瘤內(nèi)微生物群可以預(yù)測(cè)術(shù)后肝細(xì)胞癌的預(yù)后

       肝癌在全球最常見的癌癥中排名第六，在癌癥相關(guān)死亡的主要原因中排名第三。肝細(xì)胞癌（HCC）占所有原發(fā)性肝癌的80%以上。HCC腫瘤由復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境（TME）組成，包含細(xì)胞、化學(xué)和物理成分。TME對(duì)肝細(xì)胞癌的療效和預(yù)后具有重要意義。TME的成分被廣泛認(rèn)為是實(shí)體腫瘤的關(guān)鍵決定因素，影響實(shí)體腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)和進(jìn)展。闡明TME和癌癥之間的關(guān)系可以為識(shí)別新的HCC診斷標(biāo)志物和開發(fā)治療策略提供有價(jià)值的見解。最近的研究在TME中檢測(cè)到微生物群的存在，腫瘤內(nèi)微生物可能通過多種方式影響癌癥的發(fā)生和進(jìn)展。微生物群作為TME中的關(guān)鍵因素受到越來越多的關(guān)注。闡明微生物、TME和癌細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用可以為潛在的癌癥治療提供有價(jià)值的見解，并有助于在個(gè)體患者水平評(píng)估現(xiàn)有治療的有效性。近年來，對(duì)肝癌腫瘤內(nèi)微生物群的研究越來越多。Komiyam等利用16S rDNA測(cè)序確定了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肝癌組織中的微生物群特征。此外一項(xiàng)多組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)微生物群與代謝物和遺傳改變密切相關(guān)。因此，進(jìn)一步研究HCC腫瘤微生物群的概況，明確其臨床意義和預(yù)后價(jià)值勢(shì)在必行。該研究發(fā)表在《Clinical and Translational Medicine》，IF：10.6。
技術(shù)路線

圖形摘要

主要研究結(jié)果
1. 人口學(xué)特征
       收集91例接受了納入/排除程序的患者樣本。中位年齡為55（35~83）歲，83例患者（91.2%）為男性。34例（37.4%）患者飲酒，73例（80.2%）患者感染HBV，15例（16.5%）患者合并2型糖尿病。62例（68.1%）患者被診斷為肝硬化；其中5例Child-Pugh分級(jí)為B級(jí)，其余57例Child-Pugh分級(jí)為a級(jí)。TNM分期I期45例（49.4%），II期19例（20.9%），III期27例（29.7%）。手術(shù)時(shí)無一例參與者發(fā)生淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤分化程度高（30.0%）、中（48.3%）和低（20.9%）。
2. 肝細(xì)胞癌中微生物群的存在
       為了揭示HCC中微生物群的存在，作者使用EUB388探針對(duì)腫瘤樣本進(jìn)行了FISH。FISH信號(hào)檢測(cè)證實(shí)肝細(xì)胞癌中存在細(xì)菌（圖1A）。此外，微生物分布表現(xiàn)出一定的異質(zhì)性。作者通過FISH和免疫熒光共染色進(jìn)一步探索了微生物存在和免疫細(xì)胞之間的關(guān)系。CD8+細(xì)胞中存在一些FISH信號(hào)，表明CD8+細(xì)胞內(nèi)存在細(xì)菌（圖1B）。CD68+巨噬細(xì)胞傾向于分布在腫瘤內(nèi)微生物群較豐富的區(qū)域（圖1C），提示腫瘤內(nèi)微生物群可能影響HCC中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。

圖1 肝細(xì)胞癌中腫瘤內(nèi)微生物群的存在及其與免疫細(xì)胞的共生關(guān)系

3. 腫瘤和鄰近正常組織中的不同微生物譜
       對(duì)91例HCC患者的腫瘤和癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)。α多樣性的Shannon指數(shù)顯示腫瘤和鄰近組織之間沒有顯著差異（p=0.436，圖2A）。利用曼哈頓距離（PCoA）計(jì)算的β多樣性揭示了腫瘤組和正常組之間的顯著差異（p<0.001，圖2B）。此外，偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）還揭示了兩組之間的多樣性（圖2C）。平均而言，4個(gè)細(xì)菌門（變形桿菌、放線菌、厚壁菌和異常球菌-棲熱菌）占據(jù)了90%的序列。這四個(gè)門在腫瘤和鄰近正常組織中均占主導(dǎo)地位（圖2D）。
       使用edgeR，在腫瘤和正常組織之間進(jìn)行差異分析，以識(shí)別顯著失調(diào)的擴(kuò)增子序列（ASV）。分析表明，在腫瘤組織中，15個(gè)ASV上調(diào)，22個(gè)下調(diào)（圖2E）。利用LEfSe方法鑒定有助于區(qū)分腫瘤和正常組織的類群。放線菌、變形桿菌、異常球菌-棲熱菌和厚壁菌可能解釋了兩組之間的差異。作者建立了一個(gè)隨機(jī)森林分類器，該分類器在區(qū)分腫瘤和鄰近組織方面取得了中等性能，準(zhǔn)確率為73.2%。屬于上述四個(gè)門的屬在腫瘤和鄰近組織的預(yù)測(cè)中貢獻(xiàn)最大（圖2F）。
       最后，作者評(píng)估了腫瘤組和正常組分類群之間的相關(guān)性（圖2G）。作者觀察到兩組在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和復(fù)雜度上存在明顯差異。在正常組中，厚壁菌、變形菌和奇球菌屬的ASV之間呈顯著正相關(guān)。在腫瘤組中，雖然變形桿菌和放線菌之間很少存在正相關(guān)，但腫瘤組中各菌群之間的相關(guān)性比鄰近組織中的少。

