SEC63激活A(yù)CLY可通過(guò)代謝重編程促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下的肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移

       內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）在蛋白質(zhì)折疊、修飾和運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)對(duì)缺氧、營(yíng)養(yǎng)和致癌激活等環(huán)境刺激高度敏感。這些刺激降低了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的效率，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)堆積，這一事件稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。通常，錯(cuò)誤折疊的蛋白無(wú)法離開(kāi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并可能通過(guò)蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、肌醇需要酶1（IRE1α）和轉(zhuǎn)錄激活因子6（ATF6）三個(gè)分支最終啟動(dòng)被定義為未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）的信號(hào)級(jí)聯(lián)。UPR的啟動(dòng)將通過(guò)減慢蛋白翻譯或增加ER的折疊能力來(lái)減輕ER的負(fù)擔(dān)，以支持細(xì)胞存活。腫瘤細(xì)胞的快速增殖需要蛋白質(zhì)合成的急性增加，從而不可避免地引起UPR。癌細(xì)胞可以劫持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路支持其惡性活動(dòng)。UPR信號(hào)失調(diào)常伴隨著腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲能力和耐藥性的上調(diào)。然而，腫瘤細(xì)胞劫持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的潛在機(jī)制尚未完全闡明。眾所周知，代謝重塑是腫瘤細(xì)胞適應(yīng)生物合成途徑以及對(duì)微環(huán)境刺激提供特定適應(yīng)性特征的標(biāo)志。乙酰輔酶A是中樞代謝中間產(chǎn)物之一。然而，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下，癌細(xì)胞是否通過(guò)調(diào)控乙酰輔酶A代謝重編程來(lái)維持惡性狀態(tài)仍不確定。該研究發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.3。
技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1. ACLY高表達(dá)與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)
       為了探索乙酰輔酶A代謝重編程對(duì)HCC細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，作者分析了來(lái)自三個(gè)HCC隊(duì)列（包括TCGA-LIHC，ICGC-LIRI-JP和GSE101728）的HCC組織和癌旁組織中的乙酰輔酶A代謝相關(guān)基因（ARGs）的表達(dá)模式。將每個(gè)數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)ARG合并在維恩圖中，并確定重疊基因（圖1A）。接下來(lái)，作者使用毒胡蘿卜素（TG）和衣霉素（TM）作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)劑來(lái)模擬不利的微環(huán)境刺激，并在腫瘤細(xì)胞中評(píng)估上調(diào)基因的表達(dá)水平。如圖1B所示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后只有ACLY上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，ACLY可能在調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下的肝癌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。為了分析ACLY在HCC中的臨床相關(guān)性，作者檢測(cè)了139例HCC樣本中ACLY的表達(dá)，并將患者分為兩組（ACLY低表達(dá)組和ACLY高表達(dá)組）。與非腫瘤組織相比，ACLY在腫瘤組織中增加，在B/C期上調(diào)（圖1C）。生存分析顯示，與ACLY低表達(dá)組相比，ACLY高表達(dá)預(yù)示著更短的總生存（OS）和無(wú)病生存（DFS）時(shí)間（圖1D）。同樣，來(lái)自TCGA隊(duì)列或ICGC-LIRI-JP隊(duì)列的數(shù)據(jù)分析也顯示，ACLY過(guò)表達(dá)與HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)（圖1E）。

圖1 在HCC細(xì)胞中，ACLY被SEC63上調(diào)以響應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

