SOC預(yù)后不良新預(yù)測因子出現(xiàn)！這一條去泛素化途徑你學(xué)會了嗎？

       漿液性卵巢癌（serous ovarian cancer, SOC）的預(yù)后不良是由于SOC細(xì)胞的高侵襲能力和順鉑抗性，而分子機(jī)制仍然知之甚少。Snail是EMT的經(jīng)典生物標(biāo)志物，它在癌細(xì)胞癌變，進(jìn)展，轉(zhuǎn)移和化學(xué)耐藥性中起著重要作用。本研究分別通過免疫組織化學(xué)、體外和體內(nèi)研究鑒定編碼非肌西北肌球蛋白重鏈IIB的基因MYH10在SOC中的表達(dá)和功能。MYH10的機(jī)制通過共免疫沉淀、GST pull-down、共聚焦激光測定等得到證實(shí)。結(jié)果表明，敲低MYH10在體內(nèi)外均抑制SOC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和順鉑耐藥性。進(jìn)一步的研究證實(shí)，MYH10蛋白功能結(jié)構(gòu)域與編碼非肌西北肌球蛋白重鏈IIA的基因MYH9結(jié)合，募集去泛素特異性蛋白酶45，通過去泛素化snail以抑制其蛋白質(zhì)降解，最終促進(jìn)SOC中的腫瘤發(fā)生，進(jìn)展和順鉑耐藥性。在臨床樣品中，與副腫瘤樣品相比，SOC樣品中的MYH10表達(dá)顯著升高。MYH10的表達(dá)與MYH9的表達(dá)呈正相關(guān)。MYH10+/MYH9+共表達(dá)是預(yù)測SOC患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。這些發(fā)現(xiàn)揭示了MYH10-MYH9-Snail軸在SOC致癌、進(jìn)展和順鉑耐藥性中的關(guān)鍵作用，并為SOC干預(yù)提供潛在的新治療靶點(diǎn)。本文于2023年5月發(fā)表在《Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany)》IF:15.1期刊上。
技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、MYH10在SOC樣品中表達(dá)上調(diào)并預(yù)測預(yù)后不良
       為探究MYH10在SOC樣品中的臨床意義，本研究進(jìn)行IHC以檢測MYH10蛋白表達(dá)（圖1B，C），結(jié)果顯示與腫瘤旁樣品相比，SOC樣品中MYH10的蛋白表達(dá)上調(diào)（圖1A）。重要的是，Kaplan-Meier分析表明，高M(jìn)YH10表達(dá)與SOC樣品中較短的總生存期（OS）和無復(fù)發(fā)生存期（RFS）相關(guān)（圖1D）。此外，MYH10表達(dá)與FIGO分期，腹膜內(nèi)轉(zhuǎn)移和腸道轉(zhuǎn)移等因素都相關(guān)（表1）。這些結(jié)果表明MYH10在SOC中表達(dá)上調(diào)，并可預(yù)測不良預(yù)后。

圖1 上調(diào)MYH10可預(yù)測SOC患者預(yù)后不良

表1 使用χ2或Fisher’s精確檢驗(yàn)與標(biāo)準(zhǔn)臨床病理變量相關(guān)的MYH10，MYH9或MYH10/MYH9表達(dá)

2、敲低MYH10在體內(nèi)外抑制SOC中的腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和順鉑耐藥性
       為驗(yàn)證MYH10的致癌功能，本研究使用不同的siRNA有效地敲低SOC細(xì)胞中MYH10的表達(dá)。使用3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物（MTT），Edu和集落形成測定（圖2A-C）發(fā)現(xiàn)敲低MYH10抑制SOC細(xì)胞生長和增殖。此外，Transwell，Boyden和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明敲低MYH10能抑制SOC細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖2D，E），體外藥物敏感性試驗(yàn)顯示MYH10敲低細(xì)胞的IC50值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于對照（圖2G），并且這種效應(yīng)在shMYH10裸鼠異種移植物模型體內(nèi)進(jìn)一步證實(shí)（圖2F）。Kaplan-Meier方法估計(jì)的生存時(shí)間證實(shí)，與未處理的正常對照（NC+NS）相比，單獨(dú)的順鉑治療（NC+順鉑）或shMYH10（shMYH10+生理鹽水[NS]）有效延長生存期。然而，shMYH10+順鉑組顯著延長生存時(shí)間，超過其他三組（圖2F）。NC+NS組的中位生存期為20天，shMYH10+NS組為31.5天，順鉑+NS組為38.5天，shMYH10+順鉑組為47.5天。此外，為了探究MYH10是否影響腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移，在裸鼠中進(jìn)行皮下和尾靜脈注射的移植腫瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示敲低MYH10抑制體內(nèi)腫瘤的增殖（圖2H）和轉(zhuǎn)移（圖2I），注射shMYH10細(xì)胞的小鼠與對照相比表現(xiàn)出較低的腫瘤大小和重量。此外，蛋白印跡分析顯示EMT信號包括N-鈣粘蛋白，波形蛋白，snail和slug被顯著抑制，而E-鈣粘蛋白顯著上調(diào)（圖2J）。這些結(jié)果表明，MYH10基因的敲低通過EMT信號在體內(nèi)外抑制SOC的增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和順鉑耐藥。這些數(shù)據(jù)表明MYH10作為一種癌蛋白，在體內(nèi)外促進(jìn)SOC癌變、進(jìn)展和順鉑耐藥。

