SEC63激活ACLY可通過代謝重編程促進內質網(wǎng)應激下的肝細胞癌轉移

       內質網(wǎng)（ER）在蛋白質折疊、修飾和運輸中發(fā)揮重要作用。內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)對缺氧、營養(yǎng)和致癌激活等環(huán)境刺激高度敏感。這些刺激降低了內質網(wǎng)的效率，導致錯誤折疊或未折疊的蛋白在內質網(wǎng)腔內堆積，這一事件稱為內質網(wǎng)應激。通常，錯誤折疊的蛋白無法離開內質網(wǎng)，并可能通過蛋白激酶RNA樣內質網(wǎng)激酶（PERK）、肌醇需要酶1（IRE1α）和轉錄激活因子6（ATF6）三個分支最終啟動被定義為未折疊蛋白反應（UPR）的信號級聯(lián)。UPR的啟動將通過減慢蛋白翻譯或增加ER的折疊能力來減輕ER的負擔，以支持細胞存活。腫瘤細胞的快速增殖需要蛋白質合成的急性增加，從而不可避免地引起UPR。癌細胞可以劫持內質網(wǎng)應激通路支持其惡性活動。UPR信號失調常伴隨著腫瘤細胞生長、侵襲能力和耐藥性的上調。然而，腫瘤細胞劫持內質網(wǎng)應激的潛在機制尚未完全闡明。眾所周知，代謝重塑是腫瘤細胞適應生物合成途徑以及對微環(huán)境刺激提供特定適應性特征的標志。乙酰輔酶A是中樞代謝中間產物之一。然而，在內質網(wǎng)應激下，癌細胞是否通過調控乙酰輔酶A代謝重編程來維持惡性狀態(tài)仍不確定。該研究發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.3。
技術路線

主要研究結果
1. ACLY高表達與HCC患者不良預后相關
       為了探索乙酰輔酶A代謝重編程對HCC細胞內質網(wǎng)應激的影響，作者分析了來自三個HCC隊列（包括TCGA-LIHC，ICGC-LIRI-JP和GSE101728）的HCC組織和癌旁組織中的乙酰輔酶A代謝相關基因（ARGs）的表達模式。將每個數(shù)據(jù)集的差異表達ARG合并在維恩圖中，并確定重疊基因（圖1A）。接下來，作者使用毒胡蘿卜素（TG）和衣霉素（TM）作為內質網(wǎng)應激的誘導劑來模擬不利的微環(huán)境刺激，并在腫瘤細胞中評估上調基因的表達水平。如圖1B所示，內質網(wǎng)應激后只有ACLY上調。這些數(shù)據(jù)表明，ACLY可能在調節(jié)內質網(wǎng)應激下的肝癌細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。為了分析ACLY在HCC中的臨床相關性，作者檢測了139例HCC樣本中ACLY的表達，并將患者分為兩組（ACLY低表達組和ACLY高表達組）。與非腫瘤組織相比，ACLY在腫瘤組織中增加，在B/C期上調（圖1C）。生存分析顯示，與ACLY低表達組相比，ACLY高表達預示著更短的總生存（OS）和無病生存（DFS）時間（圖1D）。同樣，來自TCGA隊列或ICGC-LIRI-JP隊列的數(shù)據(jù)分析也顯示，ACLY過表達與HCC患者的不良預后相關（圖1E）。

