新的鐵死亡調控回路——蛋白激酶ATM通過磷酸化協(xié)調鐵自噬
鐵死亡是一種由細胞內生物活性鐵催化的脂質過氧化物的致死積累驅動的程序性細胞死亡。Ser/Thr蛋白激酶ATM，DNA雙鏈斷裂損傷的主要傳感器，是鐵死亡執(zhí)行不可或缺的。本研究中，作者發(fā)現(xiàn)ATM激酶支配細胞內不穩(wěn)定的鐵池，或者通過磷酸化鐵自噬受體NCOA4，從而操縱鐵自噬的鐵周轉。研究結果揭示了一種新的調控回路，包括ATM-NCOA 4在協(xié)調鐵自噬和鐵生物利用度。該研究于2023年6月發(fā)表于《Autophagy》上，IF=13.3。
技術路線
主要研究內容
1.ATM激酶在細胞鐵死亡中的作用
為了證實ATM激酶的鐵結合調節(jié)能力，使用ATM敲除MEF細胞。我們發(fā)現(xiàn)ATM敲除保護MEF免于由erastin和RSL 3觸發(fā)的細胞死亡，如細胞活力測定所證明的（圖1A和1B）。補充erastin或RSL 3導致WT細胞中明顯的PI陽性染色，其幾乎可以被Fer完全阻斷。ATM敲除顯著拮抗這種PI陽性染色，如熒光顯微鏡掃描和流式細胞術分析所示（圖1C-1F）。此外，erastin和RSL 3的暴露誘導脂質過氧化物的過度產(chǎn)生，其在ATM敲除MEF細胞中被顯著抑制（圖1G和1H）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)證實了ATM激酶在鐵蛋白減少過程中不可或缺的作用。此外，我們還證實了ATM激酶在其他誘導劑誘導的鐵死亡中的相關性。丁硫氨酸亞砜亞胺（BSO）和柳氮磺胺吡啶（Sul）分別通過不可逆地抑制γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（γ-glutamylcysteine synthase，γ-GS）和強有力地靶向系統(tǒng)Xc-，消耗細胞內GSH，從而啟動鐵代謝。ATM缺失也抵消了BSO和硫誘導的鐵死亡，如細胞活力測定（圖1I和1J）、PI染色（圖1K-1N）和脂質過氧化分析（圖1O和1P）所示?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明ATM激酶對于鐵磷酸化執(zhí)行是不可或缺的。
圖1：ATM激酶在細胞鐵死亡中是不可或缺的
2.ATM決定的鐵死亡不依賴于TRP53
腫瘤抑制因子TRP53是ATM激酶最重要的下游靶點之一。更重要的是，已報道TRP 53通過多種機制操縱鐵凋亡，而不僅僅是其對細胞凋亡和自噬的充分表征的調節(jié)作用。為了研究TRP53在ATM介導的鐵凋亡中的潛在作用，分析了在TRP53消融的遺傳背景下ATM敲除MEFs和對照MEFs的鐵凋亡敏感性。在本文中，AP29細胞是TRP53單敲除的，而AP26細胞是ATM TRP53雙敲除的（圖2A）。與WT MEF相比，TRP53單敲除AP29細胞在一定程度上對erastin和RSL 3誘導的細胞死亡更具抗性（圖2B和2C），表明TRP53的促鐵蛋白激酶活性。當與TRP53單敲除AP29細胞相比時，ATM TRP53雙敲除AP26細胞似乎對erastin和RSL3誘導的鐵死亡更加不敏感，如細胞活力測定（圖2B和2C）、PI染色（圖2D）和脂質過氧化分析（圖2 E和2F）所示。值得注意的是，在暴露于erastin和RSL3的AP26細胞中觀察到Ptgs2的表達降低（圖2G和2 H）。