LncRNA通過調(diào)控Hippo-YAP信號重編程鐵代謝
鐵代謝失調(diào)與癌癥的發(fā)展密切相關(guān)。長鏈非編碼RNA（lncRNA）通過整合信號通路參與各種代謝過程。在本研究中，作者揭示LncRIM能有效將Hippo通路與鐵代謝聯(lián)系起來。LncRIM與 NF2結(jié)合抑制NF2-LATS1相互作用，從而激活YAP并通過DMT1和TFR1增加胞內(nèi)鐵水平。另外，LncRIM-NF2軸介導(dǎo)依賴于Hippo通路的細(xì)胞鐵代謝。臨床上，LncRIM高表達(dá)與患者低生存率相關(guān)，表明其作為生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛在用途。該研究于2023年4月發(fā)表在《Nature Communications》，IF：16.6。
技術(shù)路線
主要研究結(jié)果
1. LncRIM調(diào)節(jié)鐵代謝和乳腺癌進(jìn)展
本研究結(jié)果表明，細(xì)胞鐵水平降低導(dǎo)致YAP失活（圖1a）。為證實(shí)這一結(jié)果，使用Calcein-AM評估用空載體、YAP、活性YAP突變體（YAP-5SA）或無活性YAP突變體（YAPS94A）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞中的細(xì)胞鐵水平。結(jié)果表明，YAP和YAP-5SA過表達(dá)顯著增加鐵水平，而YAP-S94A沒有發(fā)揮這種作用（圖1b，c）。此外，如圖1d，e所示，YAP激活與癌癥鐵水平呈正相關(guān)，表明Hippo通路在細(xì)胞鐵代謝中的潛在作用。
作者根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)庫確定了YAP1依賴性轉(zhuǎn)錄可能需要的40個(gè)lncRNA。然后用鐵螯合劑去鐵胺（DFO）處理MCF-7細(xì)胞以降低細(xì)胞內(nèi)鐵水平，或用檸檬酸鐵銨（FAC）增加胞內(nèi)鐵含量（圖1f）。如圖1g所示，F(xiàn)AC處理促進(jìn)幾種lncRNA表達(dá)，而DFO處理顯著降低幾種lncRNA水平，這表明響應(yīng)FAC和DFO刺激的lncRNA可能參與癌細(xì)胞鐵代謝穩(wěn)態(tài)。作者發(fā)現(xiàn)，敲低LncRIM（一種與鐵代謝相關(guān)的lncRNA）可顯著降低細(xì)胞鐵水平（圖1h）。鑒于LncRIM與腫瘤抑制Hippo信號通路相關(guān)性，作者接下來研究LncRIM和癌癥發(fā)展之間的功能關(guān)系。結(jié)果與對照組相比，LncRIM在腫瘤組織中高度表達(dá)（圖1i）。此外，在獨(dú)立隊(duì)列中，LncRIM高表達(dá)與癌癥患者低生存率相關(guān)（圖1j）。這些數(shù)據(jù)表明LncRIM在癌癥發(fā)展中起重要作用。
作者檢測LncRIM是否協(xié)調(diào)細(xì)胞鐵代謝以誘導(dǎo)乳腺癌進(jìn)展。構(gòu)建LncRIM過表達(dá)或敲低的MCF-7和MDA-MB-468細(xì)胞系。如圖1k、l所示，敲低LncRIM可顯著降低細(xì)胞鐵水平，而過表達(dá)LncRIM則可增加細(xì)胞鐵水平。如圖1m所示，F(xiàn)AC刺激部分逆轉(zhuǎn)LncRIM沉默的MCF-7和MDA-MB-468細(xì)胞中減弱的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期停滯。LncRIM過表達(dá)部分降低DFO對細(xì)胞增殖的抑制作用（圖1n）。這些數(shù)據(jù)表明，鐵穩(wěn)態(tài)對LncRIM調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活很重要。
細(xì)胞鐵代謝受與鐵吸收、儲存和排泄相關(guān)基因調(diào)節(jié)（圖1o）。通過RT-qPCR評估LncRIM敲低或過表達(dá)后這些基因的表達(dá)變化,結(jié)果顯示，LncRIM敲低細(xì)胞系中，TFR1和DMT1表達(dá)顯著降低，而LncRIM過表達(dá)增加這些基因的表達(dá)（圖1p）。此外，LncRIM主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖1q）。這些數(shù)據(jù)揭示了新發(fā)現(xiàn)的胞質(zhì)lncRNA—LncRIM，它在細(xì)胞鐵代謝和乳腺癌發(fā)展中起關(guān)鍵作用。
圖1：LncRIM調(diào)控鐵代謝與乳腺癌進(jìn)展
2. LncRIM與NF2互作使LATS1激酶失活