圖1 在HCC細胞中，ACLY被SEC63上調以響應內質網(wǎng)應激

2. ACLY在內質網(wǎng)應激時被SEC63上調
       進一步分析毒胡蘿卜素和衣霉素處理后肝癌細胞中ACLY的表達水平。如圖1F所示，內質網(wǎng)應激標志物的GRP78顯著升高，提示內質網(wǎng)應激誘導成功。TM或TG短期干預后，ACLY表達上調，與GRP78相似。然而，當誘導藥物處理細胞較長時間（24h）時，ACLY降低，表明嚴重的內質網(wǎng)應激不能上調ACLY。由于過度的內質網(wǎng)應激誘導細胞死亡是眾所周知的，作者接下來確定了ACLY在原始內質網(wǎng)應激下被激活的潛在機制。通過免疫共沉淀（Co-IP）和質譜分析，發(fā)現(xiàn)與內質網(wǎng)應激相關的潛在ACLY結合蛋白。定位分析發(fā)現(xiàn)7個蛋白為ER相關蛋白（圖1G）。在這些蛋白中，SEC63因為其調節(jié)內質網(wǎng)應激的作用而特別受關注。Co-IP實驗顯示SEC63確實與ACLY有相互作用（圖1H），并且這種相互作用被內質網(wǎng)應激增強（圖1I）。ACLY的SEC63結合區(qū)域被縮小到CoA連接酶結構域（圖1J）。此外，SEC63的c端是與ACLY相互作用所必需的（圖1K）。最后，在SEC63缺失的細胞中，內質網(wǎng)應激不能誘導ACLY（圖1L），這表明在內質網(wǎng)應激下，ACLY的激活需要SEC63?？傊?，這些結果表明，ACLY在內質網(wǎng)應激中被SEC63上調。
3. 內質網(wǎng)應激時，SEC63在T537被磷酸化
       SEC63在內質網(wǎng)應激時如何被激活尚不清楚。作者觀察到SEC63的核定位以及SEC63的一部分在內質網(wǎng)應激下從細胞質轉位到細胞核（圖2A-D）。之前的研究報道SEC63是ER常駐蛋白。為了進一步證實作者的結果，作者用COMPARTMENTS預測了SEC63的亞細胞定位。預測提示SEC63除了定位于ER外，還定位于細胞質和細胞核。JPred4識別了核定位信號（NLS），表明殘基510-546區(qū)域可能是SEC63核定位所必需的（圖2E）。作者構建了SEC63缺失突變體（delN），該突變體缺乏NLS。事實上，免疫熒光和蛋白印跡分析表明，在正常條件下或內質網(wǎng)應激下，delN沒有核定位（圖2F-G）。綜上所述，這些結果表明內質網(wǎng)應激誘導SEC63從細胞質轉位到細胞核。
       研究SEC63在內質網(wǎng)應激下的激活機制具有重要的意義。由于SEC63與IRE1α結合，作者推測IRE1α通過其激酶活性磷酸化SEC63。在TM或TG處理的細胞中檢測到SEC63的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化（圖2H），表明SEC63在內質網(wǎng)應激后被磷酸化。磷酸化位點由PhosphoSitePlus預測為Thr537（圖2I）。然后，作者通過用丙氨酸取代Thr537來消除磷酸化，從而創(chuàng)建了SEC63突變體，并發(fā)現(xiàn)野生型（WT）SEC63的免疫沉淀中可檢測到磷酸化，但在SEC63- t537a的免疫沉淀中不能檢測到磷酸化（圖2J）。為了進一步研究Thr537磷酸化對SEC63功能的影響，作者制備了t537磷酸化特異性抗體（T537-p）來識別t537磷酸化。因此，使用T537-p抗體，作者也觀察到SEC63在T537的磷酸化在內質網(wǎng)應激時增加（圖2K）。此外，內質網(wǎng)應激后，F(xiàn)lag-SEC63而不是Flag-SEC63 T537A被磷酸化（圖2L）。此外，KIRA6對IRE1α的抑制顯著降低了ACLY的表達水平和SEC63在Thr537的磷酸化（圖2M）。這些數(shù)據(jù)表明，內質網(wǎng)應激時SEC63的Thr537位點被磷酸化。
       值得注意的是，Thr537位于SEC63的NLS。因此，磷酸化是否影響SEC63從細胞質轉位到細胞核尚不清楚。此外，T537A突變降低了SEC63和ACLY的相互作用，而T537E突變增加了相互作用（圖2N）。因此，這些結果表明，在內質網(wǎng)應激后，Thr537位點的磷酸化促進了SEC63的核定位，并增強了SEC63與ACLY的相互作用。