2. ACLY在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)被SEC63上調(diào)
       進(jìn)一步分析毒胡蘿卜素和衣霉素處理后肝癌細(xì)胞中ACLY的表達(dá)水平。如圖1F所示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的GRP78顯著升高，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)成功。TM或TG短期干預(yù)后，ACLY表達(dá)上調(diào)，與GRP78相似。然而，當(dāng)誘導(dǎo)藥物處理細(xì)胞較長(zhǎng)時(shí)間（24h）時(shí)，ACLY降低，表明嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不能上調(diào)ACLY。由于過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞死亡是眾所周知的，作者接下來(lái)確定了ACLY在原始內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下被激活的潛在機(jī)制。通過(guò)免疫共沉淀（Co-IP）和質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的潛在ACLY結(jié)合蛋白。定位分析發(fā)現(xiàn)7個(gè)蛋白為ER相關(guān)蛋白（圖1G）。在這些蛋白中，SEC63因?yàn)槠湔{(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用而特別受關(guān)注。Co-IP實(shí)驗(yàn)顯示SEC63確實(shí)與ACLY有相互作用（圖1H），并且這種相互作用被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增強(qiáng)（圖1I）。ACLY的SEC63結(jié)合區(qū)域被縮小到CoA連接酶結(jié)構(gòu)域（圖1J）。此外，SEC63的c端是與ACLY相互作用所必需的（圖1K）。最后，在SEC63缺失的細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不能誘導(dǎo)ACLY（圖1L），這表明在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下，ACLY的激活需要SEC63?？傊@些結(jié)果表明，ACLY在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中被SEC63上調(diào)。
3. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，SEC63在T537被磷酸化
       SEC63在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)如何被激活尚不清楚。作者觀察到SEC63的核定位以及SEC63的一部分在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核（圖2A-D）。之前的研究報(bào)道SEC63是ER常駐蛋白。為了進(jìn)一步證實(shí)作者的結(jié)果，作者用COMPARTMENTS預(yù)測(cè)了SEC63的亞細(xì)胞定位。預(yù)測(cè)提示SEC63除了定位于ER外，還定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。JPred4識(shí)別了核定位信號(hào)（NLS），表明殘基510-546區(qū)域可能是SEC63核定位所必需的（圖2E）。作者構(gòu)建了SEC63缺失突變體（delN），該突變體缺乏NLS。事實(shí)上，免疫熒光和蛋白印跡分析表明，在正常條件下或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下，delN沒(méi)有核定位（圖2F-G）。綜上所述，這些結(jié)果表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)SEC63從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核。
       研究SEC63在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下的激活機(jī)制具有重要的意義。由于SEC63與IRE1α結(jié)合，作者推測(cè)IRE1α通過(guò)其激酶活性磷酸化SEC63。在TM或TG處理的細(xì)胞中檢測(cè)到SEC63的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化（圖2H），表明SEC63在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后被磷酸化。磷酸化位點(diǎn)由PhosphoSitePlus預(yù)測(cè)為T(mén)hr537（圖2I）。然后，作者通過(guò)用丙氨酸取代Thr537來(lái)消除磷酸化，從而創(chuàng)建了SEC63突變體，并發(fā)現(xiàn)野生型（WT）SEC63的免疫沉淀中可檢測(cè)到磷酸化，但在SEC63- t537a的免疫沉淀中不能檢測(cè)到磷酸化（圖2J）。為了進(jìn)一步研究Thr537磷酸化對(duì)SEC63功能的影響，作者制備了t537磷酸化特異性抗體（T537-p）來(lái)識(shí)別t537磷酸化。因此，使用T537-p抗體，作者也觀察到SEC63在T537的磷酸化在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)增加（圖2K）。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，F(xiàn)lag-SEC63而不是Flag-SEC63 T537A被磷酸化（圖2L）。此外，KIRA6對(duì)IRE1α的抑制顯著降低了ACLY的表達(dá)水平和SEC63在Thr537的磷酸化（圖2M）。這些數(shù)據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)SEC63的Thr537位點(diǎn)被磷酸化。
       值得注意的是，Thr537位于SEC63的NLS。因此，磷酸化是否影響SEC63從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核尚不清楚。此外，T537A突變降低了SEC63和ACLY的相互作用，而T537E突變?cè)黾恿讼嗷プ饔茫▓D2N）。因此，這些結(jié)果表明，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，Thr537位點(diǎn)的磷酸化促進(jìn)了SEC63的核定位，并增強(qiáng)了SEC63與ACLY的相互作用。

圖2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，SEC63在Thr537位點(diǎn)被磷酸化。