作者使用MCF-7細(xì)胞裂解物進(jìn)行RNA pull-down，檢測Hippo通路中可能參與LncRIM相關(guān)鐵代謝過程的潛在蛋白。他們發(fā)現(xiàn)有義LncRIM與NF2結(jié)合，NF2是Hippo-YAP信號通路上游重要的膜-細(xì)胞骨架支架（圖2a）。此外，用重組NF2進(jìn)行RNA-蛋白質(zhì)結(jié)合測定驗(yàn)證了LncRIM和NF2之間直接的相互作用（圖2b，c）。用表達(dá)SFB-NF2的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行RNA免疫沉淀（RIP），結(jié)果顯示LncRIM與NF2直接互作（圖2d）。這些數(shù)據(jù)表明LncRIM可能通過NF2相關(guān)機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵代謝。
如RNA熒光原位雜交（FISH）所示（圖2e，f），LncRIM和NF2共定位于細(xì)胞膜。作為腫瘤抑制因子，NF2與激酶LATS1互作并將其募集到質(zhì)膜，導(dǎo)致LATS1磷酸化和胞質(zhì)內(nèi)YAP滯留。接下來，作者評估LncRIM對NF2和LATS1互作以及LATS1向質(zhì)膜募集的影響。如圖2g、h所示，LncRIM過表達(dá)顯著減少NF2和LATS1之間的互作，而LncRIM敲低顯著增加NF2-LATS1的相互作用。免疫熒光（IF）和亞細(xì)胞分級證實(shí)LncRIM降低NF2誘導(dǎo)的LATS1膜易位（圖2i-k）。此外，作者構(gòu)建了兩個(gè)NF2缺失突變體并進(jìn)行蛋白純化（圖2l）。co-IP結(jié)果顯示，C-末端結(jié)構(gòu)域（CTD）-缺失的NF2突變體與野生型NF2同樣有效結(jié)合LncRIM，而FERM結(jié)構(gòu)域缺失的NF2突變株與LncRIM沒有發(fā)生結(jié)合（圖2m）。通過構(gòu)建具有三個(gè)不同截短環(huán)的LncRIM突變體（S1突變體由1-580堿基組成，S2突變體由581-893堿基組成，S3突變體由894-1113堿基組成），發(fā)現(xiàn)LncRIM S1截短對LncRIM-NF2相互作用至關(guān)重要（圖2n）。此外，S1結(jié)構(gòu)域環(huán)恢復(fù)顯著抑制LncRIM沉默的細(xì)胞中LATS1和NF2之間的結(jié)合，顯示與全長LncRIM作用相似結(jié)果（圖2o）。
然后作者評估LncRIM-NF2軸在細(xì)胞鐵代謝中的功能。他們發(fā)現(xiàn)全長LncRIM或S1截短環(huán)過表達(dá)充分恢復(fù)LncRIM沉默細(xì)胞中的細(xì)胞鐵水平（圖2p）。此外，在LncRIM缺失細(xì)胞中敲低NF2部分恢復(fù)YAP激活、DMT1和TFR1表達(dá)以及細(xì)胞鐵水平（圖2q，r）。這些數(shù)據(jù)闡明了一種新機(jī)制，通過該機(jī)制，LncRIM與NF2直接結(jié)合來抑制NF2-LATS1相互作用并調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵代謝（圖2s）。
圖2：LncRIM與NF2互作抑制LATS1激酶
3. LncRIM依賴Hippo-YAP通路調(diào)節(jié)鐵代謝
接下來，作者研究LncRIM-NF2軸介導(dǎo)的細(xì)胞鐵代謝與Hippo-YAP通路之間的聯(lián)系。作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)LncRIM過表達(dá)，LATS1在Ser909和Thr1079以及YAP在Ser127磷酸化降低，DMT1和TFR1表達(dá)增加；相反，LncRIM敲低則觀察到相反的結(jié)果（圖3a，b）。與對照細(xì)胞結(jié)果相反，YAP沉默的MCF-7細(xì)胞中LncRIM過表達(dá)沒有促進(jìn)DMT1和TFR1表達(dá)或是增加鐵水平（圖3c-f）。而YAP的再表達(dá)顯著恢復(fù)DMT1和TFR1以及YAP靶基因的表達(dá)，且表達(dá)水平與LncRIM過表達(dá)誘導(dǎo)結(jié)果相似，細(xì)胞鐵水平同樣得到恢復(fù)（圖3g，h）。這些發(fā)現(xiàn)表明Hippo通路在LncRIM-NF2軸介導(dǎo)的細(xì)胞鐵代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。