圖2 內質網(wǎng)應激后，SEC63在Thr537位點被磷酸化。

4. SEC63通過拮抗KLHL25提高ACLY的穩(wěn)定性
       由于內質網(wǎng)應激下ACLY的激活需要SEC63的參與，因此作者研究了SEC63對ACLY的調控機制。如圖3A所示，敲除SEC63降低了肝癌細胞中ACLY的蛋白水平。同樣，SEC63和SEC63 S3突變體的過表達上調了ACLY的表達水平，但SEC63 S1和S2突變體沒有這一作用（圖3B）。與SEC63野生型相比，SEC63 T537A突變體對ACLY表達水平的影響較弱，而SEC63 T537E突變體對ACLY表達水平的影響較強（圖3C），說明SEC63的磷酸化增強了其對ACLY的功能。此外，下調SEC63對ACLY的mRNA水平?jīng)]有影響，ACLY的mRNA水平在響應內質網(wǎng)應激時沒有改變（圖3D），表明SEC63本身可能調節(jié)ACLY的穩(wěn)定性。為了證實這一假設，作者使用了CHX（一種核糖體阻滯藥物）來阻斷蛋白翻譯，并分析了ACLY的穩(wěn)定性。如圖3E所示，在SEC63缺失的細胞中，ACLY的穩(wěn)定性受到損害。過表達SEC63提高了ACLY的穩(wěn)定性，而SEC63 T537A突變體減弱了這一作用（圖3F）。
       泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）對控制ACLY穩(wěn)定性至關重要。因此，作者使用蛋白酶體抑制劑MG132來確定SEC63介導的ACLY穩(wěn)定是否依賴于UPS。加入MG132后，SEC63減少的ACLY被逆轉，表明SEC63通過蛋白酶體依賴途徑調節(jié)ACLY水平（圖3G）。在內質網(wǎng)應激下，肝癌細胞中ACLY的泛素化水平降低，而敲低SEC63后，這種作用幾乎不可見（圖3H）。此外，當SEC63被敲除時，ACLY的泛素化上調（圖3I）。同樣，過表達SEC63抑制ACLY的泛素化，而SEC63的T537A突變減弱了這一作用（圖3J）。這些結果表明，SEC63通過抑制ACLY的泛素化來增加ACLY的穩(wěn)定性。接下來，作者揭示了SEC63影響ACLY泛素化的機制。CUL3通過其接頭蛋白KLHL25與ACLY相互作用，從而泛素化并降解ACLY。有趣的是，SEC63與片段A3（氨基酸621~820）結合（圖1J），而片段A3也與KLHL25相互作用，這表明SEC63可能與KLHL25競爭與ACLY的結合。事實上，F(xiàn)lag-SEC63抑制了KLHL25和ACLY之間的相互作用，并且這一作用被SEC63的磷酸化增強（圖3K）。此外，作者在對照組細胞中觀察到內質網(wǎng)應激后KLHL25和ACLY之間的相互作用減少，而不是在去除SEC63的細胞中（圖3L）。在SEC63缺失的細胞中，內質網(wǎng)應激未能誘導ACLY穩(wěn)定（圖1L）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明SEC63通過對抗KLHL25和ACLY之間的相互作用來提高ACLY的穩(wěn)定性。

