肝細(xì)胞癌經(jīng)動脈化療栓塞后，TREM2+巨噬細(xì)胞抑制CD8+T細(xì)胞浸潤
肝細(xì)胞癌（HCC）經(jīng)肝動脈化療栓塞術(shù)（TACE）后的免疫格局仍有待闡明。本研究旨在描述TACE后的免疫景觀和HCC進(jìn)展的潛在機(jī)制。收集5例未經(jīng)治療的HCC患者和5例接受TACE治療的患者的腫瘤樣本，并進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序。另有22個配對樣本使用免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行驗證。為闡明潛在的機(jī)制，體外共培養(yǎng)實驗和兩種類型的TREM2-KO / WT小鼠模型，即HCC細(xì)胞原位注射模型和自發(fā)性HCC模型。TACE術(shù)后微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）數(shù)量增加。TACE治療降低了CD8_C4簇，該CD8_C4簇高度富集腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞。TREM2在TACE術(shù)后TAMs中高表達(dá)，且與不良預(yù)后相關(guān)。TREM2+TAMs比TREM2-TAMs分泌更少的CXCL9，但分泌更多的半乳凝素-1。半乳凝素-1促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞PD-L1過表達(dá)，阻礙CD8+T細(xì)胞募集。TREM2的缺失也增加了CD8+T細(xì)胞的浸潤，這在兩種體內(nèi)HCC模型中都抑制了腫瘤的生長。更重要的是，TREM2缺失增強(qiáng)了抗PD-L1阻斷的治療效果。本研究表明TREM2+TAMs在抑制CD8+T細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。TREM2缺失通過增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤活性，增加了抗PD-L1阻斷的治療效果。這些發(fā)現(xiàn)解釋了TACE術(shù)后復(fù)發(fā)和進(jìn)展的原因，為TACE術(shù)后HCC免疫治療提供了新的靶點(diǎn)。本研究于2023年7月發(fā)表于《Journal of Hepatology》上，IF：25.7。
技術(shù)路線
主要研究結(jié)果
1、免疫細(xì)胞群的全局scRNA-seq分析
研究展示了發(fā)現(xiàn)隊列中5個未經(jīng)治療的原發(fā)性HCC和5個TACE后HCC樣本的scRNA-seq（圖1A）。作者在驗證隊列中用TACE前后的22個配對樣本驗證了這一發(fā)現(xiàn)（圖1B）。圖1C顯示隊列的計算機(jī)斷層掃描圖像。
共鑒定出27個不同的簇，包括CD8、CD4、自然殺傷細(xì)胞（NK）、B、血漿和髓系細(xì)胞（圖1D）。與PT組（圖1E和F）相比，TT組髓系細(xì)胞數(shù)量增加，NK和CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少。所有細(xì)胞簇在患者間共享，表明不存在患者特異性批次效應(yīng)或患者異質(zhì)性（圖1G-H）。這些發(fā)現(xiàn)得到了來自驗證隊列的免疫熒光（圖1I-J）和流式細(xì)胞術(shù)（圖1-L）的證實。
圖1 TACE治療減少CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，但增加髓系細(xì)胞的數(shù)量
2、在TACE治療后，高度富集腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的CD8_C4亞群的頻率降低