為了進一步證實TRP53在ATM介導的鐵磷貯積癥中的相關性，使用了匹氟菊酯-α（PFTα），一種抑制TRP 53響應基因的TRP53依賴性反式激活的特異性TRP 53抑制劑。補充PFTα可明顯下調Cdkn1a/p21（細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（P21）;一種重要的TRP53靶向基因）和MEF細胞中Slc7a11的上調（圖2 I），表明PFTα確實抑制TRP53的轉錄因子活性。在PFTα攻擊期間，在ATM KO細胞中觀察到Cdknla的邊際下調和Slc7al1的上調（圖2 I），這可能是由于ATM KO細胞中TRP53的較低表達（圖2A）。值得注意的是，PFTα補充在WT和ATM KO細胞中均驅動鐵凋亡抗性（圖2 J、2K），進一步表明TRP53的鐵凋亡促進能力。另外，在WT和ATM KO細胞中，更長時間的erastin或RSL 3處理導致更多的細胞死亡。具體地，當與PFTα處理的WT細胞相比時，PFTα處理的ATM KO細胞對erastin和RSL3表現(xiàn)出高得多的不敏感性（圖2 J、2K)?？傊?，這些研究表明ATM決定的細胞鐵死亡，至少部分獨立于TRP53。
圖2：ATM決定的鐵死亡不依賴于TRP53
3.ATM決定了與鐵蛋白相關的鐵自噬
細胞內不穩(wěn)定的游離鐵是決定氧化還原穩(wěn)態(tài)的重要因素之一。細胞可滲透的FerroOrange是一種新型的熒光鐵傳感器，其能夠實現(xiàn)細胞內亞鐵的活細胞熒光成像。鐵凋亡誘導劑導致WT MEF細胞中FerroOrange的熒光增強，而在相同處理下在ATM KO MEF細胞中該熒光大大減弱（圖3A-3C）。此外，在具有穩(wěn)定ATM敲低的HT-1080中也觀察到類似的表型（圖3D-3F），表明ATM在鐵死亡執(zhí)行期間支配細胞內不穩(wěn)定游離鐵的觀點。然而，鐵外排輸出蛋白SLC40A1/FPN（溶質載體家族40成員1）和鐵儲存相細胞溶質鐵主要被鐵蛋白納米籠隔離。據(jù)報道，NCOA4介導的鐵自噬在細胞鐵死亡誘導期間被激活，而一般自噬組分或特異性鐵自噬受體NCOA4的耗竭急劇降低鐵動員，導致細胞不穩(wěn)定鐵庫減少并拮抗鐵細胞凋亡。erastin暴露導致WT MEF細胞中FTHl蛋白增加（圖3G）。在WT MEF細胞中，在erastin暴露期間還觀察到mRNA水平上的升高的FTHl表達，如定量RTPCR測定所示（圖3I）。FTH1在ATM KO MEF細胞穩(wěn)定狀態(tài)下高表達。然而，在erastin暴露期間，在ATM KO細胞中未觀察到FTHl蛋白或mRNA的明顯增加，表明在ATM消融期間鐵蛋白周轉減慢（圖3G和3I）。另外，這在具有RSL3處理的ATM KO細胞中是類似的（圖3 H）。為了進一步證實ATM在確定鐵凋亡相關的鐵蛋白周轉中的重要作用，利用ATM敲低HT-1080細胞，并且我們發(fā)現(xiàn)當ATM沉默時，F(xiàn)THl也高度表達（圖3 J和3 K）。類似地，erastin和RSL3暴露導致對照細胞中FTHl的增加。ATM敲低導致在erastin和RSL3暴露下HT-1080細胞中的惰性FTHl升高（圖3 J和3 K）。此外，erastin暴露導致FTHl轉錄的明顯增加，這在ATM敲低HT-1080中未觀察到（圖3L）。免疫熒光染色顯示，erastin處理促進鐵蛋白和溶酶體的共定位，而這種共定位在ATM KO MEF細胞和ATM敲低HT-1080細胞中受到明顯抑制（圖3M-3 P）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，ATM在鐵蛋白周轉中主導了與鐵死亡相關的鐵自噬。