圖3 SEC63增加了ACLY的穩(wěn)定性

5. SEC63高表達與HCC患者不良預后相關
       考慮到SEC63被內質網(wǎng)應激激活并上調ACLY，作者接下來分析了SEC63與HCC的臨床相關性。作者首先在139例HCC標本中檢測到SEC63的表達（圖4A）。SEC63在HCC組織中表達上調，在臨床B/C期升高（圖4B）。SEC63在HCC患者中的高表達與較短的OS和DFS時間相關（圖4C-D）。TCGA-LIHC隊列的數(shù)據(jù)分析也一致表明，與SEC63低表達的患者相比，SEC63高表達預測的臨床結局較差（圖4E-F）。鑒于SEC63在晚期（B/C）HCC中高于早期（0/A）HCC，作者探索了SEC63或ACLY表達與HCC轉移的關系，發(fā)現(xiàn)與非轉移的HCC組織相比，SEC63和ACLY在轉移的HCC組織中表達增加（圖4G）。綜上所述，這些結果表明，SEC63和ACLY表達水平升高與HCC轉移相關，可作為HCC不良預后的潛在指標。
       此外，與SEC63低表達組相比，ACLY在SEC63過表達的HCC組織中表達上調（圖4H）。通過免疫印跡法進一步檢測12例配對的人HCC癌組織和配對的非癌組織中SEC63和ACLY的表達（圖4I），SEC63和ACLY在HCC組織中的表達顯著相關。重要的是，單因素和多因素Cox回歸分析顯示，除Edmondson分級、轉移和腫瘤大小外，SEC63的表達也被確定為HCC患者預后的獨立預后指標（圖4J-K）。最后，生存分析顯示，SEC63和ACLY表達共上調的患者OS最短（圖4L）。與SEC63和/或ACLY低表達的患者相比，SEC63和ACLY表達的共上調也預測了最差的DFS（圖4M）。這些結果表明，SEC63和ACLY的共同上調在HCC進展中起重要作用。

圖4 SEC63與HCC患者的預后有關

6. SEC63依賴于ACLY促進肝癌細胞轉移
       值得注意的是，SEC63的高表達與肝癌轉移相關。因此，作者確定了SEC63在肝癌細胞轉移中的功能作用。在HCC細胞中，內源性SEC63被穩(wěn)定敲低，異位SEC63被穩(wěn)定過表達。過表達SEC63導致HepG2和Huh7細胞的遷移和侵襲顯著增加（圖5A）。這些現(xiàn)象在ACLY敲除的細胞中未觀察到。同樣，敲低SEC63降低了肝癌細胞的遷移和侵襲能力（圖5B）。劃痕實驗進一步證實，在ACLY表達的細胞中，過表達SEC63促進肝癌細胞的遷移（圖5C）。同樣，SEC63敲低降低了肝癌細胞的遷移能力（圖5D）。為了驗證這些結果，作者進一步通過靜脈注射細胞到裸鼠體內來研究SEC63敲低或過表達對肝癌移植瘤體內轉移的影響。如圖5E所示，SEC63的缺失減少了肺轉移瘤的形成。同樣，SEC63的表達增加促進了肺轉移的形成（圖5F）。此外，ACLY敲低或ACLY抑制劑（ECT1002）主要抑制SEC63介導的轉移（圖5F）。綜上所述，作者的結果表明SEC63通過調節(jié)ACLY來增強HCC的轉移，并且靶向SEC63顯示出抑制HCC進展的潛力。

圖5 SEC63依賴于ACLY促進肝癌細胞轉移

7. SEC63通過上調Snail1表達誘導肝癌細胞發(fā)生上皮-間充質轉化（EMT）
       為了闡明SEC63促進肝癌轉移的機制，作者使用純化的SEC63敲除細胞和對照細胞的RNA進行了RNA測序。共有433個基因被鑒定為差異表達（圖6A）。STRING蛋白互作分析顯示，前15個hub基因主要參與細胞遷移和侵襲（圖6B）。在這些基因中，Snail1（由SNAI1編碼）是EMT的重要轉錄因子，EMT是公認的腫瘤細胞轉移的生物學過程。因此，作者研究了SEC63對肝癌細胞中Snail1及其下游靶點表達的影響。在過表達SEC63的HCC細胞中，Snail1和Vimentin（兩種間質標志物）的mRNA水平顯著升高，而E-cadherin（上皮標志物）的mRNA水平降低（圖6C）。蛋白質印跡法也顯示了類似的作用（圖6D）。此外，敲除SEC63降低了Snail1和Vimentin的表達，而增加了E-cadherin的表達（圖6E）。蛋白質印跡法也顯示，SEC63敲除導致Snail1表達下降（圖6F）。在異種移植組織中，SEC63水平與Snail1顯著相關（圖6G）。SEC63通過調控Snail1的表達促進肝癌細胞EMT。
       為了分析SEC63是否通過下調Snail1的表達誘導肝癌細胞轉移，作者在SEC63敲除的細胞中重新引入Snail1。如圖6H所示，重新引入Snail1表達顯著逆轉了SEC63敲除后降低的EMT表型，恢復到與對照細胞相似的水平。此外，在Snail1抑制的細胞中，SEC63的過表達對肝癌細胞的遷移和侵襲沒有影響（圖6I）。SEC63上調Snail1的表達是否需要ACLY是一個值得關注的問題。作者發(fā)現(xiàn)，ACLY缺失顯著減弱了SEC63對Snail1表達水平和組蛋白H3乙?；降挠绊懀▓D6J）。另一方面，內質網(wǎng)應激下Snail1的水平也增加（圖6K）?？傊琒EC63通過穩(wěn)定ACLY上調Snail1的表達來增強HCC的轉移，這一作用在內質網(wǎng)應激下增強。

