Cell熱點(diǎn)：大腦皮層類器官聯(lián)合多組學(xué)分析

       要想充分發(fā)揮腦類器官研究人類發(fā)育的作用，就必須了解類器官是否精確復(fù)制了內(nèi)源性細(xì)胞和分子事件，特別是因?yàn)轭惼鞴僦屑?xì)胞身份的獲得可能會(huì)受到異常代謝狀態(tài)的影響。本文展示了人類大腦皮層類器官發(fā)育的綜合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、表觀遺傳組和空間圖譜，包括超過61萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，從神經(jīng)祖細(xì)胞的生成到分化的神經(jīng)元和膠質(zhì)亞型的產(chǎn)生。本研究表明，無(wú)論新陳代謝狀態(tài)如何，細(xì)胞多樣化過程都與內(nèi)源性細(xì)胞密切相關(guān)，因此，可以利用類器官圖譜研究人類命運(yùn)的決定。作者定義了器官發(fā)育過程中皮質(zhì)細(xì)胞類型的縱向分子軌跡，確定了在細(xì)胞系建立過程中具有人類特異性作用的基因，并發(fā)現(xiàn)了人類胼胝體神經(jīng)元的早期轉(zhuǎn)錄多樣性。這些發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證了人類類器官皮質(zhì)發(fā)生綜合圖譜是研究人類皮質(zhì)發(fā)育機(jī)制的首要資源。本文于2022年9月發(fā)表在《Cell》IF：64.5期刊上。
技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、人類皮質(zhì)類器官發(fā)育的單細(xì)胞水平轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組和空間圖譜
       為研究人腦類器官中皮質(zhì)發(fā)生的分子特征和可重復(fù)性，構(gòu)建了一個(gè)縱向單細(xì)胞圖譜，包含類器官發(fā)育6個(gè)月期間的8個(gè)時(shí)間點(diǎn)，涵蓋從早期祖細(xì)胞擴(kuò)增到后期星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的過程（圖1A），并在RNA、染色質(zhì)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平進(jìn)行了分析。本文的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集包含本研究scRNA-seq檢測(cè)出的532,414個(gè)細(xì)胞，并結(jié)合了作者之前發(fā)表的數(shù)據(jù)集，其來(lái)自多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的218,240個(gè)新鑒定出的細(xì)胞，共計(jì)83個(gè)單獨(dú)鑒定出的類器官，來(lái)自多個(gè)干細(xì)胞系和分化批次（圖1A-1B）。表觀基因組數(shù)據(jù)集包括38,017個(gè)核，包括單細(xì)胞ATAC-seq獲得的轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)，并結(jié)合了作者之前發(fā)表的數(shù)據(jù)集，其包含體外培養(yǎng)1、3和6個(gè)月后類器官的11,551個(gè)新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞核，分別跨越了神經(jīng)祖細(xì)胞的擴(kuò)增、興奮性神經(jīng)元多樣性的峰值以及星形膠質(zhì)細(xì)胞和中間神經(jīng)元的出現(xiàn)（圖1C）。此外，納入了通過SHARE-seq分析的42,810個(gè)細(xì)胞，SHARE-seq在從23日至3個(gè)月的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)同時(shí)從同一單細(xì)胞采集了RNA-seq和ATAC-seq分析結(jié)果（圖1D）。最后，空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集包含10個(gè)類器官，這些類器官在體外1、2和3個(gè)月時(shí)通過Slide-seqV2分析得到（圖2），涵蓋興奮性神經(jīng)元的出現(xiàn)和擴(kuò)張，這些神經(jīng)元在體外3個(gè)月時(shí)類器官的多樣性最高。這些數(shù)據(jù)提供了人類皮質(zhì)類器官發(fā)育的綜合多組學(xué)分子圖譜.
       作者評(píng)估了這些細(xì)胞產(chǎn)生的縱向事件在所有類器官的發(fā)育過程中可重復(fù)性，通過計(jì)算每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)的調(diào)整后互信息（AMI）得分，衡量了存在的細(xì)胞類型比例與單個(gè)起源的類器官之間的依賴關(guān)系（圖1E）。在各年齡段和細(xì)胞系中，大多數(shù)重復(fù)的 AMI 分?jǐn)?shù)都與兩個(gè)已發(fā)表的內(nèi)源性人類皮層數(shù)據(jù)集和一個(gè)新生成的胎兒數(shù)據(jù)集相當(dāng)。并且總體而言，scRNA-seq和scATAC-seq定義的細(xì)胞類型之間存在良好的一致性，AMI評(píng)分表明，個(gè)體類器官之間的表觀遺傳變異性與轉(zhuǎn)錄變異性處于相同的低水平（圖1F）。表明這些隨著時(shí)間延伸的類器官數(shù)據(jù)也在多組學(xué)層面展現(xiàn)出了細(xì)胞分化的可重復(fù)性。

