Kremen2通過阻止SOCS3介導(dǎo)的EGFR降解來驅(qū)動(dòng)非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展

       肺癌是一種常見的惡性腫瘤，是全球癌癥相關(guān)死亡率的主要原因。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占肺癌的85%。NSCLC患者臨床預(yù)后較差，總體5年生存率為15%。靶向治療的出現(xiàn)使NSCLC的治療取得了顯著進(jìn)展，然而患者不可避免地會(huì)出現(xiàn)耐藥。因此，需要基于生物標(biāo)志物的新靶點(diǎn)。Kremen2是一種由473個(gè)氨基酸組成的單跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白，是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因子。有研究報(bào)道，根據(jù)癌癥基因組圖譜（TCGA）分析，在來自18種不同癌癥類型的70%以上組織樣本中，腫瘤組織中的Kremen2表達(dá)水平顯著高于配對(duì)的正常組織，尤其是在Kremen2表達(dá)水平比高10倍以上的鱗狀肺癌中。然而，其在NSCLC中的生物學(xué)功能和臨床意義尚不明確。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）是一種受體酪氨酸激酶，是目前公認(rèn)的治療NSCLC的有效靶點(diǎn)。EGFR的異常活化被認(rèn)為是惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移的主要原因。多種機(jī)制可誘導(dǎo)EGFR的致癌激活，如基因突變、轉(zhuǎn)錄過表達(dá)和EGFR降解缺陷。多項(xiàng)研究表明，EGFR的穩(wěn)定性是調(diào)節(jié)肺癌進(jìn)展的重要決定因素，EGFR降解失調(diào)加速了腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。SOCS蛋白家族是眾所周知的細(xì)胞因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子。SOCS3是SOCS蛋白家族的成員，通過抑制JAK/STAT信號(hào)通路發(fā)揮腫瘤抑制作用。敲除SOCS3會(huì)破壞E3連接酶復(fù)合物的形成，并驅(qū)動(dòng)整合素β1介導(dǎo)的小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移。在之前的研究中，SOCS3主要是基于其甲基化沉默導(dǎo)致功能喪失而在NSCLC中進(jìn)行評(píng)估。該研究發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.3。
技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1. Kremen2在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào)，并與不良預(yù)后相關(guān)
       為了尋找新的與NSCLC相關(guān)的致癌基因，作者在TCGA數(shù)據(jù)庫中檢索了504例有病理信息的肺腺癌樣本，并篩選出57對(duì)配對(duì)的非癌和癌樣本。進(jìn)一步分析這些配對(duì)患者樣本的RNA-seq結(jié)果，并使用一般線性模型（P<0.05）篩選差異表達(dá)基因（DEGs）（圖1A）。分析顯示，Kremen2的表達(dá)存在顯著差異，這在肺癌中尚未被研究過。此外，比較每對(duì)TCGA樣本的原始Kremen2 RNA-seq數(shù)據(jù)后，腫瘤組織中的Kremen2表達(dá)水平較高（圖1B）。采用GEPIA軟件分析Kremen2在NSCLC中的表達(dá)。結(jié)果顯示，與癌旁正常肺組織相比，在NSCLC組織中，尤其是肺鱗狀細(xì)胞癌組織中，Kremen2表達(dá)顯著上調(diào)（圖1C）。
為了評(píng)估Kremen2在NSCLC臨床標(biāo)本中的表達(dá)，作者檢測(cè)了新鮮冷凍的NSCLC標(biāo)本及其配對(duì)的正常組織中Kremen2 mRNA的水平。結(jié)果顯示，與正常組織相比，NSCLC組織中Kremen2 mRNA水平顯著升高（圖1D）。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)到大多數(shù)NSCLC標(biāo)本中Kremen2蛋白水平升高（圖1E）。免疫組織化學(xué)染色進(jìn)一步顯示，腫瘤組織中Kremen2高表達(dá)（圖1F）。此外，作者檢測(cè)了一些NSCLC細(xì)胞系中的Kremen2蛋白水平，發(fā)現(xiàn)在NSCLC細(xì)胞中Kremen2蛋白表達(dá)普遍較高（圖1G）。
       為了闡明Kremen2過表達(dá)與NSCLC患者生存的相關(guān)性，作者使用Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析NSCLC病例。結(jié)果如圖1H和I所示，表明高Kremen2表達(dá)水平的NSCLC患者與較差的總生存期（OS）相關(guān)，如較低的OS和首次進(jìn)展生存期（P<0.05）?？ǚ綑z驗(yàn)顯示，Kremen2表達(dá)上調(diào)與原發(fā)腫瘤（T）分期（P=0.041）和病理分級(jí)（P=0.045）相關(guān)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，Kremen2在NSCLC中過表達(dá)，并且Kremen2過表達(dá)可能與患者的不良預(yù)后相關(guān)。