圖3：ATM決定了與鐵蛋白相關的鐵自噬
4.ATM主導鐵饑餓誘導的鐵自噬
ATM是否僅操縱特異性鐵蛋白沉積相關的鐵自噬或ATM是否能在遺傳上調節(jié)鐵饑餓誘導的鐵自噬是下一個重要的問題。暴露的鐵螯合劑，包括去鐵酮（DFP）和去鐵胺（DFO），導致FTH1在MEF細胞中的快速降解。ATM敲除減弱了DFP和DFO誘導的FTH1降解（圖4A和4B）。另外，ATM抑制劑KU 55933的預處理也阻斷了這種FTHl降解（圖4C和4D）。此外，鐵螯合劑促進FTH1和溶酶體標志物LAMP1的共定位，以及鐵自噬受體NCOA4和自體吞噬體標志物GFP-MAP1LC3的共定ATM的異位表達加速了DFO誘導的FTHl降解（圖4G）。自噬抑制劑氯喹（CQ）急劇地阻止了這種DFO誘導的FTHl降解，即使在ATM過表達的細胞中也是如此（圖4G）。研究發(fā)現(xiàn)，ATG9敲除和通過其抑制劑PIK-III 的PIK3C3/VPS34抑制可以在對照細胞和ATM過度表達細胞中干擾鐵螯合劑誘導的FTHl降解（圖4 H-4J）。這些數(shù)據(jù)進一步證實了ATM激酶在鐵饑餓誘導的鐵自噬中的調節(jié)作用。ATM操縱鐵饑餓誘導的鐵蛋白吞噬似乎是TRP53非依賴性的，因為當與TRP53單敲除AP29細胞相比時，在ATM TRP53雙敲除AP26細胞中仍然觀察到減慢的FTHl降解（圖4K和4L）?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明ATM是鐵自噬的主要調節(jié)劑。然而，在ATM抑制期間，這兩種共定位均被顯著抑制（圖4 E和4F）。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明ATM是鐵自噬的主要調節(jié)因子。
圖4：ATM主導鐵饑餓誘導的鐵自噬
5.ATM磷酸化鐵自噬受體NCOA4
穩(wěn)定的NCOA4通過FTH1的保守精氨酸殘基（Arg23）和NCOA4的C-末端結構域之間的直接相互作用與鐵蛋白結合。在erastin補充期間，觀察到NCOA 4-FTH1相互作用的明顯增加，如通過免疫共沉淀分析所證明的（圖5A）。在平均孵育時間，通過使用泛磷酸化絲氨酸（p-Ser）抗體檢測到明顯的NCOA4磷酸化。重要的是，這種NCOA4磷酸化在erastin處理期間升高（圖5A）。因此，提出假設ATM激酶可能是負責這種NCOA4磷酸化。Erastin處理導致NCOA4磷酸化的升高，而當與相應的對照細胞相比時，這種磷酸化在ATM敲除MEF細胞、ATM TRP53雙敲除AP26細胞和ATM敲低HT-1080細胞中幾乎完全被阻斷（圖5B-5D），表明ATM激酶對于響應于Erastin的這種NCOA 4磷酸化是至關重要的。免疫共沉淀分析顯示S550中的突變幾乎消除了NCOA4磷酸化（圖5E）。為了進一步證實進化上保守的S550殘基（圖5F）是被ATM激酶磷酸化的關鍵位點，通過用合成的NCOA4磷酸肽免疫小鼠，然后親和純化，產(chǎn)生針對磷酸化的S550的多克隆抗體。斑點印跡測定顯示，該抗體對磷酸肽（P-肽）的特異性比對照非磷酸肽（C-肽）高得多（圖5G）。通過使用該抗體，發(fā)現(xiàn)在對照HT-1080細胞中，響應于erastin處理，S550處的NCOA4磷酸化升高。在穩(wěn)態(tài)和erastin處理狀態(tài)下，在ATM沉默的HT-1080細胞中觀察到S550處NCOA4磷酸化的顯著降低（圖5H）。總之，這些數(shù)據(jù)表明ATM在S550殘基處磷酸化NCOA4。