圖1 皮質(zhì)類器官發(fā)育的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀遺傳學(xué)景觀

2、類器官發(fā)育過程中細(xì)胞類型的空間組織
       為在其原始空間背景下分析分子和細(xì)胞事件，在1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月時(shí)使用Slide-seqV2進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組分析（圖2）。1個(gè)月時(shí)，頂端放射狀神經(jīng)膠質(zhì)（aRG）祖細(xì)胞簇占據(jù)類器官的中央和周邊區(qū)域（圖2A-2E），Cajal Retzius細(xì)胞、中間祖細(xì)胞（IP）、新生深層（DL）投射神經(jīng)元（PN）和未成熟的DLPN相對(duì)于aRG位于表層。有趣的是，皮質(zhì)邊緣區(qū)和皮質(zhì)下區(qū)的細(xì)胞在很大程度上沒有與皮質(zhì)細(xì)胞類型混合。2個(gè)月時(shí)，aRG在主要由“非特指PN”群體組成的核心周圍形成了一圈玫瑰花結(jié)樣結(jié)構(gòu)（圖2F-2H）。其余的皮質(zhì)細(xì)胞類型主要位于aRG的淺表。外放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（oRG）相對(duì)于aRG進(jìn)行了表面定位（圖2H），反映了這些細(xì)胞在內(nèi)源性組織中的相對(duì)位置。到3個(gè)月時(shí)，可識(shí)別的結(jié)構(gòu)如玫瑰花結(jié)丟失（圖2I-2K），與文獻(xiàn)中研究結(jié)果一致。類器官的內(nèi)核主要由“非特指PN”和aRG構(gòu)成（圖2K）。這些數(shù)據(jù)顯示了皮質(zhì)類器官中細(xì)胞類型的動(dòng)態(tài)變化和優(yōu)先定位，反映了體內(nèi)觀察到的情況。

圖2 發(fā)育的皮質(zhì)類器官的空間轉(zhuǎn)錄組景觀

3、皮質(zhì)類器官捕獲具有細(xì)胞類型和時(shí)間特異性的細(xì)胞身份獲得的縱向胎兒程序
       先前的研究表明皮質(zhì)器官組織和內(nèi)源性人類胎兒組織有相似之處，這些相似性是否擴(kuò)展到所有細(xì)胞類型和發(fā)育的所有步驟還有待探索。為解決這一問題，作者首先確定了每個(gè)階段所有皮質(zhì)細(xì)胞類型的基因表達(dá)標(biāo)簽（圖3A-3B）。接下來(lái)，通過在每種細(xì)胞類型的可及染色質(zhì)區(qū)域鑒定轉(zhuǎn)錄因子（TF）基序富集，并將其與同源TF的表達(dá)進(jìn)行比較，研究了假定的細(xì)胞類型特異性調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果證實(shí)了已知的發(fā)育階段和細(xì)胞類型合適的TF及其基序是與相關(guān)的細(xì)胞群相關(guān)（圖3C）。
       接下來(lái)，試圖確定類器官中識(shí)別皮質(zhì)細(xì)胞類型的分子信號(hào)與內(nèi)源性胎兒皮質(zhì)中定義皮質(zhì)細(xì)胞類型的分子信號(hào)有多密切。將類器官數(shù)據(jù)與兩個(gè)已發(fā)表的scRNA-seq數(shù)據(jù)集中的91,844個(gè)圖譜和60806個(gè)單核RNA測(cè)序集進(jìn)行了整合（圖3D）。以兩種方式評(píng)估相似性，這兩種方式都表明類器官和胎兒皮質(zhì)細(xì)胞類型之間高度一致。
       首先，應(yīng)用了基于隨機(jī)森林分類器的方法。每個(gè)階段的類器官細(xì)胞主要由在胎兒細(xì)胞上訓(xùn)練的分類器分配到相應(yīng)的內(nèi)源性細(xì)胞類型，反之亦然（圖3E-3F）。在用類器官細(xì)胞訓(xùn)練的分類器中，很少有胎兒細(xì)胞被分配給aRG和“未指定的PN”類器官細(xì)胞（圖3F），這表明這兩個(gè)群體與內(nèi)源性細(xì)胞類型的關(guān)系不太密切。
       其次，使用秩-秩超幾何重疊的方法對(duì)類器官和胎兒細(xì)胞中每種皮質(zhì)細(xì)胞類型分別定義的分子特征進(jìn)行了兩兩比較（圖3G）。該方法還顯示了類器官和相應(yīng)內(nèi)源性胎兒細(xì)胞類型之間的高一致性表達(dá)特征（圖3H-3K）。
       重要的是，作者發(fā)現(xiàn)類器官“未指定PN”的分子標(biāo)簽，雖然與Polioudakis等人(2019)的胎兒遷移ExNs、Trevino等人(2021)的GluN 1和5簇以及本文胎兒數(shù)據(jù)集的CPN最接近，但總體上顯示出相對(duì)較弱的一致性，主要是由共同的下調(diào)基因驅(qū)動(dòng)（圖3J）。類似地，類器官aRG的標(biāo)記顯示，從體外2個(gè)月開始的任何時(shí)間點(diǎn)，上調(diào)基因與任何胎兒標(biāo)記都沒有大量重疊（圖3K）。因此，盡管這兩種細(xì)胞類型顯示出與內(nèi)源性細(xì)胞的一些總體轉(zhuǎn)錄相似（圖3E），但它們的轉(zhuǎn)錄特征與這一胎齡范圍內(nèi)細(xì)胞類型特異性胎兒特征的匹配性相對(duì)較弱。

