RARRES2調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝重編程以介導(dǎo)三陰性乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)展

       乳腺癌是全世界女性中最常見的癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。腦轉(zhuǎn)移（BrM）是乳腺癌最致命的形式。三陰性乳腺癌（TNBC）是最具侵襲性的亞型，多達(dá)46%的患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移。盡管近年來系統(tǒng)治療取得了進(jìn)展，但乳腺癌腦轉(zhuǎn)移（BCBrM）的治療仍具有挑戰(zhàn)性。因此，作者迫切需要提高對BCBrM，尤其是TNBC亞型的潛在機制的理解。癌細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的代謝重編程以支持轉(zhuǎn)移能力，其中之一是脂質(zhì)代謝重編程。最近的證據(jù)表明，能轉(zhuǎn)移到大腦的乳腺癌細(xì)胞具有獨特的脂質(zhì)代謝特征，干擾這些細(xì)胞的脂質(zhì)代謝可抑制BrM。這些有限的發(fā)現(xiàn)闡明了脂質(zhì)代謝重編程在BrM中的潛在重要性，但其確切的潛在機制還遠(yuǎn)未完全闡明。維甲酸受體反應(yīng)蛋白2（RARRES2）是一種重要的調(diào)節(jié)脂肪生成和脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝的脂肪因子。已有多項研究報道了RARRES2在癌癥發(fā)生發(fā)展中具有腫瘤抑制作用，但目前對RARRES2在癌細(xì)胞脂質(zhì)代謝中的作用知之甚少，也不清楚RARRES2與脂質(zhì)代謝以及BCBrM之間的關(guān)系。該研究發(fā)表在《Military Medical Research》，IF：21.1。
技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1. BCBrM中RARRES2表達(dá)降低
       為了研究BrM潛在的脂質(zhì)代謝重編程特征，作者對三陰性乳腺癌原發(fā)腫瘤和BrM樣本進(jìn)行了scRNA-seq分析。本研究中使用的兩個BrM數(shù)據(jù)集來自作者自己的scRNA-seq數(shù)據(jù)（BrM1）和GSE186344（BrM2）。通過評估特定標(biāo)記基因的表達(dá)水平，共識別出9個不同的細(xì)胞簇。通過對原發(fā)腫瘤（n=87045個腫瘤細(xì)胞，GSE176078）和BrM（n=29173個腫瘤細(xì)胞）的腫瘤細(xì)胞簇進(jìn)行比較分析，作者發(fā)現(xiàn)BrM腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出上調(diào)的脂質(zhì)合成和脂肪酸代謝標(biāo)簽，這與之前的文獻(xiàn)一致。為了確定一個可能在BCBrM的啟動和發(fā)展中起關(guān)鍵作用的潛在脂肪因子，作者利用Gene Expression Omnibus公共數(shù)據(jù)集進(jìn)行了數(shù)據(jù)挖掘分析。具體而言，在人TNBC MDA-MB-231父代細(xì)胞和MDA-MB-231 BrM（GSE12237）之間，以及在異種移植到小鼠脂肪墊、皮膚和腦（GSE19184）中的MDA-MB-231-BrM細(xì)胞之間，比較了編碼脂肪因子或脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶的823個基因的表達(dá)（GSE19184）（圖1a）。在兩個數(shù)據(jù)集中，與親代細(xì)胞或注射到脂肪墊的腫瘤細(xì)胞相比，BrM中顯著下調(diào)的基因被確定。值得注意的是，RARRES2是BCBrM中下調(diào)最顯著的基因（圖1a）。為了驗證作者的發(fā)現(xiàn)，作者使用一個由配對的原發(fā)性乳腺腫瘤和BrM組成的獨立患者隊列進(jìn)行了額外的分析。在這個隊列中檢測RARRES2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BrM中RARRES2的表達(dá)水平顯著低于匹配的乳腺原發(fā)腫瘤樣本（圖1b）。此外，作者采用免疫組織化學(xué)方法評估了人類腫瘤樣本中RARRES2蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，與原發(fā)性乳腺腫瘤相比，BrM樣本中的RARRES2表達(dá)顯著降低（圖1c）。此外，基于上述scRNA-seq數(shù)據(jù)，作者觀察到與原發(fā)性乳腺癌相比，BrM中RARRES2的表達(dá)水平較低（圖1d）。
       為了進(jìn)一步研究RARRES2在不同腫瘤部位的表達(dá)，作者分析了另一個獨立的患者隊列，包括不匹配的原發(fā)性乳腺腫瘤和腦轉(zhuǎn)移病灶。在該隊列中，與原發(fā)性乳腺腫瘤相比，RARRES2在BCBrM中的表達(dá)顯著降低，而且在原發(fā)性腦腫瘤（GSE100534）中也顯著降低（圖1e）。GSE14020分析顯示，RARRES2在腦轉(zhuǎn)移乳腺癌中的表達(dá)水平明顯低于骨轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移乳腺癌（圖1f）。此外，作者使用MetMap數(shù)據(jù)（GSE148283）檢測了RARRES2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與肝轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞相比，腦轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞中RARRES2的表達(dá)顯著下調(diào)（圖1g）。此外，在分析GSE62598數(shù)據(jù)集時，作者未觀察到與原發(fā)性乳腺腫瘤相比，RARRES2在肝、骨或肺轉(zhuǎn)移瘤中的表達(dá)降低（圖1h）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明RARRES2的表達(dá)在乳腺癌的BrM中特異性降低，凸顯了RARRES2下調(diào)和BrM之間的潛在關(guān)聯(lián)。