4. SEC63通過(guò)拮抗KLHL25提高ACLY的穩(wěn)定性
       由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下ACLY的激活需要SEC63的參與，因此作者研究了SEC63對(duì)ACLY的調(diào)控機(jī)制。如圖3A所示，敲除SEC63降低了肝癌細(xì)胞中ACLY的蛋白水平。同樣，SEC63和SEC63 S3突變體的過(guò)表達(dá)上調(diào)了ACLY的表達(dá)水平，但SEC63 S1和S2突變體沒(méi)有這一作用（圖3B）。與SEC63野生型相比，SEC63 T537A突變體對(duì)ACLY表達(dá)水平的影響較弱，而SEC63 T537E突變體對(duì)ACLY表達(dá)水平的影響較強(qiáng)（圖3C），說(shuō)明SEC63的磷酸化增強(qiáng)了其對(duì)ACLY的功能。此外，下調(diào)SEC63對(duì)ACLY的mRNA水平?jīng)]有影響，ACLY的mRNA水平在響應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)沒(méi)有改變（圖3D），表明SEC63本身可能調(diào)節(jié)ACLY的穩(wěn)定性。為了證實(shí)這一假設(shè)，作者使用了CHX（一種核糖體阻滯藥物）來(lái)阻斷蛋白翻譯，并分析了ACLY的穩(wěn)定性。如圖3E所示，在SEC63缺失的細(xì)胞中，ACLY的穩(wěn)定性受到損害。過(guò)表達(dá)SEC63提高了ACLY的穩(wěn)定性，而SEC63 T537A突變體減弱了這一作用（圖3F）。
       泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）對(duì)控制ACLY穩(wěn)定性至關(guān)重要。因此，作者使用蛋白酶體抑制劑MG132來(lái)確定SEC63介導(dǎo)的ACLY穩(wěn)定是否依賴于UPS。加入MG132后，SEC63減少的ACLY被逆轉(zhuǎn)，表明SEC63通過(guò)蛋白酶體依賴途徑調(diào)節(jié)ACLY水平（圖3G）。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下，肝癌細(xì)胞中ACLY的泛素化水平降低，而敲低SEC63后，這種作用幾乎不可見(jiàn)（圖3H）。此外，當(dāng)SEC63被敲除時(shí)，ACLY的泛素化上調(diào)（圖3I）。同樣，過(guò)表達(dá)SEC63抑制ACLY的泛素化，而SEC63的T537A突變減弱了這一作用（圖3J）。這些結(jié)果表明，SEC63通過(guò)抑制ACLY的泛素化來(lái)增加ACLY的穩(wěn)定性。接下來(lái)，作者揭示了SEC63影響ACLY泛素化的機(jī)制。CUL3通過(guò)其接頭蛋白KLHL25與ACLY相互作用，從而泛素化并降解ACLY。有趣的是，SEC63與片段A3（氨基酸621~820）結(jié)合（圖1J），而片段A3也與KLHL25相互作用，這表明SEC63可能與KLHL25競(jìng)爭(zhēng)與ACLY的結(jié)合。事實(shí)上，F(xiàn)lag-SEC63抑制了KLHL25和ACLY之間的相互作用，并且這一作用被SEC63的磷酸化增強(qiáng)（圖3K）。此外，作者在對(duì)照組細(xì)胞中觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后KLHL25和ACLY之間的相互作用減少，而不是在去除SEC63的細(xì)胞中（圖3L）。在SEC63缺失的細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未能誘導(dǎo)ACLY穩(wěn)定（圖1L）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明SEC63通過(guò)對(duì)抗KLHL25和ACLY之間的相互作用來(lái)提高ACLY的穩(wěn)定性。

圖3 SEC63增加了ACLY的穩(wěn)定性

5. SEC63高表達(dá)與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)
       考慮到SEC63被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活并上調(diào)ACLY，作者接下來(lái)分析了SEC63與HCC的臨床相關(guān)性。作者首先在139例HCC標(biāo)本中檢測(cè)到SEC63的表達(dá)（圖4A）。SEC63在HCC組織中表達(dá)上調(diào)，在臨床B/C期升高（圖4B）。SEC63在HCC患者中的高表達(dá)與較短的OS和DFS時(shí)間相關(guān)（圖4C-D）。TCGA-LIHC隊(duì)列的數(shù)據(jù)分析也一致表明，與SEC63低表達(dá)的患者相比，SEC63高表達(dá)預(yù)測(cè)的臨床結(jié)局較差（圖4E-F）。鑒于SEC63在晚期（B/C）HCC中高于早期（0/A）HCC，作者探索了SEC63或ACLY表達(dá)與HCC轉(zhuǎn)移的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)移的HCC組織相比，SEC63和ACLY在轉(zhuǎn)移的HCC組織中表達(dá)增加（圖4G）。綜上所述，這些結(jié)果表明，SEC63和ACLY表達(dá)水平升高與HCC轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為HCC不良預(yù)后的潛在指標(biāo)。
       此外，與SEC63低表達(dá)組相比，ACLY在SEC63過(guò)表達(dá)的HCC組織中表達(dá)上調(diào)（圖4H）。通過(guò)免疫印跡法進(jìn)一步檢測(cè)12例配對(duì)的人HCC癌組織和配對(duì)的非癌組織中SEC63和ACLY的表達(dá)（圖4I），SEC63和ACLY在HCC組織中的表達(dá)顯著相關(guān)。重要的是，單因素和多因素Cox回歸分析顯示，除Edmondson分級(jí)、轉(zhuǎn)移和腫瘤大小外，SEC63的表達(dá)也被確定為HCC患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)（圖4J-K）。最后，生存分析顯示，SEC63和ACLY表達(dá)共上調(diào)的患者OS最短（圖4L）。與SEC63和/或ACLY低表達(dá)的患者相比，SEC63和ACLY表達(dá)的共上調(diào)也預(yù)測(cè)了最差的DFS（圖4M）。這些結(jié)果表明，SEC63和ACLY的共同上調(diào)在HCC進(jìn)展中起重要作用。