將CD8+T細(xì)胞重新聚類為15個群體（圖2A）。差異表達(dá)基因（DEG）分析和細(xì)胞評分評估顯示，TT組CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性和耗竭降低，而氧化應(yīng)激增加（圖2B、C）。令人驚訝的是，TT樣本中CD8_C4細(xì)胞的頻率顯著低于PT樣本（圖2D）?；诩?xì)胞毒性基因數(shù)量的增加和耗竭標(biāo)志物的適度表達(dá)，軌跡分析發(fā)現(xiàn)CD8_C4細(xì)胞代表了介于效應(yīng)性CD8+和終端耗竭性CD8+T細(xì)胞之間的過渡狀態(tài)（圖2E）。研究使用流式細(xì)胞術(shù)分析了驗證隊列中的6個配對HCC樣本，在TT樣本中檢測到PD-1intCD8+T細(xì)胞的頻率降低（圖2F、G）。粒酶-B主要表達(dá)于PD-1int CD8+T細(xì)胞亞群，與作者之前的研究結(jié)果一致。此外，TT組PD-1int CD8+T細(xì)胞中粒酶-B的表達(dá)量遠(yuǎn)低于PT組（圖2H、I）?？珧炞C隊列的免疫熒光實驗也驗證了TT組中粒酶-B+PD-1+CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少（圖2J、K）。此外，基于TCGA數(shù)據(jù)庫的生存分析顯示，CD8_C4基因標(biāo)簽組合與HCC患者較好的預(yù)后結(jié)局相關(guān)（圖2L）。作者使用轉(zhuǎn)移軌跡研究來探討CD8+T細(xì)胞在耗竭前階段的能量代謝途徑。研究發(fā)現(xiàn)，TT樣本的CD8+T細(xì)胞在擬時間階段4的脂蛋白代謝評分高于PT樣本（圖2M），而谷氨酸、糖酵解和三羧酸循環(huán)評分低于PT樣本（圖2M）。這些結(jié)果表明TACE治療在數(shù)量和功能上降低了CD8_C4簇。
作者的TCR測序分析證實這些發(fā)現(xiàn)。除CD8_C13（IELs）外，所有細(xì)胞均表達(dá)TCR（圖3A）。在許多類群中，擴(kuò)張的克隆型數(shù)量在TT樣品中具有較低的趨勢（圖3B）。Hyper-expanded CD8+克?。t色）僅在PT樣本中觀察到，large-expanded CD8+克隆（橙色）數(shù)量在TT樣本中顯著較低（圖3C、D）。此外，對所有CD8+細(xì)胞簇的TCR克隆型進(jìn)行系統(tǒng)檢測，發(fā)現(xiàn)CD8_C1至CD8_C4細(xì)胞簇具有較多的TCR克隆型，表明這四組細(xì)胞具有同源性。與PT組相比，TT組共用的CD8_C1 ~ CD8_C4克隆型顯著減少（圖3E），表明TACE治療后CD8+T細(xì)胞克隆擴(kuò)增受阻。
圖2 TACE治療后CD8_C4細(xì)胞數(shù)量減少
圖3 TACE后CD8+ T細(xì)胞的TCR克隆擴(kuò)增減少
3、肝癌患者TACE治療后TREM2+TAMs數(shù)量增加
由于髓系細(xì)胞在調(diào)節(jié)T細(xì)胞浸潤和功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，作者檢測了髓系細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)。它們被重新聚類成15個群體，包括巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、常規(guī)樹突狀細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（圖4A、B）。
大多數(shù)巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞的頻率在TACE治療后增加（圖4C）。DEG分析表明，TT組TAMs中TREM2表達(dá)上調(diào)，CD5L表達(dá)下調(diào)（圖4D）。作者通過流式細(xì)胞術(shù)從驗證隊列中驗證了這一觀察（圖4E、F）。作者的scRNA-seq數(shù)據(jù)還揭示了TACE治療后特定亞簇中TREM2的上調(diào)和CD5L的下調(diào)（圖4G）。有趣的是，來自TCGA數(shù)據(jù)庫的HCC隊列分析證實，CD45和CD68正常化的TREM2高表達(dá)是不良臨床預(yù)后的顯著指標(biāo)。相反，在相同的正?；较?，CD5L的高表達(dá)與更好的臨床結(jié)果相關(guān)（圖4H）。此外，免疫熒光也證實了驗證隊列中TT組中TREM2+CD68+TAMs的積累增加和CD5L+CD68+TAMs的浸潤減少（圖4I、J）。