圖1 Kremen2在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào)，并與不良預(yù)后相關(guān)

2. 沉默NSCLC細(xì)胞中Kremen2表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖
       為了研究Kremen2在NSCLC中的生物學(xué)功能，作者利用CRISPR/Cas9方法產(chǎn)生敲除Kremen2的A549細(xì)胞（A549-krm2ko），其中插入胸腺嘧啶殘基導(dǎo)致移碼突變。通過克隆形成實(shí)驗(yàn)和EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Kremen2對(duì)A549和A549-krm2ko細(xì)胞增殖的影響。A549-Krm2KO細(xì)胞的克隆形成能力低于野生型細(xì)胞（圖2A），EdU陽性細(xì)胞顯著減少，表明細(xì)胞增殖能力下降，而在A549-Krm2KO細(xì)胞中過表達(dá)外源性Flag-Kremen2（Flag-Krm2）時(shí)，edu陽性細(xì)胞比例增加（圖2B），證實(shí)了Kremen2對(duì)細(xì)胞增殖的影響。此外，作者利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA沉默內(nèi)源性Kremen2表達(dá)，建立了穩(wěn)定沉默Kremen2的NSCLC細(xì)胞株。同樣，A549和H1703細(xì)胞（shKrm2）中的Kremen2敲低抑制了集落形成和細(xì)胞增殖能力（圖2D-F）。通過皮下注射穩(wěn)定敲低Kremen2的A549細(xì)胞建立裸鼠移植瘤模型，驗(yàn)證這些體外發(fā)現(xiàn)是否與體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)。在A549異種移植模型中獲得了一致的結(jié)果，敲低Kremen2的表達(dá)顯著抑制了腫瘤的大小和重量（圖2G-I）。IHC染色顯示，由于A549細(xì)胞的Kremen2敲低，A549種植小鼠組織中的ki67陽性細(xì)胞百分比較低（圖2J）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，Kremen2在NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。

圖2 沉默NSCLC細(xì)胞中內(nèi)源性Kremen2表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖

3. Kremen2高表達(dá)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移
       臨床資料顯示，Kremen2的表達(dá)與LUAD患者病理分級(jí)呈正相關(guān)，提示Kremen2可能參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移。為了解決這一問題，作者檢測(cè)了體內(nèi)外Kremen2對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在A549細(xì)胞中，敲除Kremen2可減弱細(xì)胞的侵襲能力，而在A549-krm2ko細(xì)胞中過表達(dá)Flag-Krm2可增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力（圖3A）。同樣，通過shRNA下調(diào)Kremen2表達(dá)后，H1703和A549細(xì)胞的侵襲數(shù)量減少（圖3B，C）。此外，來自傷口愈合實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明，敲低Kremen2降低了細(xì)胞遷移（圖3D-G）。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)沉默Kremen2后NSCLC細(xì)胞中上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）標(biāo)志物的變化，探討其對(duì)NSCLC細(xì)胞EMT的抑制作用。Kremen2敲低和低pro-EMT Snail1和Twist1水平之間存在明顯的正相關(guān)。為了進(jìn)一步了解Kremen2在體內(nèi)是否促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，作者對(duì)A549-Krm2KO細(xì)胞和A549-Krm2KO + OE-Krm2細(xì)胞（A549-Krm2KO細(xì)胞過表達(dá)Kremen2）進(jìn)行了尾靜脈轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，刪除Kremen2減少了肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量，而過表達(dá)Kremen2顯著增加了肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量（圖3H-J）。為了更好地觀察肺內(nèi)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的形成，作者在A549細(xì)胞中構(gòu)建了共表達(dá)GFP的shCtrl和shKrm2細(xì)胞，觀察細(xì)胞的熒光強(qiáng)度（圖3K和L）。將兩種表達(dá)GFP的細(xì)胞注射到裸鼠尾靜脈。HE染色和熒光信號(hào)結(jié)果顯示，在A549細(xì)胞中下調(diào)Kremen2與對(duì)照組相比，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量減少（圖3M-O）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明，Kremen2是NSCLC轉(zhuǎn)移的促進(jìn)因子。

圖3 體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示，Kremen2促進(jìn)NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移