圖6 SEC63在肝癌細胞中調控Snail1的表達

8. SEC63促進ACLY相關的代謝重編程
       ACLY是催化檸檬酸鹽轉化為草乙酸鹽和乙酰輔酶A的關鍵酶，而乙酰輔酶A是生物合成脂類（包括游離脂肪酸、膽固醇和磷脂）的基石。當內質網(wǎng)應激時，IREα通路增加脂質生物合成以支持內質網(wǎng)膜。此外，ACLY介導的乙酰輔酶A生成調節(jié)對腫瘤代謝重編程也至關重要。因此，研究SEC63是否調控ACLY相關的代謝重編程具有重要意義。SEC63過表達增加了細胞乙酰輔酶A水平和脂質水平（圖7A-B）。SEC63 T537A突變減弱了這種作用。此外，在沒有ACLY的情況下，SEC63對HCC細胞的乙酰輔酶A和脂質水平影響很小。此外，在對照組細胞中，內質網(wǎng)應激后乙酰輔酶A水平增加，但在ACLY抑制的細胞中沒有（圖7C）。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明，SEC63增強ACLY介導的乙酰輔酶A生成，從而增加脂質生成，以支持內質網(wǎng)應激時的內質網(wǎng)膜。

圖7 SEC63調節(jié)ACLY相關的代謝和表觀遺傳重編程

9. SEC63改變表觀遺傳重編程，從而增強UPR
       細胞乙酰輔酶A水平在組蛋白乙?；木S持中起重要作用。為了進一步闡明SEC63介導的ACLY穩(wěn)定的作用，作者分析了SEC63缺失后的組蛋白乙酰化水平。SEC63敲除后，組蛋白H3乙?；斤@著下降。此外，在ACLY敲除的細胞中，SEC63敲除后未發(fā)現(xiàn)這一效應（圖6J）。因此，這些結果表明，SEC63上調ACLY通過增加細胞乙酰輔酶A水平促進H3乙?；?。
ACLY相關組蛋白乙?；瘏⑴c調控下游基因的轉錄。內質網(wǎng)應激后，IRE1α被激活，誘導具有活性的轉錄因子XBP1s的表達。XBP1s上調UPR靶基因的表達，如ER伴侶蛋白和脂質代謝。ACLY是否參與調控UPR靶基因尚不清楚。為了解決這一問題，作者分析了SEC63和ACLY對UPR靶基因的影響。如圖7D所示，在內質網(wǎng)應激條件下，SEC63的缺失顯著降低了靶基因的表達。敲低ACLY后，這種作用消失了。同時，SEC63敲低后，這些基因啟動子區(qū)域的H3乙?；浇档?，而當ACLY被沉默時，這種作用被消除（圖7E）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)揭示了SEC63特異性地上調ACLY提供了足夠的乙酰輔酶A，從而改變表觀遺傳特征，支持UPR。
       有趣的是，作者觀察到，與對照細胞相比，SEC63敲除細胞中SNAI1啟動子區(qū)H3乙酰化水平降低（圖7E），這與SEC63敲除細胞中Snail1的表達降低一致（圖6E）。這些結果表明SEC63表觀遺傳調控Snail1的表達。為了闡明潛在的機制，作者鑒定了SEC63相互作用蛋白對內質網(wǎng)應激的影響。通路分析發(fā)現(xiàn)SEC63相互作用蛋白主要富集在代謝通路、ER蛋白加工、黏附相關蛋白等。此外，作者還發(fā)現(xiàn)SMAD3可以促進Snail1轉錄。在SMAD3敲除的細胞中，SEC63不能調節(jié)Snail1的表達（圖7F），表明SEC63以SMAD3依賴的方式上調Snail1。SMAD3 K20和K117位點的乙酰化對于增強SMAD3介導的轉錄活性至關重要。