(jìn)CRC進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。

3）SOGA1是METTL16的直接靶點(diǎn)
       為了探究METTL16誘導(dǎo)CRC增殖的分子機(jī)制，我們對METTL16穩(wěn)定敲除的CRC細(xì)胞和對照細(xì)胞進(jìn)行了MeRIP測序和RNA測序。圖3A顯示了前50個差異基因，9個變化基因和峰重疊(圖3B)。在低峰中，有7個基因表達(dá)改變，包括LRG1, B3GNT4, EID3, HOXA3, PAQR6, SOGA1和ZNF778(圖3C, D)。通過驗(yàn)證，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，METTL16的敲低降低了SOGA1 mRNA的表達(dá)，而METTL16的過表達(dá)上調(diào)了SOGA1 mRNA的表達(dá)(圖3E, F)。同樣，METTL16正調(diào)控SOGA1蛋白的表達(dá)(圖3G, H)。重要的是，在MeRIP-seq數(shù)據(jù)中，我們檢測到SOGA1 mRNA的一個m6A峰，該峰在METTL16敲除后減弱(圖3I)。MeRIP-qPCR結(jié)果顯示，當(dāng)METTL16被敲除時，m6A修飾的SOGA1 mRNA顯著減少(圖3J)。作為致癌基因，SOGA1蛋白和mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與正常組織相比顯著升高(圖3K-M)。SOGA1表達(dá)升高與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期分級顯著相關(guān)(圖3N-P)。此外，METTL16在體內(nèi)正調(diào)控SOGA1蛋白表達(dá)(圖3R, S)。綜上所述，這些結(jié)果表明SOGA1是METTL16的直接靶點(diǎn)。

4）IGF2BP1是SOGA1的m6A閱讀器
       我們進(jìn)一步研究了m6A修飾SOGA1 mRNA的機(jī)制。為了鑒定識別和結(jié)合SOGA1甲基化的m6A閱讀器，我們進(jìn)行了RNA下拉實(shí)驗(yàn)，從SW620細(xì)胞中捕獲SOGA1相互作用的閱讀器。m6A閱讀器YTHDF1和IGF2BP1/2/3與SOGA1 mRNA結(jié)合(圖4A, B)。有趣的是，敲低IGF2BP1可顯著下調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞中SOGA1 mRNA和蛋白水平(圖4C, D)。然而，敲低YTHDF1和IGF2BP2/3對SOGA1蛋白表達(dá)無明顯影響(圖4E-G)。TCGA數(shù)據(jù)分析顯示，與正常組織相比，IGF2BP1在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)(圖4H、I)， IGF2BP1表達(dá)升高與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期分級顯著相關(guān)(圖4J、K)。IGF2BP1表達(dá)升高與CRC患者生存不良相關(guān)(圖4L)。RNA下拉實(shí)驗(yàn)揭示了IGF2BP1蛋白與SOGA1 mRNA之間的密切相互作用(圖4M)。同樣，RIP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了IGF2BP1直接與SOGA1 mRNA結(jié)合(圖4N)。IGF2BP1敲低降低了SOGA1 mRNA的穩(wěn)定性，提高了其在CRC細(xì)胞中的降解率(圖4O)。綜上所述，這些結(jié)果表明甲基化的SOGA1 mRNA被IGF2BP1直接識別，從而抑制轉(zhuǎn)錄物降解并以依賴m6A的方式促進(jìn)SOGA1的表達(dá)。