圖4 SEC63與HCC患者的預(yù)后有關(guān)

6. SEC63依賴于ACLY促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移
       值得注意的是，SEC63的高表達(dá)與肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此，作者確定了SEC63在肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的功能作用。在HCC細(xì)胞中，內(nèi)源性SEC63被穩(wěn)定敲低，異位SEC63被穩(wěn)定過(guò)表達(dá)。過(guò)表達(dá)SEC63導(dǎo)致HepG2和Huh7細(xì)胞的遷移和侵襲顯著增加（圖5A）。這些現(xiàn)象在ACLY敲除的細(xì)胞中未觀察到。同樣，敲低SEC63降低了肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖5B）。劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，在ACLY表達(dá)的細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)SEC63促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移（圖5C）。同樣，SEC63敲低降低了肝癌細(xì)胞的遷移能力（圖5D）。為了驗(yàn)證這些結(jié)果，作者進(jìn)一步通過(guò)靜脈注射細(xì)胞到裸鼠體內(nèi)來(lái)研究SEC63敲低或過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌移植瘤體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響。如圖5E所示，SEC63的缺失減少了肺轉(zhuǎn)移瘤的形成。同樣，SEC63的表達(dá)增加促進(jìn)了肺轉(zhuǎn)移的形成（圖5F）。此外，ACLY敲低或ACLY抑制劑（ECT1002）主要抑制SEC63介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移（圖5F）。綜上所述，作者的結(jié)果表明SEC63通過(guò)調(diào)節(jié)ACLY來(lái)增強(qiáng)HCC的轉(zhuǎn)移，并且靶向SEC63顯示出抑制HCC進(jìn)展的潛力。

圖5 SEC63依賴于ACLY促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移

7. SEC63通過(guò)上調(diào)Snail1表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）
       為了闡明SEC63促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制，作者使用純化的SEC63敲除細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞的RNA進(jìn)行了RNA測(cè)序。共有433個(gè)基因被鑒定為差異表達(dá)（圖6A）。STRING蛋白互作分析顯示，前15個(gè)hub基因主要參與細(xì)胞遷移和侵襲（圖6B）。在這些基因中，Snail1（由SNAI1編碼）是EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子，EMT是公認(rèn)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的生物學(xué)過(guò)程。因此，作者研究了SEC63對(duì)肝癌細(xì)胞中Snail1及其下游靶點(diǎn)表達(dá)的影響。在過(guò)表達(dá)SEC63的HCC細(xì)胞中，Snail1和Vimentin（兩種間質(zhì)標(biāo)志物）的mRNA水平顯著升高，而E-cadherin（上皮標(biāo)志物）的mRNA水平降低（圖6C）。蛋白質(zhì)印跡法也顯示了類似的作用（圖6D）。此外，敲除SEC63降低了Snail1和Vimentin的表達(dá)，而增加了E-cadherin的表達(dá)（圖6E）。蛋白質(zhì)印跡法也顯示，SEC63敲除導(dǎo)致Snail1表達(dá)下降（圖6F）。在異種移植組織中，SEC63水平與Snail1顯著相關(guān)（圖6G）。SEC63通過(guò)調(diào)控Snail1的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT。
       為了分析SEC63是否通過(guò)下調(diào)Snail1的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，作者在SEC63敲除的細(xì)胞中重新引入Snail1。如圖6H所示，重新引入Snail1表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了SEC63敲除后降低的EMT表型，恢復(fù)到與對(duì)照細(xì)胞相似的水平。此外，在Snail1抑制的細(xì)胞中，SEC63的過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲沒(méi)有影響（圖6I）。SEC63上調(diào)Snail1的表達(dá)是否需要ACLY是一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題。作者發(fā)現(xiàn)，ACLY缺失顯著減弱了SEC63對(duì)Snail1表達(dá)水平和組蛋白H3乙?；降挠绊懀▓D6J）。另一方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下Snail1的水平也增加（圖6K）?？傊琒EC63通過(guò)穩(wěn)定ACLY上調(diào)Snail1的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)HCC的轉(zhuǎn)移，這一作用在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下增強(qiáng)。