圖1 RARRES2在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移（BrM）中表達(dá)下調(diào)

2. RARRES2缺失促進(jìn)BrM形成
       為了探索RARRES2在三陰性乳腺癌BrM中的作用，作者的下一個目標(biāo)是研究RARRES2的表達(dá)是否影響腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞的侵襲或增殖。對基因型-組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行的初步分析顯示，正常腦組織中RARRES2表達(dá)水平相對較低。這使作者推測，在轉(zhuǎn)移到大腦的乳腺癌細(xì)胞中，RARRES2表達(dá)下降可能是對大腦微環(huán)境的適應(yīng)。為了模擬BrM中RARRES2的低表達(dá)，作者分別用兩種不同的短發(fā)夾RNA在MDA-MB-231和4T1細(xì)胞中穩(wěn)定敲低RARRES2（RARRES2-KD）（圖2a, d）。隨后，作者觀察到RARRES2-KD顯著促進(jìn)了兩種細(xì)胞的增殖和侵襲（圖2b, c, e, f）。相反，過表達(dá)RARRES2（RARRES2-OE）（圖2g, j）顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖和侵襲（圖2h, i）。
       為了在體內(nèi)追蹤腫瘤細(xì)胞的行為，作者使用了熒光素酶標(biāo)記的RARRES2-OE 4T1細(xì)胞的BLI。值得注意的是，當(dāng)將RARRES2-OE注入小鼠顱內(nèi)時，顯示出對4T1細(xì)胞生長的顯著抑制（圖21），盡管在體外沒有統(tǒng)計學(xué)差異（圖2k）。此外，RARRES2-OE還抑制了心臟內(nèi)注射后4T1細(xì)胞的腦轉(zhuǎn)移（圖2m, n）。然而，值得注意的是，RARRES2-OE沒有表現(xiàn)出對肝轉(zhuǎn)移的顯著抑制（圖2n）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)強烈提示，RARRES2在BCBrM中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因為高水平的RARRES2會阻礙乳腺癌中BrM的進(jìn)程。