圖3 在具有細(xì)胞類型特異性的皮質(zhì)類器官中建立細(xì)胞身份獲取的縱向胎兒程序

4、人類皮質(zhì)類器官細(xì)胞的類型在很大程度上不受代謝狀態(tài)的影響
       WGCNA確定了一個(gè)模塊，其中包括從體外1.5個(gè)月開始的糖酵解相關(guān)基因，從體外2個(gè)月開始，該模塊在與胎兒細(xì)胞最不相似的兩個(gè)細(xì)胞群中特異性富集，即aRG和“未指定PN”（圖4A和4B）。在類器官發(fā)育的多個(gè)階段，“未指定的PN”和aRG以及其他類型的祖細(xì)胞都富集了糖酵解和缺氧基因集（圖4C和4D）。然而，這與在內(nèi)源性人類胎兒祖細(xì)胞子集中觀察到的這些基因集的富集是相似的（圖4E）。因此，在正常皮質(zhì)祖細(xì)胞發(fā)育過程中觀察到的代謝狀態(tài)也在類器官中相應(yīng)的細(xì)胞類型中觀察到。
       對(duì)器官組織與內(nèi)源性胎兒細(xì)胞在代謝基因表達(dá)方面的差異程度進(jìn)行的更廣泛研究顯示，所有細(xì)胞類型之間的差異都很有限。作者采用三種互補(bǔ)方法： Compass，該方法利用通量平衡分析從 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中模擬單細(xì)胞的代謝狀態(tài)；RRHO2，識(shí)別富集在類器官中上調(diào)而在胎兒細(xì)胞中下調(diào)的基因的過程；以及 MSigDB 代謝基因組的差異表達(dá)。在所有三項(xiàng)分析中，類器官和胎兒細(xì)胞顯示出相似的結(jié)果，只有少數(shù)代謝通路，特別是糖酵解和氧化磷酸化，在類器官中富集（圖4F-4G）。值得注意的是，Compass顯示類器官和內(nèi)源性胎兒細(xì)胞很好地聚集在一起，不能根據(jù)它們的代謝通量進(jìn)行區(qū)分（圖4F-4G）。
       代謝基因在aRG和“非特指PN”群體中的富集可能會(huì)干擾類器官細(xì)胞類型與其內(nèi)源性對(duì)應(yīng)的排列，正如文獻(xiàn)里其他皮質(zhì)類器官模型所建議的那樣。因此，作者從用于訓(xùn)練隨機(jī)森林細(xì)胞類型分類器的可變基因中系統(tǒng)地刪除了38個(gè)MSigDB代謝基因中的每一個(gè)，并評(píng)估了對(duì)結(jié)果細(xì)胞分類的影響。對(duì)于絕大多數(shù)基因集，去除這些基因并沒有顯著改變分配給每種細(xì)胞類型的細(xì)胞數(shù)量（圖4H-4J）。只有兩類代謝過程影響分類：在用3個(gè)月的類器官細(xì)胞訓(xùn)練的分類器中，去除與葡萄糖代謝和缺氧相關(guān)的基因集顯著增加了分配到“未指定PN”和aRG細(xì)胞類型的胎兒細(xì)胞數(shù)量（圖4H-4J）。沒有其他細(xì)胞類型顯示分配增加。重要的是，與凋亡和氧化磷酸化等其他基本亞細(xì)胞過程相關(guān)的基因未顯著改變?nèi)魏翁杭?xì)胞類型向類器官細(xì)胞類型的分配（圖4H）。