圖6 SEC63在肝癌細(xì)胞中調(diào)控Snail1的表達(dá)

8. SEC63促進(jìn)ACLY相關(guān)的代謝重編程
       ACLY是催化檸檬酸鹽轉(zhuǎn)化為草乙酸鹽和乙酰輔酶A的關(guān)鍵酶，而乙酰輔酶A是生物合成脂類（包括游離脂肪酸、膽固醇和磷脂）的基石。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，IREα通路增加脂質(zhì)生物合成以支持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。此外，ACLY介導(dǎo)的乙酰輔酶A生成調(diào)節(jié)對(duì)腫瘤代謝重編程也至關(guān)重要。因此，研究SEC63是否調(diào)控ACLY相關(guān)的代謝重編程具有重要意義。SEC63過(guò)表達(dá)增加了細(xì)胞乙酰輔酶A水平和脂質(zhì)水平（圖7A-B）。SEC63 T537A突變減弱了這種作用。此外，在沒(méi)有ACLY的情況下，SEC63對(duì)HCC細(xì)胞的乙酰輔酶A和脂質(zhì)水平影響很小。此外，在對(duì)照組細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后乙酰輔酶A水平增加，但在ACLY抑制的細(xì)胞中沒(méi)有（圖7C）。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明，SEC63增強(qiáng)ACLY介導(dǎo)的乙酰輔酶A生成，從而增加脂質(zhì)生成，以支持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。