圖2 肝細(xì)胞癌腫瘤和鄰近正常組織中微生物群的特征

4. 個(gè)體間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性
       每個(gè)個(gè)體的微生物群成被繪制在門水平。如圖3A所示，HCC患者的微生物譜存在顯著差異。作者還確定了每例患者多個(gè)腫瘤病變之間的微生物異質(zhì)性（圖3B）。值得注意的是，樣本P103_tumor_2取自門靜脈的一個(gè)癌栓，表明在轉(zhuǎn)移過程中微生物譜發(fā)生了變化。

圖3 肝細(xì)胞癌中微生物群的個(gè)體或多個(gè)腫瘤病變之間的異質(zhì)性

5. 腫瘤內(nèi)微生物特征和臨床特征之間的相關(guān)性
       進(jìn)一步分析患者的臨床特征（如飲酒、肝硬化、HBV感染、腫瘤分化程度和TNM分期）與微生物譜的關(guān)系。結(jié)果顯示，不同腫瘤分化程度（圖4A和B）或TNM分期（圖4C和D）之間的α和β多樣性沒有顯著差異。
       進(jìn)一步分析上述ASV與HCC患者生化指標(biāo)的關(guān)系。放線菌與總膽汁酸（TBA）水平降低相關(guān)。變形桿菌與總蛋白（TP）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和TBA水平升高相關(guān)，這可能表明肝臟的病理生理狀態(tài)（圖4E）。

圖4 腫瘤內(nèi)微生物群與臨床特征的相關(guān)性

6. 腫瘤內(nèi)微生物群的肝型
       具有抗腫瘤和促進(jìn)腫瘤作用的微生物可能同時(shí)存在于TME中。因此，關(guān)注單一微生物會(huì)忽略TME中微生物標(biāo)簽的全面性。因此，為了全面了解腫瘤內(nèi)微生物群和疾病結(jié)局之間的關(guān)系，作者確定了兩個(gè)簇作為腫瘤內(nèi)微生物譜的“肝型”。
       作者根據(jù)HCC TME中門水平微生物標(biāo)簽的層次聚類分析對(duì)A型和B型的標(biāo)簽進(jìn)行了分類（圖5A）。有趣的是，3例多發(fā)病灶患者的病灶被分為A型和B型，而另外5例多發(fā)病灶患者的所有病灶樣本都被分為A型或B型，而不是兩者都被分為A型或B型。肝B型的α-多樣性顯著高于肝A型（Shannon指數(shù)，p<0.001，圖5B）。兩個(gè)PCoA（圖5C）和PLS-DA（圖5D）表明兩種肝型的β多樣性顯著不同。
       作者進(jìn)一步對(duì)肝型A和肝型B的微生物群落進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)分析（圖5E）。作者發(fā)現(xiàn)了兩種肝型之間不同的網(wǎng)絡(luò)模式。肝A型表現(xiàn)出放線菌和變形桿菌微生物之間復(fù)雜的正相關(guān)關(guān)系，形成相互作用的模式。然而，僅在乙型肝炎中發(fā)現(xiàn)了一些正相關(guān)，表明微生物相互作用的模式相對(duì)分散。

圖5 兩種肝型微生物群的聚類分析和特征

7. 肝型對(duì)肝癌預(yù)后的影響
       對(duì)于3例多發(fā)病灶被分為不同肝型的患者，這些患者被認(rèn)為是A型肝型，Kaplan-Meier分析顯示A型肝型預(yù)后不良（圖6A和B）。A型肝型患者的中位OS為65個(gè)月，而B型肝型患者的中位OS未達(dá)到（p=0.006）。在RFS方面也獲得了類似的結(jié)果，A型肝細(xì)胞癌患者的中位RFS為8個(gè)月，B型肝細(xì)胞癌患者為20個(gè)月（p=0.098）。進(jìn)一步分析顯示，肝型與其他臨床特征（包括TNM分期、飲酒、肝硬化和HBV感染）無關(guān)（圖5A），這提示肝型的微生物聚集可能是獨(dú)立的預(yù)后因素。Cox回歸分析用于證明肝型以及其他重要預(yù)后因素的預(yù)測(cè)能力，包括腫瘤分化程度、腫瘤大小、大血管侵犯和腫瘤數(shù)量。結(jié)果驗(yàn)證了肝型對(duì)OS（HR=0.296，95%CI：0.126-0.699，p=0.005）和RFS（HR=0.504，95%CI：0.276-0.918，p=0.025)的預(yù)測(cè)能力。

圖6 根據(jù)肝類型定義的肝細(xì)胞癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

結(jié)論
       該研究描述了肝癌TME中腫瘤內(nèi)微生物群的特征，并發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)微生物群的模式顯著影響肝癌患者術(shù)后的生存。因此，瘤內(nèi)微生物群可幫助預(yù)測(cè)患者結(jié)局，并且是每種肝型所特有的，表明預(yù)后良好的肝型可能有助于形成良好的TME和患者結(jié)局。

實(shí)驗(yàn)方法
16S rDNA測(cè)序，熒光原位雜交（FISH），免疫熒光
參考文獻(xiàn)
Sun L, Ke X, Guan A, Jin B, Qu J, Wang Y, et al. Intratumoural microbiome can predict the prognosis of hepatocellular carcinoma after surgery. Clin Transl Med. 2023 Jul;13(7):e1331. doi: 10.1002/ctm2.1331.