接下來，作者對TAMs /單核細(xì)胞進(jìn)行RNA速度分析，以探索跨TAMs的促腫瘤信號通路的變化，35個C1QC+TAMs和SPP1+TAMs具有末端進(jìn)化狀態(tài)，（圖5A）。GO通路分析表明C1QC+TAMs在功能上與急性炎癥和補(bǔ)體激活通路相關(guān)。相反，SPP1+TAMs表達(dá)參與血管生成、成纖維細(xì)胞增殖和中性粒細(xì)胞活化的特定基因（圖5B）。與PT組相比，TT組補(bǔ)體激活、吞噬和血管生成相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著升高，但I(xiàn)FN誘導(dǎo)基因的表達(dá)水平顯著降低（圖5C）。特別是與血管生成相關(guān)的基因在SPP1+TAMs中富集（圖5D）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明TAMs在TACE治療后表現(xiàn)出腫瘤誘導(dǎo)的血管生成表型。
圖4 TACE治療后TREM2+TAM數(shù)量增加
圖5 TT樣品中的TAM顯示出增強(qiáng)的血管生成表型
4、TREM2+TAMs通過低分泌CXCL9和增強(qiáng)GAL-1的產(chǎn)生來抑制CD8+T細(xì)胞的浸潤
作者使用受/配體分析來研究CD8+T細(xì)胞與TAM表型之間的關(guān)系。TACE治療后，趨化因子和檢查點(diǎn)DEG分析顯示CXCL9和PDCD1表達(dá)水平顯著降低（圖6A）。趨化因子受/配體分析進(jìn)一步揭示了CXCL9 / CXCR3軸在CD8+T細(xì)胞浸潤中發(fā)揮著比CXCL10/CXCR3軸更重要的調(diào)控作用（圖6B）。有趣的是，在TT樣本中，CXCL9的表達(dá)顯著降低，而CXCL10和CXCR3的表達(dá)沒有顯著變化（圖6C、D）。此外，盡管CD8+T細(xì)胞中PDCD1的表達(dá)在許多TT樣本子簇中降低，但CD274配體在巨/單細(xì)胞中幾乎沒有變化（圖6E-G）。這些結(jié)果表明，TACE治療后CD8+T細(xì)胞的浸潤受到CXCL9 / CXCR3軸下調(diào)的阻礙，而不是PD-1 / PD-L1軸的下調(diào)。為進(jìn)一步探索CXCL9下調(diào)的分子機(jī)制，作者研究了TREM2+vs . TREM2-巨噬細(xì)胞?；鹕綀D表明，與CXCL9下調(diào)相反，LGALS1（GAL-1）在TREM2+TAMs中上調(diào)（圖6H），這會阻礙CD8+T細(xì)胞的功能。36-38此外，作者利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析了TREM2與CXCL9 / LGALS1之間的遺傳相互作用，發(fā)現(xiàn)在HCC TAMs中TREM2與CXCL9呈負(fù)相關(guān)，而與LGALS1呈正相關(guān)（圖6I）。
為進(jìn)一步研究TREM2+TAMs中CXCL9和GAL-1的分泌情況，作者采用流式細(xì)胞術(shù)對驗證組中的6個配對樣本進(jìn)行檢測。雖然CXCL9主要在TREM2-TAMs中表達(dá)，但GAL-1在TREM2+TAMs中的表達(dá)明顯高于TREM2-TAMs；PT和TT樣品之間無顯著性差異（圖7A、B）。與此一致，ELISA實驗發(fā)現(xiàn)TREM2+TAMs比TREM2-TAMs釋放更少的CXCL9和更多的GAL-1（圖7C）。重要的是，基于TCGA數(shù)據(jù)庫，LGALS1的高表達(dá)和LGALS1hiTREM2hi被CD68正?；幕驑?biāo)簽都是不良臨床預(yù)后的可靠指標(biāo)（圖7D）。通過跨內(nèi)皮遷移實驗，作者觀察到與TREM2+TAMs共培養(yǎng)時遷移的CD8+T細(xì)胞數(shù)量比與TREM2-TAMs共培養(yǎng)時減少?？笴XCL9抗體的加入阻斷了CD8+T細(xì)胞的遷移，而抗GAL-1抗體增強(qiáng)了CD8+T細(xì)胞的遷移（圖7E、F）。此外，與TREM2-TAMs相比，TREM2+TAMs對CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的抑制作用更強(qiáng)（圖7G），這與之前的研究結(jié)果一致。18此外，作者發(fā)現(xiàn)TREM2+TAMs釋放的GAL-1誘導(dǎo)了VE細(xì)胞PD-L1的過表達(dá)（圖7H）。來自驗證隊列的免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測鞏固了TT樣本中PDL1+CD31+VE細(xì)胞數(shù)量的增加，但TT樣本中非血管區(qū)域的PD-L1+CD31-腫瘤細(xì)胞減少（圖7I-K），表明PD-L1+VE細(xì)胞作為抑制CD8+T細(xì)胞遷移的障礙。總體而言，TACE治療后，TREM2+TAMs低水平的CXCL9分泌和高水平的GAL-1分泌共同抑制了CD8+T細(xì)胞的浸潤和抗腫瘤活性。