5）METTL16/SOGA1通過調(diào)節(jié)PDK4的表達(dá)促進(jìn)糖酵解
       我們研究了METTL16/ SOGA1軸在糖酵解中促進(jìn)CRC進(jìn)展的作用。SW620細(xì)胞中SOGA1的下調(diào)顯著降低了葡萄糖攝取和乳酸生成(圖5A, B)。此外，SOGA1缺失的CRC細(xì)胞顯示ECAR降低，OCR增加，反映了線粒體氧化呼吸(圖5C, D)。與此一致，METTL16缺失的CRC細(xì)胞顯示葡萄糖攝取(圖5E)、乳酸生成(圖5F)、ECAR(圖5G)降低，OCR增加(圖5H)。與此相反，SW620細(xì)胞中METTL16的過表達(dá)促進(jìn)了葡萄糖攝取和乳酸生成(圖51,J)。為了進(jìn)一步確定METTL16/SOGA1介導(dǎo)糖酵解的機(jī)制，我們測量了SOGA1敲低CRC細(xì)胞中一系列葡萄糖代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)(圖5K)。我們還研究了這些分子是否受METTL16的控制。因此，我們檢測了這些基因在過表達(dá)的METTL16 crc細(xì)胞中的mRNA表達(dá)(圖5L)。有趣的是，只有PDK4的表達(dá)水平因SOGA1的下調(diào)而顯著降低，而因METTL16的過表達(dá)則持續(xù)升高。通過進(jìn)一步驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)SOGA1和METTL16的敲低降低了CRC細(xì)胞中PDK4 mRNA和蛋白的表達(dá)(圖5M-O)。總的來說，我們的數(shù)據(jù)顯示METTL16/SOGA1軸通過調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞中PDK4的表達(dá)來促進(jìn)糖酵解。

6）SOGA1通過抑制AMPK信號傳導(dǎo)促進(jìn)PDK4的表達(dá)
       我們進(jìn)一步探討了SOGA1調(diào)控PDK4表達(dá)的潛在機(jī)制。有報道稱AMPK信號是PDK4上游的關(guān)鍵信號。為了驗(yàn)證AMPK在PDK4表達(dá)中的作用，我們使用AMPK激活劑A769662刺激CRC細(xì)胞。結(jié)果表明，A769662誘導(dǎo)AMPK (Thr172)磷酸化，激活A(yù)MPK信號，顯著降低PDK4蛋白和mRNA的表達(dá)(圖6A、B)。我們發(fā)現(xiàn)，AMPKα1、β1和γ1亞基的敲低增加了PDK4 mRNA和蛋白的表達(dá)(圖6C、D)，表明AMPK位于PDK4的上游，負(fù)向調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞中PDK4的表達(dá)。接下來，我們發(fā)現(xiàn)敲低SOGA1顯著促進(jìn)AMPK磷酸化和AMPKα1、β1和γ1蛋白表達(dá)(圖6F)，但對AMPKα1、β1和γ1 mRNA表達(dá)無明顯影響(圖6E)。蛋白穩(wěn)定性分析顯示，SOGA1敲低可降低pAMPK、AMPKα1、β1和γ1的衰變，增強(qiáng)其蛋白穩(wěn)定性(圖6G)。Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SOGA1可以結(jié)合pAMPK、AMPKα1、β1、γ1(圖6H)，促進(jìn)AMPKα1、β1、γ1和pAMPK泛素化(圖6I)。此外，抑制AMPKα1、β1和γ1部分逆轉(zhuǎn)SOGA1或METTL16的缺失下調(diào)PDK4的表達(dá)(圖6J)。這些結(jié)果表明，SOGA1結(jié)合AMPKα1、β1和γ1，誘導(dǎo)其泛素化，抑制其表達(dá)和磷酸化，從而促進(jìn)PDK4的表達(dá)(圖6K)。