圖4 人類皮質(zhì)類器官的細(xì)胞類型在很大程度上不受代謝狀態(tài)的影響

       然后，作者利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)育圖譜來(lái)研究皮質(zhì)類器官細(xì)胞的地形位置和代謝狀態(tài)之間是否存在關(guān)聯(lián)。2個(gè)月和3個(gè)月的類器官內(nèi)部區(qū)域主要由aRG和非特指PN組成（圖2F-2K，圖5A），這兩個(gè)群體的代謝狀態(tài)影響了細(xì)胞身份的分配。值得注意的是，aRG在1個(gè)月和2個(gè)月之間變得更加集中，這與我們的發(fā)現(xiàn)一致，即aRG的身份在1.5個(gè)月開始受到影響（圖5B）。此外，雖然38個(gè)MSigDB代謝通路基因集的表達(dá)在類器官的直徑中是恒定的，但與缺氧和糖酵解相關(guān)的通路在類器官中心的細(xì)胞中富集（圖5C-5D）。值得注意的是，位于類器官內(nèi)部區(qū)域的細(xì)胞顯示出更高的糖酵解和缺氧基因的表達(dá)，這與細(xì)胞的特性無(wú)關(guān)（圖5E）。總之，分析表明，在目前的類器官模型中產(chǎn)生的絕大多數(shù)皮質(zhì)細(xì)胞類型的鑒定不受不同的代謝狀態(tài)的影響，這只影響了兩種細(xì)胞類型（aRG和“非特指PN”）的鑒定，在2-6個(gè)月時(shí)僅占類器官細(xì)胞的3% - 15%。

圖5 代謝受損的細(xì)胞存在于人類皮質(zhì)類器官的一個(gè)有限的中心區(qū)域

5、人類個(gè)體皮質(zhì)細(xì)胞類型發(fā)育的分子邏輯
       前文的結(jié)果表明，可以在類器官中建立適當(dāng)?shù)募?xì)胞多樣性，并且細(xì)胞身份在很大程度上不受代謝狀態(tài)的影響。因此，作者試圖應(yīng)用這種類器官發(fā)育的分子圖譜來(lái)理解人類皮質(zhì)中細(xì)胞譜系的建立，以及與譜系決定相關(guān)的轉(zhuǎn)錄事件。作者利用459,711個(gè)皮層細(xì)胞（不包括未指定的PN）推斷出發(fā)展軌跡。為了突出不同時(shí)間細(xì)胞類型之間的關(guān)系，通過轉(zhuǎn)錄相似性連接了來(lái)自相同和連續(xù)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞簇，同時(shí)保留了細(xì)胞的已知時(shí)間階段（圖6A）。有趣的是，在較晚的時(shí)間點(diǎn)，oRG同時(shí)連接到神經(jīng)元和膠質(zhì)祖細(xì)胞（圖6A）。作為一種補(bǔ)充方法，作者應(yīng)用軌跡推斷算法URD來(lái)生成基于偽時(shí)間有序細(xì)胞轉(zhuǎn)錄相似性的分支軌跡樹（圖6B）。將根定義為存在于體外23天的最早階段的aRG，而尖端定義為每個(gè)皮質(zhì)譜系的終末細(xì)胞類型。在樹中建立的順序反映了細(xì)胞的階段和分化狀態(tài)，基礎(chǔ)祖細(xì)胞在aRG之后，然后分化為神經(jīng)元（CFuPN，CPN）和膠質(zhì)（星形膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞）譜系。
       使用該樹繪制了發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化（圖6C-6D），并確定了與人類皮質(zhì)神經(jīng)元亞型相關(guān)的譜系特異性基因。為此，將這一人類皮質(zhì)樹與已發(fā)表的小鼠發(fā)育皮質(zhì)URD樹進(jìn)行了比較（圖6E）。這一分析揭示了人類類器官樹中的譜系特異性基因，而這些基因在小鼠樹中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式（圖6F）。例如，SORCS1在人類類器官樹中與CFuPN譜系相關(guān)，但在小鼠的多個(gè)皮質(zhì)投射神經(jīng)元中表達(dá)。同樣，PIK3R1在人類中與CPN譜系相關(guān)，但在小鼠中表達(dá)更廣泛。
       為提取與人類細(xì)胞命運(yùn)決定相關(guān)的分子程序，確定了與人類類器官URD樹中每個(gè)譜系分叉相關(guān)的top基因和TF（圖6D）。為了區(qū)分控制這些分叉的哺乳動(dòng)物和人類特有的共享程序，比較了小鼠中與同源分叉相關(guān)的TF。值得注意的是，一些被預(yù)測(cè)在人類神經(jīng)元命運(yùn)中發(fā)揮作用的候選人類調(diào)節(jié)因子沒有1:1的小鼠同源物，包括ZNF26和ZNF37A（圖6G）。
 