先前有研究報(bào)道，TFR1是YAP的下游靶標(biāo)。為確定YAP是否直接調(diào)節(jié)DMT1轉(zhuǎn)錄，使用GEO數(shù)據(jù)庫（GSE107013）分析DMT1啟動子，并鑒定一個(gè)YAP/TEAD4結(jié)合位點(diǎn)（圖3i）。熒光素酶報(bào)告基因和染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP-PCR）結(jié)果顯示YAP直接與DMT1啟動子結(jié)合（圖3j）。此外，DMT1啟動子中YAP/TEAD結(jié)合位點(diǎn)（CATTCT）的缺失顯著減弱YAP-5SA誘導(dǎo)的DMT1啟動子螢光素酶活性（圖3k）。這些結(jié)果表明DMT1是YAP的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。
DMT1 mRNA編碼四種不同的亞型。在所有亞型中，DMT1亞型1（含鐵應(yīng)答元件（IRE）的變異體）在MCF-7和MDA-MB-468細(xì)胞中高度表達(dá)。先前研究報(bào)道，細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)在很大程度上由鐵調(diào)節(jié)蛋白（IRP）/ IRE系統(tǒng)控制。IRP2已被證明可調(diào)節(jié)乳腺癌中的鐵穩(wěn)態(tài)。因此，作者在先前報(bào)道的IRP2系統(tǒng)基礎(chǔ)上比較細(xì)胞鐵代謝中LncRIM-NF2軸的激活。如圖3l，m所示，敲低IRP2顯著降低DMT1和TFR1表達(dá)，然而，LncRIM和YAP過表達(dá)仍然部分挽救DMT1和TFR1表達(dá)以及IRP2敲低后的細(xì)胞鐵水平。上述數(shù)據(jù)共同表明，LncRIM-NF2軸在細(xì)胞鐵代謝中發(fā)揮重要作用，其方式可能與經(jīng)典的IRP/IRE系統(tǒng)不同。
圖3：LncRIM以Hippo-YAP通路依賴方式調(diào)控鐵代謝
4. 鐵觸發(fā)的LncRIM-NF2反饋回路過度激活YAP
在本研究中，LncRIM被證明對鐵刺激有反應(yīng)，并調(diào)節(jié)Hippo信號通路（圖1g和3a，b）。為進(jìn)一步探索細(xì)胞鐵水平對Hippo通路的潛在影響，作者用FAC或DFO刺激MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-468細(xì)胞一定時(shí)間。FAC刺激后，YAP和LATS1磷酸化顯著降低，而DFO刺激增加LATS1和YAP磷酸化水平（圖4a）。如圖4b所示，較低濃度的FAC顯著降低YAP和LATS1磷酸化，而較高濃度的鐵則恢復(fù)這些蛋白的磷酸化水平。作者還發(fā)現(xiàn)FAC或DFO刺激后，LncRIM表達(dá)與YAP激活變化一致（圖4c，d）。熒光素酶報(bào)告基因和ChIP-PCR檢測結(jié)果顯示（4e，f），YAP/TEAD顯著提高LncRIM啟動子螢光素酶活性，并直接與LncRIM啟動子結(jié)合。提示LncRIM Hippo在細(xì)胞鐵代謝中潛在的反饋回路。
此外，作者發(fā)現(xiàn)FAC處理顯著增強(qiáng)LncRIM和NF2的相互作用，并減少NF2與LATS1結(jié)合（圖4g，h），這表明鐵觸發(fā)的LncRIM在鐵誘導(dǎo)Hippo-YAP信號通路激活的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用?？紤]LncRIM-NF2軸對鐵激活的反饋回路，作者用FAC處理對照、LncRIM敲低和LncRIM過表達(dá)的MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞。結(jié)果顯示，F(xiàn)AC處理部分恢復(fù)LncRIM沉默誘導(dǎo)的YAP和LATS1磷酸化，進(jìn)一步增強(qiáng)LncRIM過表達(dá)時(shí)YAP的激活（圖4i，j）。此外，IF結(jié)果顯示，敲低LncRIM導(dǎo)致YAP在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生隔離，而FAC刺激在很大程度上改善YAP向細(xì)胞核的遷移（圖4k，l）?？傊?，這些數(shù)據(jù)證實(shí)鐵觸發(fā)的LncRIM-NF2反饋回路過度激活YAP以促進(jìn)細(xì)胞增殖。
圖4：鐵觸發(fā)的LncRIM-NF2反饋回路過度激活YAP
5. LncRIM-YAP軸介導(dǎo)的鐵代謝促進(jìn)腫瘤進(jìn)展
接下來，作者研究LncRIM-YAP鐵代謝軸在體內(nèi)腫瘤發(fā)生中的作用。LncRIM敲低抑制了異種移植物腫瘤的大小和重量（圖5a-c），并顯著降低細(xì)胞增殖，如Ki67和YAP表達(dá)降低（圖5d）。此外，敲低LncRIM損害血管生成，如CD31（一種內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物）染色強(qiáng)度降低，以及降低細(xì)胞鐵含量，如增強(qiáng)的DAB鐵染色（圖5d，e）。此外，免疫印跡和免疫組織化學(xué)（IHC）染色結(jié)果顯示，在LncRIM沉默的腫瘤中，DMT1和TFR1表達(dá)均降低，LATS1和YAP磷酸化水平升高，YAP下游靶標(biāo)表達(dá)降低（圖5f，g）。這些結(jié)果表明LncRIM介導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展與細(xì)胞鐵代謝呈正相關(guān)。