圖2 RARRES2-OE抑制乳腺癌腦轉(zhuǎn)移

3. RARRES2調(diào)控脂質(zhì)代謝重編程和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號通路
       為了更深入地了解RARRES2調(diào)控BCBrM的分子機制，作者在TCGA-BRCA轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中鑒定了RARRES2共表達(dá)基因。隨后，GO和KEGG富集分析表明，這些基因主要參與脂質(zhì)代謝通路，包括磷脂酰肌醇磷酸化、甘油三酯穩(wěn)態(tài)、脂氧合酶通路、PI3K-Akt信號通路和mTOR信號通路（圖3a, b）。這些發(fā)現(xiàn)揭示了這些通路在RARRES2介導(dǎo)的BCBrM調(diào)節(jié)中的潛在作用。
       作者進(jìn)一步擴展了研究，分別在乳腺癌和BrM癌上皮細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定了RARRES2共表達(dá)基因，并探索了受RARRES2調(diào)控的生物學(xué)過程。值得注意的是，與RARRES2呈正相關(guān)的基因主要與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)過程相關(guān)，包括生物黏附、細(xì)胞遷移和增殖（圖3c）。另一方面，與RARRES2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的基因主要參與物質(zhì)和酸的代謝（圖3d）。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步揭示了RARRES2在乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)生物學(xué)過程中的潛在調(diào)控作用。
       為了進(jìn)一步研究與RARRES2過表達(dá)相關(guān)的分子改變，作者在RARRES2過表達(dá)的細(xì)胞和對照MDA-MB-231細(xì)胞中進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。差異表達(dá)基因富集于轉(zhuǎn)移性生物學(xué)過程，如細(xì)胞黏附（圖3e, g）。此外，功能富集分析進(jìn)一步突出了脂質(zhì)代謝過程，包括磷脂外流。此外，基于京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫的基因集富集分析表明，RARRES2-OE組甘油磷脂代謝和泛酸鹽和輔酶A的生物合成上調(diào)，而視黃醇代謝和類固醇激素的生物合成下調(diào)（圖3f）。值得注意的是，對差異表達(dá)基因的通路分析也發(fā)現(xiàn)了PI3K信號通路（圖3g）。這些發(fā)現(xiàn)讓作者了解了與RARRES2過表達(dá)相關(guān)的分子變化，特別是轉(zhuǎn)移過程、脂質(zhì)代謝和PI3K信號通路的變化。

圖3 富集分析表明，RARRES2在乳腺癌中調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝重編程和PI3K信號通路

4. RARRES2改變MDA-MB-231細(xì)胞的脂質(zhì)代謝
       為了研究RARRES2在調(diào)節(jié)BCBrM中脂質(zhì)代謝中的作用，作者在RARRES2-KD及其對照MDA-MB-231細(xì)胞中進(jìn)行了非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析，并觀察到脂質(zhì)代謝物的顯著變化（圖4a, b）。具體而言，作者注意到磷脂酰膽堿和phosphatidyl ethanolamine 水平的增加，這兩種物質(zhì)是甘油磷脂家族的關(guān)鍵組成部分（圖4c）。相反，TAGs水平降低（圖4c）。對差異表達(dá)脂質(zhì)進(jìn)行的通路分析顯示，甘油磷脂代謝、鞘脂代謝和甘油脂代謝顯著富集（圖4d）。此外，對RARRES2-OE及其對照MDA-MB-231細(xì)胞的RNA測序顯示，RARRES2調(diào)節(jié)參與甘油磷脂代謝、脂肪酸合成和膽固醇合成的基因的表達(dá)，如FASN、SCD、HMGCR、CPT1A和PTDSS1的表達(dá)等（圖4e）。此外，RT-qPCR也證實了ACACA和HMGCR在RARRES2敲低后表達(dá)上調(diào)（圖4f）。這些發(fā)現(xiàn)強烈表明，RARRES2的表達(dá)降低與MDA-MB-231細(xì)胞系的脂質(zhì)代謝失調(diào)密切相關(guān)，提示RARRES2在BCBrM中調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的潛在作用。
       為了研究干擾RARRES2介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝重編程是否影響乳腺癌細(xì)胞的惡性表型，作者使用CPT1抑制劑etomoxir對RARRES2表達(dá)改變的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行了實驗。有趣的是，作者觀察到在RARRES2敲低的細(xì)胞中，與對照細(xì)胞相比，CPT1的抑制顯著逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞增殖（圖4g）。綜上所述，遺傳、代謝、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和功能學(xué)證據(jù)為RARRES2在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中的作用提供了支持。