4. Kremen2參與多種癌癥相關(guān)信號(hào)通路
       為了闡明Kremen2促進(jìn)肺癌發(fā)生的機(jī)制，采用RNA-seq比較H1703細(xì)胞中對(duì)照組和Kremen2敲低（shKrm2）組的轉(zhuǎn)錄組變化。根據(jù)表達(dá)的倍數(shù)變化（≥1或≤-1），shKrm2組中共鑒定出273個(gè)上調(diào)基因和281個(gè)下調(diào)基因。對(duì)上調(diào)和下調(diào)基因進(jìn)行層次聚類分析（圖4A）。GO分析表明，DEGs與細(xì)胞增殖、發(fā)育、運(yùn)動(dòng)和遷移密切相關(guān)（圖4B）。KEGG富集分析表明，這些DEGs富集在與癌癥相關(guān)的信號(hào)通路，如MAPK、Wnt和PI3K-AKT信號(hào)通路（圖4C）。由于之前的Kremen2研究多集中在Wnt信號(hào)通路，作者首先檢測(cè)到了Wnt信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的變化。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，敲低Kremen2并沒有顯著影響β-catenin蛋白水平，但增加了H1703細(xì)胞中LRP6的總蛋白和磷酸化水平（圖4D），可能是由于LRP6的內(nèi)吞降解減少。此外，在H1703細(xì)胞中敲低Kremen2后，PI3K（Y607）和AKT（Ser473）的磷酸化水平顯著下調(diào)（圖4E），這與在胃癌中對(duì)Kremen2的研究結(jié)果一致。
       由于STAT3信號(hào)通路的激活已經(jīng)在相當(dāng)比例的NSCLC病例中被報(bào)道，作者也測(cè)試了Kremen2是否調(diào)節(jié)STAT3信號(hào)通路。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示磷酸化JAK2（Y1007和Y1008）和STAT3（Y705）水平下調(diào)，而總JAK2和STAT3水平無變化。與此同時(shí)，STAT3通路中負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的下游因子c-Myc和Cyclin D1蛋白水平也顯著降低（圖4F和G）。相反，過表達(dá)Kremen2增強(qiáng)了p-JAK2、p-STAT3、c-Myc和Cyclin D1蛋白水平（圖4H），表明Kremen2影響了JAK2-STAT3信號(hào)通路。

圖4 抑制Kremen2參與多種癌癥相關(guān)信號(hào)通路

5. Kremen2通過穩(wěn)定EGFR促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖
       考慮到EGFR是JAK2-STAT3和PI3K-AKT信號(hào)通路的上游共同激活因子，在NSCLC的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，作者將從shKrm2 H1703細(xì)胞中篩選的DEGs輸入FunRich軟件進(jìn)行功能分析。結(jié)果顯示大多數(shù)基因聚集在EGFR相關(guān)通路上。然后，作者檢測(cè)了Kremen2是否影響EGFR蛋白水平。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，siRNA介導(dǎo)沉默Kremen2可下調(diào)A549和H1703細(xì)胞中的EGFR蛋白水平（圖5A）。在Kremen2穩(wěn)定敲低的細(xì)胞中，EGFR蛋白水平也降低，而過表達(dá)Kremen2增加了EGFR蛋白水平（圖5B）。作者在A549-Krm2KO細(xì)胞中獲得了類似的結(jié)果。將Flag-tagged Kremen2重新引入A549-Krm2KO細(xì)胞中可恢復(fù)EGFR蛋白水平（圖5C）。如圖5D所示，蛋白酶體抑制劑MG132逆轉(zhuǎn)了Kremen2敲除細(xì)胞中EGFR蛋白水平的下降，表明Kremen2可能通過蛋白酶體降解來調(diào)節(jié)EGFR蛋白水平。作者進(jìn)一步研究了敲低Kremen2是否影響EGF刺激后EGFR的磷酸化。結(jié)果顯示，沉默Kremen2降低了A549和H1703細(xì)胞中EGF誘導(dǎo)的EGFR、STAT3和AKT的磷酸化（圖5E）。為了評(píng)估Kremen2是否通過調(diào)節(jié)EGFR促進(jìn)細(xì)胞增殖，作者在過表達(dá)Kremen2的A549細(xì)胞中去除內(nèi)源性EGFR，觀察到抑制內(nèi)源性EGFR的表達(dá)減弱了Kremen2誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖（圖5F）。相反，在Kremen2敲低的A549細(xì)胞中過表達(dá)EGFR表明外源性EGFR表達(dá)促進(jìn)了Kremen2敲低細(xì)胞的增殖（圖5H）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，在NSCLC中，Kremen2的高表達(dá)水平可能通過維持EGFR的穩(wěn)定性促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