為進(jìn)一步驗(yàn)證LncRIM介導(dǎo)的細(xì)胞鐵代謝與腫瘤生長之間的相關(guān)性，作者構(gòu)建LncRIM過表達(dá)和LncRIM過表達(dá)的DMT1和TFR1雙敲低細(xì)胞系，隨后將每個(gè)細(xì)胞系直接注射裸鼠。如圖5h–k所示，敲低DMT1和TFR1導(dǎo)致LncRIM介導(dǎo)的異種移植腫瘤生長顯著降低，且這種降低伴隨著細(xì)胞鐵水平以及Ki67和YAP表達(dá)降低（圖5j，k）。這些結(jié)果在一定程度上證明LncRIM-NF2軸通過上調(diào)細(xì)胞鐵代謝促進(jìn)細(xì)胞增殖和乳腺癌生長。
圖5：LncRIM-YAP軸介導(dǎo)的鐵代謝促進(jìn)腫瘤進(jìn)展
6. LncRIM高表達(dá)與癌癥患者臨床結(jié)果不良相關(guān)
LncRIM與YAP密切相關(guān)，可促進(jìn)鐵代謝重編程和腫瘤生長，因此也可能在病理上參與了乳腺癌發(fā)展。為驗(yàn)證這一假設(shè)，作者使用RT-qPCR檢測LncRIM在癌組織隊(duì)列中的表達(dá)，將這些數(shù)據(jù)分為LncRIM-低組和LncRIR-高組，并通過IHC進(jìn)一步檢測其與增殖、血管生成和鐵代謝的相關(guān)性。如圖6a，b所示，LncRIM高表達(dá)與Ki67和CD31呈正相關(guān)，它們分別是增殖和血管生成的標(biāo)志物。在癌癥中，LncRIM高表達(dá)與YAP、DMT1和TFR1表達(dá)以及細(xì)胞鐵水平增加呈正相關(guān)（圖6a）。用Perl藍(lán)對鐵和免疫細(xì)胞標(biāo)記物CD45進(jìn)行雙重染色，結(jié)果顯示LncRIM介導(dǎo)的鐵水平變化主要位于乳腺癌細(xì)胞（圖6a）。
此外，在乳腺癌患者樣本中，LncRIM表達(dá)與YAP靶基因（包括CTGF、CYR61、DMT1和TFR1）呈正相關(guān)（圖6c，d）。DMT1和TFR1在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于對照組（圖6e，f），且獨(dú)立隊(duì)列中DMT1和TFR1高表達(dá)與乳腺癌患者低生存率相關(guān)（圖6g，h）。這些數(shù)據(jù)表明LncRIM-NF2-DMT1/TFR1軸可能成為癌癥臨床治療靶點(diǎn)（圖6i）。
圖6：LncRIM高表達(dá)與乳腺癌患者臨床結(jié)果不良相關(guān)
結(jié)論
本研究揭示了一種新的鐵代謝相關(guān)機(jī)制，其中LncRIM直接結(jié)合NF2觸發(fā)YAP激活，然后促進(jìn)DMT1和TFR1表達(dá)，最終提高細(xì)胞鐵水平并促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。此外，作者證明LncRIM-Hippo軸以獨(dú)立于IRP2的方式發(fā)揮作用，并引起與IRP2類似的生物學(xué)效應(yīng)，包括增加DMT1和TFR1表達(dá)以及細(xì)胞鐵水平。作者還驗(yàn)證了鐵觸發(fā)的LncRIM-NF2反饋回路，該回路反過來過度激活YAP。
實(shí)驗(yàn)方法
RNA pull-down，RT-qPCR，敲低細(xì)胞系和過表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建，RIP，免疫熒光，ChIP-PCR，WB，IHC，免疫熒光染色，重組蛋白表達(dá)及純化，熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)構(gòu)建
參考文獻(xiàn)
He XY, Fan X, Qu L, Wang X, Jiang L, Sang LJ, Shi CY, Lin S, Yang JC, Yang ZZ, Lei K, Li JH, Ju HQ, Yan Q, Liu J, Wang F, Shao J, Xiong Y, Wang W, Lin A. LncRNA modulates Hippo-YAP signaling to reprogram iron metabolism. Nat Commun. 2023 Apr 20;14(1):2253. doi: 10.1038/s41467-023-37871-5. PMID: 37080959; PMCID: PMC10119135.