圖5：ATM磷酸化鐵自噬受體NCOA4
6.NCOA4磷酸化對鐵自噬和鐵死亡至關重要
ATM激酶介導的NCOA 4在S550殘基的磷酸化是否影響鐵自噬是下一個重要的問題。免疫共沉淀分析顯示，S550殘基中的突變明顯破壞了NCOA 4-FTH1相互作用（圖6A），表明ATM激酶在S550處的NCOAO4磷酸化可以增強NCOAO4與鐵蛋白的相互作用。為了進一步闡明NCOAO4磷酸化在鐵自噬中的相關性，構建了NCOA4穩(wěn)定敲低HT-1080（圖6 B）。與先前的研究一致，NCOA4沉默由于鐵自噬受損而升高FTHl水平（圖6 B）。此外，NCOA 4敲低深刻地消除了erastin誘導的FTHl增加，而該FTHl增加通過WT NCOA4的異位表達和S237A突變體而不是S550A突變體恢復（圖6 B）。鐵自噬可以更新鐵蛋白，補充細胞內不穩(wěn)定鐵池。采用FerroOrange染色法檢測細胞內不穩(wěn)定鐵的含量。NCOA4基因敲低后，Erastin誘導的熒光增強效應減弱。一致地，WT NCOA4的異位表達和S237A突變體而不是S550A突變體，可以恢復NCOA4敲低的HT-1080細胞中的FerroOrange熒光增強（圖6C），表明在S550殘基處的NCOA4磷酸化對于與鐵死亡相關的鐵自噬和細胞內生物活性鐵的升高是至關重要的。此外，在NCOA4敲低的細胞中，erastin誘導的鐵死亡被急劇消除，而WT NCOA4的異位表達和S237A突變體，而不是S550A突變體，可以恢復NCOA4敲低的HT-1080細胞中的細胞鐵死亡（圖6D和6 E）。類似地，WT NCOA4的異位表達而不是S550A突變體，可以恢復erastin誘導的脂質過氧化反應，這顯著消除NCOA4敲低（圖6 F）。總之，這些數(shù)據(jù)表明，ATM激酶在S550殘基磷酸化NCOA4對于NCOA4鐵蛋白相互作用、鐵自噬介導的細胞游離鐵升高和隨后的鐵死亡執(zhí)行是至關重要的。
圖6：NCOA4磷酸化對于鐵自噬和鐵死亡至關重要
結論
綜上所述，這項研究表明了ATM激酶，DNA損傷反應的主傳感器，是鐵死亡的關鍵上游調節(jié)因子。在機制上，ATM激酶磷酸化鐵自噬受體NCOA4，促進NCOA4-FTH1相互作用以驅動鐵自噬介導的鐵動員并加劇脂質過氧化。深入了解ATM激酶介導的鐵蛋白代謝的病理功能，有助于開發(fā)新的治療策略。
實驗方法
細胞轉染和穩(wěn)轉株的構建，CCK8實驗，流式細胞術檢測凋亡，脂質過氧化物測量，GSH測定，qRT-PCR，western blot，免疫熒光實驗，鐵含量測定，核質分離實驗，免疫沉淀實驗，克隆實驗
參考文獻
Wu, H., Liu, Q., Shan, X., Gao, W., & Chen, Q. (2023). ATM orchestrates ferritinophagy and ferroptosis by phosphorylating NCOA4. Autophagy, 19(7), 2062–2077. https://doi.org/10.1080/15548627.2023.2170960