圖5 Kremen2通過促進(jìn)EGFR的穩(wěn)定促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖

6. Kremen2和SOCS3的相互作用可抑制EGFR的泛素化和降解
       為了了解Kremen2是如何調(diào)控EGFR的，作者使用co-IP來下調(diào)參與EGFR信號(hào)通路的Kremen2相互作用蛋白。令人驚訝的是，Kremen2不與EGFR、AKT或STAT3蛋白相互作用，但與STAT3信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子SOCS3強(qiáng)相關(guān)（圖6A）。此外，在A549細(xì)胞（圖6B）中觀察到內(nèi)源性Kremen2和SOCS3共定位。在變性條件下純化外源性SOCS3，然后對(duì)Kremen2進(jìn)行免疫印跡分析，證實(shí)了Kremen2和SOCS3之間的相互作用（圖6C）。接下來，作者分別在A549和A549-oe-krm2細(xì)胞中過表達(dá)SOCS3，以探索SOCS3在Kremen2和EGFR之間關(guān)系中的作用。如圖6D所示，過表達(dá)外源性SOCS3降低了A549細(xì)胞中EGFR蛋白水平和STAT3的磷酸化水平，而穩(wěn)定過表達(dá)Kremen2部分逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象（圖6D）。
       此外，SOCS3過表達(dá)細(xì)胞中EGFR水平的下降被蛋白酶體抑制劑MG132逆轉(zhuǎn)，表明SOCS3通過蛋白酶體降解調(diào)節(jié)EGFR水平（圖6E）。為了進(jìn)一步研究SOCS3是如何調(diào)控EGFR的，作者用cicloheximide處理細(xì)胞并檢測(cè)EGFR的半衰期。結(jié)果表明，過表達(dá)SOCS3可縮短EGFR蛋白的半衰期（圖6F）。接下來，作者對(duì)內(nèi)源性蛋白進(jìn)行了相互共IP。正如預(yù)期的那樣，內(nèi)源性SOCS3與EGFR相互作用（圖6G），而內(nèi)源性EGFR與SOCS3結(jié)合（圖6H）。這些結(jié)果表明SOCS3可以與EGFR結(jié)合并促進(jìn)細(xì)胞中EGFR的降解。
       據(jù)報(bào)道，SOCS3可促進(jìn)TBK1和整合素β1的泛素化和降解；因此，作者接下來研究了SOCS3對(duì)EGFR泛素化的影響。結(jié)果，與對(duì)照組相比，在A549細(xì)胞中過表達(dá)SOCS3增加了EGFR的多泛素化（圖6I）。為了進(jìn)一步研究Kremen2是否影響SOCS3介導(dǎo)的EGFR泛素化，作者進(jìn)行了體外泛素化實(shí)驗(yàn)。在HEK293T細(xì)胞中，F(xiàn)lag-SOCS3和His-EGFR共表達(dá)，在變性條件下純化His-EGFR，隨后對(duì)EGFR進(jìn)行免疫印跡分析，證明在SOCS3過表達(dá)細(xì)胞中外源性EGFR泛素化增加，而Kremen2過表達(dá)導(dǎo)致SOCS3對(duì)EGFR的多泛素化減少（圖6J）。
       綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，Kremen2與SOCS3相互作用，并通過阻止SOCS3介導(dǎo)的EGFR泛素化和降解來穩(wěn)定EGFR蛋白；從而增強(qiáng)EGFR信號(hào)通路的活化，促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

圖6 Kremen2與SOCS3的相互作用抑制EGFR的泛素化和降解

結(jié)論
       該研究證明了Kremen2在NSCLC腫瘤發(fā)生中的新作用。機(jī)制上，Kremen2可能通過與SOCS3相互作用，阻斷泛素依賴的EGFR降解，從而維持EGFR介導(dǎo)的腫瘤信號(hào)通路，促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。因此，Kremen2可能成為NSCLC新的治療靶點(diǎn)。
機(jī)制圖

實(shí)驗(yàn)方法
免疫組織化學(xué)（IHC），菌落形成和EdU測(cè)定，流式細(xì)胞術(shù)，Transwell和傷口愈合測(cè)定，定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR），蛋白質(zhì)印跡，免疫沉淀，免疫熒光，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
參考文獻(xiàn)
Sun Y, Gao Y, Dong M, Li J, Li X, He N, et al. Kremen2 drives the progression of non-small cell lung cancer by preventing SOCS3-mediated degradation of EGFR. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Jun 3;42(1):140.