圖6 TREM2+TAMs中CXCL9表達(dá)降低，LGALS1表達(dá)升高
圖7 TREM2+TAMs通過低分泌CXCL9和增加GAL-1的產(chǎn)生，阻礙CD8+T細(xì)胞的浸潤
5、TREM2缺失減弱HCC腫瘤生長并提高抗PD-L1治療的療效
體內(nèi)實驗確定TREM2+TAMs是否促進(jìn)HCC腫瘤生長。構(gòu)建兩種模型，即原位注射Hepa1-6細(xì)胞和基于NASH的自發(fā)性HCC。在兩種肝癌模型中，TREM2-WT小鼠的腫瘤生長呈進(jìn)行性，而TREM2-KO小鼠的腫瘤生長明顯減弱（圖8A、B）。然后，作者檢測了兩種HCC模型中免疫細(xì)胞的浸潤情況。作者的數(shù)據(jù)顯示，雖然CXCL9+TAMs的頻率增加，但TREM2-KO小鼠中GAL-1+TAMs減少。此外，在TREM2-KO小鼠中，NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的頻率顯著升高，并伴隨CD8+T細(xì)胞中PD-1和IFN-c的上調(diào)。提示TREM2缺失增加NK / CD8+T細(xì)胞的浸潤，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的活化和細(xì)胞毒性。結(jié)果與先前的研究一致。此外，PD-L1在CD31+VE細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)（圖8C、D），兩種模型的免疫熒光實驗均驗證了這一發(fā)現(xiàn)（圖8E、F）。這一證據(jù)揭示了TREM2缺失抑制HCC腫瘤生長的潛在機(jī)制。因此，TREM2缺失可能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對抗PD-L1檢查點(diǎn)阻斷的反應(yīng)性。因此，作者采用上述兩種注射抗小鼠PD-L1抗體的HCC模型進(jìn)行驗證。該方案在TREM2-KO小鼠中顯示出最強(qiáng)的治療效果（圖8G、H）。無論抗PDL1抗體處理與否，TREM2-KO小鼠CD8+T細(xì)胞均增加。TREM2-KO小鼠和抗PD-L1抗體注射組的IFN-c+CD8+T細(xì)胞也顯著增加（圖8I、J），具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。
圖8 在兩種HCC模型中，TREM2缺乏可減緩腫瘤生長并增強(qiáng)抗PD-l1治療的療效
結(jié)論
總之，本研究數(shù)據(jù)顯示了TACE后HCC獨(dú)特的免疫景觀。作者為TREM2+TAMs引起TACE術(shù)后復(fù)發(fā)和免疫抑制的機(jī)制提供了充分的證據(jù)，并提出了令人信服的免疫治療靶點(diǎn)。
實驗方法
scRNA-seq單細(xì)胞懸液制備，scRNA-seq，血管內(nèi)皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)實驗，TREM2-KO小鼠，CD8+T細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移試驗，CD8+T細(xì)胞功能抑制實驗，流式細(xì)胞術(shù)，多重免疫熒光染色，ELISAs
參考文獻(xiàn)
Tan J, Fan W, Liu T, Zhu B, Liu Y, Wang S, Wu J, Liu J, Zou F, Wei J, Liu L, Zhang X, Zhuang J, Wang Y, Lin H, Huang X, Chen S, Kuang M, Li J. TREM2+macrophages suppress CD8+T-cell infiltration after transarterial chemoembolisation in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2023 Jul;79（1）:126-140. doi: 10.1016/j.jhep.2023.02.032. Epub 2023 Mar 6. PMID: 36889359.