圖7 SEC63調(diào)節(jié)ACLY相關(guān)的代謝和表觀遺傳重編程

9. SEC63改變表觀遺傳重編程，從而增強(qiáng)UPR
       細(xì)胞乙酰輔酶A水平在組蛋白乙?；木S持中起重要作用。為了進(jìn)一步闡明SEC63介導(dǎo)的ACLY穩(wěn)定的作用，作者分析了SEC63缺失后的組蛋白乙?；?。SEC63敲除后，組蛋白H3乙?；斤@著下降。此外，在ACLY敲除的細(xì)胞中，SEC63敲除后未發(fā)現(xiàn)這一效應(yīng)（圖6J）。因此，這些結(jié)果表明，SEC63上調(diào)ACLY通過(guò)增加細(xì)胞乙酰輔酶A水平促進(jìn)H3乙酰化。
ACLY相關(guān)組蛋白乙?；瘏⑴c調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，IRE1α被激活，誘導(dǎo)具有活性的轉(zhuǎn)錄因子X(jué)BP1s的表達(dá)。XBP1s上調(diào)UPR靶基因的表達(dá)，如ER伴侶蛋白和脂質(zhì)代謝。ACLY是否參與調(diào)控UPR靶基因尚不清楚。為了解決這一問(wèn)題，作者分析了SEC63和ACLY對(duì)UPR靶基因的影響。如圖7D所示，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，SEC63的缺失顯著降低了靶基因的表達(dá)。敲低ACLY后，這種作用消失了。同時(shí)，SEC63敲低后，這些基因啟動(dòng)子區(qū)域的H3乙?；浇档?，而當(dāng)ACLY被沉默時(shí)，這種作用被消除（圖7E）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)揭示了SEC63特異性地上調(diào)ACLY提供了足夠的乙酰輔酶A，從而改變表觀遺傳特征，支持UPR。
       有趣的是，作者觀察到，與對(duì)照細(xì)胞相比，SEC63敲除細(xì)胞中SNAI1啟動(dòng)子區(qū)H3乙?；浇档停▓D7E），這與SEC63敲除細(xì)胞中Snail1的表達(dá)降低一致（圖6E）。這些結(jié)果表明SEC63表觀遺傳調(diào)控Snail1的表達(dá)。為了闡明潛在的機(jī)制，作者鑒定了SEC63相互作用蛋白對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。通路分析發(fā)現(xiàn)SEC63相互作用蛋白主要富集在代謝通路、ER蛋白加工、黏附相關(guān)蛋白等。此外，作者還發(fā)現(xiàn)SMAD3可以促進(jìn)Snail1轉(zhuǎn)錄。在SMAD3敲除的細(xì)胞中，SEC63不能調(diào)節(jié)Snail1的表達(dá)（圖7F），表明SEC63以SMAD3依賴的方式上調(diào)Snail1。SMAD3 K20和K117位點(diǎn)的乙?；瘜?duì)于增強(qiáng)SMAD3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性至關(guān)重要。作者假設(shè)SEC63通過(guò)穩(wěn)定ACLY提供乙酰輔酶A來(lái)增加SMAD3的乙?；榱蓑?yàn)證這種可能性，作者證實(shí)了SEC63和SMAD3之間的結(jié)合，并且這種相互作用在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)增強(qiáng)（圖7G）。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)SMAD3的乙酰化顯著增加，而敲低SEC63則降低了SMAD3的乙?；▓D7H），表明SEC63對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下SMAD3乙?；闹匾浴＜韧芯勘砻?，IRE1α/STAT3信號(hào)通路增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后SMAD3的磷酸化，這對(duì)于SMAD3的核轉(zhuǎn)位必不可少。SEC63對(duì)SMAD3的磷酸化影響較小，提示SEC63主要在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控SMAD3。由于賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶6A（KAT6A）是SMAD3的關(guān)鍵乙酰轉(zhuǎn)移酶，作者測(cè)試了用KAT6A抑制劑（WM1119）處理細(xì)胞時(shí)，SEC63或ACLY敲低對(duì)SMAD3乙?；淖饔?。結(jié)果表明，在KAT6A被抑制后，SEC63或ACLY的敲低對(duì)SMAD3乙?；?jīng)]有影響（圖7I）。因此，SEC63通過(guò)與SMAD3結(jié)合并穩(wěn)定ACLY提供乙酰輔酶A來(lái)增加SMAD3的乙?；４送?，敲低SEC63降低了SMAD3與SNAI1啟動(dòng)子的相互作用（圖7J）。構(gòu)建乙?；毕莸腟MAD3 2KR突變體和乙?；M的SMAD3 2KQ突變體后，作者觀察到2KR突變體降低了SMAD3與SNAI1啟動(dòng)子的結(jié)合，而2KQ增加了SMAD3與SNAI1啟動(dòng)子的結(jié)合。重要的是，SEC63只影響野生型SMAD3與SNAI1啟動(dòng)子的結(jié)合（圖7K），表明SEC63相關(guān)的SMAD3乙?；{(diào)節(jié)SMAD3介導(dǎo)的SNAI1轉(zhuǎn)錄。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下，與SEC63相關(guān)的SMAD3乙酰化表觀遺傳促進(jìn)Snail1的表達(dá)，從而促進(jìn)HCC在細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。
結(jié)論
       該研究報(bào)道了IRE1α-SEC63-ACLY信號(hào)通路在調(diào)節(jié)肝癌代謝和轉(zhuǎn)移中的重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，SEC63在T537被IRE1α通路磷酸化。磷酸化的SEC63隨后上調(diào)ACLY的穩(wěn)定性，產(chǎn)生更多的乙酰輔酶A。乙酰輔酶A的升高用于脂肪生成，組蛋白乙?；糜赨PR靶基因的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，SEC63通過(guò)增加SMAD3乙?；T導(dǎo)Snail1表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了一種癌癥選擇性適應(yīng)，即HCC細(xì)胞部署與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的反應(yīng)來(lái)維持細(xì)胞存活并啟動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
機(jī)制圖

實(shí)驗(yàn)方法
蛋白質(zhì)印跡，免疫共沉淀（Co-IP），跨孔遷移和侵襲測(cè)定，傷口愈合測(cè)定，免疫組織化學(xué)（IHC），免疫熒光（IF），實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR），染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP），GST pull-down，RNA測(cè)序，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
參考文獻(xiàn)
Hu C, Xin Z, Sun X, Hu Y, Zhang C, Yan R, et al. Activation of ACLY by SEC63 deploys metabolic reprogramming to facilitate hepatocellular carcinoma metastasis upon endoplasmic reticulum stress. J Exp Clin Cancer Res. 2023 May 1; 42(1):108. doi: 10.1186/s13046-023-02656-7.