7）YY1通過直接結(jié)合METTL16啟動子下調(diào)其表達(dá)
       為了探索METTL16在CRC中高表達(dá)的潛在機(jī)制，我們通過分析ChIPBase和PROMO中的ENCODE染色質(zhì)免疫沉淀測序(ChIP-seq)數(shù)據(jù)，評估了負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)METTL16的潛在轉(zhuǎn)錄因子(TFs)。如圖7A所示，CEBPB、YY1、VDR、ETS1、TCF4、XBP1 6個TF重疊在ChIPBase預(yù)測的26個TF和PROMO預(yù)測的46個TF中。接下來，分別下調(diào)這6個TF，發(fā)現(xiàn)CEBPB和YY1的敲低增加了METTL16 mRNA的表達(dá)(圖7B)。然而，CEBPB的缺失對METTL16蛋白的表達(dá)沒有明顯影響(圖7C)。YY1的敲低明顯上調(diào)了CRC細(xì)胞中METTL16蛋白和mRNA的表達(dá)(圖7D, E)。在對METTL16基因啟動子的分析中，我們找到了YY1在其上的結(jié)合位點(diǎn)，并設(shè)計了ChIP引物(圖7F)。ChIP實(shí)驗(yàn)表明，YY1可以直接結(jié)合CRC細(xì)胞中的METTL16啟動子(圖7G)，表明YY1是METTL16的上游TF。接下來，我們對METTL16啟動子報告基因的兩個YY1潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，生成pGL-M16-Mut1或pGL-M16-Mut2(圖7H)。結(jié)果表明，si-YY1可以顯著降低pGLM16-WT和pGL-M16-Mut1的熒光素酶水平，而si-YY1對pGL-M16-Mut2的抑制作用減弱(圖7I)。此外，YY1敲低增加了CRC細(xì)胞中SOGA1 mRNA的穩(wěn)定性(圖7J)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明YY1是METTL16的上游轉(zhuǎn)錄因子，并通過直接結(jié)合METTL16的啟動子來調(diào)節(jié)METTL16的表達(dá)。

8）METTL16/SOGA1軸與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良有臨床相關(guān)性
       為了研究SOGA1在METTL16介導(dǎo)的CRC增殖中的作用，我們在METTL16過表達(dá)的CRC細(xì)胞中使用siRNA下調(diào)SOGA1的表達(dá)并檢測細(xì)胞增殖。結(jié)果表明，SOGA1的敲低削弱了METTL16促進(jìn)的CRC細(xì)胞的增殖(圖8A)。SOGA1敲低部分抑制了METTL16促進(jìn)的CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)移(圖8B)。在體內(nèi)，SOGA1和PDK4敲低都減弱了METTL116的過表達(dá)提高的腫瘤生長，這反映在腫瘤大小(圖8C)、體積(圖8D)和重量(圖8E)上。此外，METTL16和SOGA1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(圖8F、G)。此外，在結(jié)直腸癌組織中，METTL16的表達(dá)與PDK4呈正相關(guān)(圖8F)。重要的是，Kaplan-Meier分析顯示，METTL16與SOGA1共表達(dá)或METTL16與PDK4高表達(dá)與CRC患者預(yù)后不良呈正相關(guān)(圖8H)。上述結(jié)果表明，SOGA1在METTL16介導(dǎo)的CRC細(xì)胞增殖中起重要作用，METTL16/SOGA1軸與CRC患者預(yù)后不良具有臨床相關(guān)性。

結(jié)論
       我們的研究結(jié)果表明METTL16在結(jié)直腸癌進(jìn)展中具有腫瘤促進(jìn)作用。METTL16在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良相關(guān)。機(jī)制上，METTL16/SOGA1/ PDK4信號軸通過誘導(dǎo)糖酵解促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展。這一發(fā)現(xiàn)為探索結(jié)直腸癌新的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供了新的見解。

實(shí)驗(yàn)方法
Western blotting，qRT?PCR，代謝試驗(yàn)，ECAR和OCR，RNA穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性測定，Co?IP，IHC，transwell，MeRIP測序，RIP，RNA pull?down，ChIP，動物實(shí)驗(yàn)。
參考文獻(xiàn)
Wei W, Zhang ZY, Shi B, Cai Y, Zhang HS, Sun CL, Fei YF, Zhong W, Zhang S, Wang C, He B, Jiang GM, Wang H. METTL16 promotes glycolytic metabolism reprogramming and colorectal cancer progression. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Jun 20;42(1):151. doi: 10.1186/s13046-023-02732-y.