圖4 RARRES2調(diào)節(jié)MDA-MB-231細(xì)胞的脂質(zhì)代謝

5. RARRES2負(fù)調(diào)控PTEN-mTOR-SREBP1信號通路
       脂質(zhì)代謝重編程受到多種代謝途徑的嚴(yán)格調(diào)控，參與代謝產(chǎn)物的合成和降解。值得注意的是，PI3K/mTOR軸及其下游的SREBP信號成為脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控樞紐。
       最近的證據(jù)強調(diào)了PIK3CA突變作為與BCBrM相關(guān)的主要突變的重要性，以及SREBP1在腦中促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖的重要作用。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)和作者的功能富集分析（圖3b, g），作者提出RARRES2可能通過mTOR-SREBP1信號通路調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝重編程。根據(jù)這一假設(shè)，在MDA-MB-231細(xì)胞中，p-Akt、mTOR、p-mTOR、SREBP1/cleaved SREBP1的蛋白水平與RARRES2-KD或RARRES2-OE呈負(fù)相關(guān)（圖5a），表明RARRES2對mTOR-SREBP1信號通路具有負(fù)性調(diào)控作用。在這一背景下，另一個關(guān)鍵的參與者是PTEN，這是一種在TNBC中經(jīng)常缺失的腫瘤抑制因子，并與PI3K通路激活相關(guān)。據(jù)報道，TNBC中PTEN缺失/突變的比例高達(dá)35-40%。此外，在BCBrM的基因組圖譜中，PTEN位于基因組改變最多的5個基因內(nèi)。既往研究報道RARRES2通過PTEN調(diào)節(jié)PI3K-mTOR軸，作者觀察到PTEN的蛋白水平與RARRES2直接相關(guān)（圖5a）。
       為了研究是否可以通過抑制mTOR通路來逆轉(zhuǎn)RARRES2缺陷的促癌作用，作者使用mTOR抑制劑雷帕霉素處理RARRES2-KD及其對照MDA-MB-231細(xì)胞。結(jié)果表明，雷帕霉素處理顯著逆轉(zhuǎn)了RARRES2-KD細(xì)胞的增殖和侵襲增加（圖5b, c）。此外，蛋白質(zhì)印跡分析顯示，雷帕霉素處理逆轉(zhuǎn)了RARRES2敲低引起的P-mtor和SREBP1表達(dá)水平的升高（圖5d）。
       CMKLR1是RARRES2發(fā)揮其生物學(xué)功能的主要受體。因此，作者進(jìn)一步研究了CMKLR1在RARRES2介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝重編程及其下游信號通路中的作用。敲低CMKLR1消除了在RARRES2-OE細(xì)胞中觀察到的PTEN表達(dá)的顯著增加和p-Akt表達(dá)的降低（圖5e）。此外，在RARRES2過表達(dá)和對照細(xì)胞中，CMKLR1敲低導(dǎo)致FASN在mRNA水平的表達(dá)上調(diào)（圖5f）。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，RARRES2調(diào)節(jié)PTEN-mTOR-SREBP1軸，而PTEN-mTOR-SREBP1軸反過來調(diào)節(jié)TNBC中的脂質(zhì)代謝和BCBrM。

圖5 RARRES2負(fù)調(diào)控PTEN-mTOR-SREBP1軸

結(jié)論
       該研究聚焦于BrM，即乳腺癌的臨床困境，并確定了RARRES2和BCBrM之間的特異性關(guān)聯(lián)。該研究表明，由RARRES2介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝重編程對三陰性乳腺癌的腦轉(zhuǎn)移形成至關(guān)重要。該研究結(jié)果不僅為目前對脂質(zhì)代謝和乳腺癌BrM的理解提供了新的見解，而且提示了RARRES2作為這種危及生命的疾病的潛在治療靶點的干預(yù)措施。

實驗方法
IHC染色，RNA測序，RT-qPCR，蛋白質(zhì)印跡，細(xì)胞增殖測定，體外侵襲試驗
參考文獻(xiàn)：
Li YQ, Sun FZ, Li CX, Mo HN, Zhou YT, Lv D, et al. RARRES2 regulates lipid metabolic reprogramming to mediate the development of brain metastasis in triple negative breast cancer. Mil Med Res. 2023 Jul 25;10(1):34. doi: 10.1186/s40779-023-00470-y.