作者假設SEC63通過穩(wěn)定ACLY提供乙酰輔酶A來增加SMAD3的乙酰化。為了驗證這種可能性，作者證實了SEC63和SMAD3之間的結合，并且這種相互作用在內質網(wǎng)應激時增強（圖7G）。此外，內質網(wǎng)應激時SMAD3的乙?；@著增加，而敲低SEC63則降低了SMAD3的乙?；▓D7H），表明SEC63對內質網(wǎng)應激下SMAD3乙?；闹匾浴＜韧芯勘砻?，IRE1α/STAT3信號通路增加內質網(wǎng)應激后SMAD3的磷酸化，這對于SMAD3的核轉位必不可少。SEC63對SMAD3的磷酸化影響較小，提示SEC63主要在細胞核內調控SMAD3。由于賴氨酸乙酰轉移酶6A（KAT6A）是SMAD3的關鍵乙酰轉移酶，作者測試了用KAT6A抑制劑（WM1119）處理細胞時，SEC63或ACLY敲低對SMAD3乙酰化的作用。結果表明，在KAT6A被抑制后，SEC63或ACLY的敲低對SMAD3乙酰化水平?jīng)]有影響（圖7I）。因此，SEC63通過與SMAD3結合并穩(wěn)定ACLY提供乙酰輔酶A來增加SMAD3的乙?；?。此外，敲低SEC63降低了SMAD3與SNAI1啟動子的相互作用（圖7J）。構建乙?；毕莸腟MAD3 2KR突變體和乙?；M的SMAD3 2KQ突變體后，作者觀察到2KR突變體降低了SMAD3與SNAI1啟動子的結合，而2KQ增加了SMAD3與SNAI1啟動子的結合。重要的是，SEC63只影響野生型SMAD3與SNAI1啟動子的結合（圖7K），表明SEC63相關的SMAD3乙酰化調節(jié)SMAD3介導的SNAI1轉錄。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，在內質網(wǎng)應激下，與SEC63相關的SMAD3乙酰化表觀遺傳促進Snail1的表達，從而促進HCC在細胞核內的轉移。
結論
       該研究報道了IRE1α-SEC63-ACLY信號通路在調節(jié)肝癌代謝和轉移中的重要作用。內質網(wǎng)應激后，SEC63在T537被IRE1α通路磷酸化。磷酸化的SEC63隨后上調ACLY的穩(wěn)定性，產生更多的乙酰輔酶A。乙酰輔酶A的升高用于脂肪生成，組蛋白乙?；糜赨PR靶基因的轉錄。同時，SEC63通過增加SMAD3乙?；T導Snail1表達，促進癌細胞轉移。這些發(fā)現(xiàn)強調了一種癌癥選擇性適應，即HCC細胞部署與內質網(wǎng)應激相關的反應來維持細胞存活并啟動細胞轉移。
機制圖

實驗方法
蛋白質印跡，免疫共沉淀（Co-IP），跨孔遷移和侵襲測定，傷口愈合測定，免疫組織化學（IHC），免疫熒光（IF），實時熒光定量PCR（RT-qPCR），染色質免疫沉淀（ChIP），GST pull-down，RNA測序，動物實驗
參考文獻
Hu C, Xin Z, Sun X, Hu Y, Zhang C, Yan R, et al. Activation of ACLY by SEC63 deploys metabolic reprogramming to facilitate hepatocellular carcinoma metastasis upon endoplasmic reticulum stress. J Exp Clin Cancer Res. 2023 May 1; 42(1):108. doi: 10.1186/s13046-023-02656-7.