圖6 人類皮層細(xì)胞類型的分子發(fā)育

6、人類胼胝體投射神經(jīng)元多樣性在胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)
       作者檢查了樹的終末神經(jīng)元細(xì)胞類型，以研究在成年期CPN基因表達(dá)的異質(zhì)性是否在開發(fā)的早期階段就已經(jīng)可以檢測(cè)到。5種不同CPN類型的標(biāo)記基因在胎兒和類器官CPN的發(fā)育早期都有表達(dá)，CPN中高表達(dá)的標(biāo)志物也在類器官中高表達(dá)，反之亦然（圖7A）。為評(píng)估成年期發(fā)現(xiàn)的分子多樣性是否也可在早期CPN中觀察到，在成年CPN中確定了5個(gè)共變基因程序（模塊），大致代表每種成年CPN類型（圖7B和7C），并在胎兒和類器官CPN中對(duì)它們進(jìn)行了評(píng)分。這5個(gè)模塊在胎兒和類器官CPN中均有表達(dá)。雖然它們的表達(dá)并沒有像在成年期中那樣將發(fā)育中的CPN細(xì)分為5個(gè)亞群，但它們開始將早期發(fā)育的CPN細(xì)分為5個(gè)亞群，其中模塊5表現(xiàn)出最獨(dú)特的模式（圖7D和7E）。因此，雖然成人CPN的完整表達(dá)多樣性還沒有出現(xiàn)，但數(shù)據(jù)表明CPN的分化是一個(gè)開始于早期發(fā)展階段的過程。

圖7

實(shí)驗(yàn)方法
多能干細(xì)胞培養(yǎng)，類器官分化，人胚胎腦組織分離，免疫組織化學(xué)，低氧探針，免疫熒光，腦類器官分離，scRNA-seq及其生物信息學(xué)分析，單細(xì)胞ATAC-seq及其生物信息學(xué)分析，SHARE-seq和bulk ATAC-seq及其生物信息學(xué)分析，Slide-seqV2及其生物信息學(xué)分析，單核RNA測(cè)序及其生物信息學(xué)分析，大腦皮層類器官和人胚胎的細(xì)胞類型比較和匹配分析，WGCNA分析，代謝活動(dòng)評(píng)價(jià)，皮質(zhì)類器官和全腦類器官的比較，代謝基因?qū)?xì)胞分類的影響分析，與代謝相關(guān)的表觀遺傳變化分析，軌跡分析，人類胼胝體投射神經(jīng)元多樣性分析，量化和統(tǒng)計(jì)分析
參考文獻(xiàn)
Uzquiano A, Kedaigle AJ, Pigoni M, Paulsen B, Adiconis X, Kim K, Faits T, Nagaraja S, Antón-Bola?os N, Gerhardinger C, Tucewicz A, Murray E, Jin X, Buenrostro J, Chen F, Velasco S, Regev A, Levin JZ, Arlotta P. Proper acquisition of cell class identity in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex. Cell. 2022 Sep 29;185(20):3770-3788.e27. doi: 10.1016/j.cell.2022.09.010. PMID: 36179669; PMCID: PMC9990683.