圖2 MYH10基因敲低通過失活EMT信號抑制SOC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和順鉑耐藥

3、MYH10去泛素化snail
       為進(jìn)一步確定MYH10在SOC細(xì)胞中的作用機(jī)制，該研究使用Biogrid生物信息學(xué)網(wǎng)站來預(yù)測候選互作蛋白，發(fā)現(xiàn)snail是MYH10的候選互作蛋白。此外，作者使用RT-qPCR和WB來檢測MYH10敲低后snail的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)snail的mRNA表達(dá)沒有改變（圖3A），而蛋白質(zhì)表達(dá)在MYH10敲低后下調(diào)（圖2L）。此外還使用內(nèi)源性Co-IP測定觀察到MYH10與snail相互作用（圖3B），接下來驗(yàn)證MYH10是否通過抑制其在SOC細(xì)胞中的泛素化來減少snail降解。用特異性抗snail抗體免疫沉淀snail，并用抗泛素抗體分析其泛素化狀態(tài)。正如預(yù)期的那樣，過表達(dá)MYH10顯著降低snail的泛素化水平（圖3C）。此外，共聚焦激光測定證實(shí)MYH10和snail共定位于SOC細(xì)胞質(zhì)中（圖3D），并且MYH10敲低可以在不同時(shí)間點(diǎn)損害用cicloheximide和MG132處理的SOC細(xì)胞中snail的穩(wěn)定性（圖3E，F(xiàn)）。

圖3 MYH10去泛素化snail蛋白

4、MYH10與MYH9在SOC細(xì)胞中結(jié)合
       為進(jìn)一步驗(yàn)證MYH10在SOC細(xì)胞中的詳細(xì)機(jī)制，作者再次使用Biogrid預(yù)測候選互作蛋白，發(fā)現(xiàn)MYH9是MYH10的候選互作蛋白。在以前的研究中已得到，MYH9在OC組織中上調(diào)，并通過調(diào)節(jié)Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑和EMT信號促進(jìn)SOC增殖，遷移，侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，作者使用外源性和內(nèi)源性Co-IP測定得到MYH10功能結(jié)構(gòu)域（≈879-1959aa）與MYH9相互作用（圖4C-F），并且共聚焦激光測定證實(shí)MYH10和MYH9共定位在SOC細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中（圖4G）。此外，GST pull-down分析表明，在SOC細(xì)胞系中，MYH10可以直接結(jié)合MYH9（圖4D）。此外，為了確定MYH10和MYH9表達(dá)之間的關(guān)系，該研究在總共132對SOC樣品中進(jìn)行了IHC（圖4A）。Kaplan-Meier分析清楚地顯示MYH10+/MYH9+患者的OS或RFS比其他表達(dá)更短（圖4B）。MYH10+/MYH9+表達(dá)與FIGO分期，腹膜內(nèi)轉(zhuǎn)移，腸道轉(zhuǎn)移，腹水腫瘤細(xì)胞和血清HE4水平直接相關(guān)。此外，MYH10+/MYH9+共表達(dá)確實(shí)是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素，而不是使用多變量分析單獨(dú)使用MYH10或MYH9（表2）。值得注意的是，在SOC樣品中檢測到MYH10和MYH9蛋白水平之間正相關(guān)（表3）。

圖4 MYH10在SOC細(xì)胞中與MYH9結(jié)合

表2 SOC預(yù)后因素的單變量和多變量Cox回歸分析

表3 MYH10與MYH9表達(dá)的相關(guān)性研究

5、MYH9招募USP45去泛素化snail
       在作者之前的研究中已知，MYH9通過調(diào)節(jié)Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑和EMT信號促進(jìn)OC的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。為探究MYH9對snail的影響，作者使用RT-qPCR和WB來檢測MYH9敲低后snail的表達(dá)，結(jié)果顯示snail的mRNA表達(dá)沒有改變（圖5A），而在snail的蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)（圖5B）。為進(jìn)一步驗(yàn)證MYH9在SOC細(xì)胞中的作用機(jī)制，作者應(yīng)用Biogrid生物信息學(xué)網(wǎng)站來預(yù)測候選互作蛋白，發(fā)現(xiàn)USP45和snail是MYH9的候選互作蛋白。此外，內(nèi)源性Co-IP分析發(fā)現(xiàn)MYH9可以分別與USP45，snail和泛素互作（圖5C），并且Co-IP測定表明USP45敲低能改善MYH9對snail去泛素化和穩(wěn)定性的影響（圖5D）。此外，共聚焦激光測定證實(shí)MYH9和USP45以及MYH9和snail都共定位于SOC細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中（圖5G，H），MYH9敲低或過表達(dá)可能損害用cicloheximide和MG132處理的SOC細(xì)胞中snail在不同時(shí)間點(diǎn)的穩(wěn)定性（圖5E，F(xiàn)）。此外，該研究發(fā)現(xiàn)USP45敲低也可以損害cicloheximide和MG132處理的SOC細(xì)胞中snail在不同時(shí)間點(diǎn)的穩(wěn)定性（圖5I，J）。

圖5 MYH9招募USP45去泛素化snail

6、MYH10對SOC癌變、進(jìn)展和順鉑耐藥的促進(jìn)作用可通過敲低MYH9逆轉(zhuǎn)
       為確定MYH9敲低是否逆轉(zhuǎn)MYH10對SOC癌發(fā)生，進(jìn)展和順鉑耐藥性的促進(jìn)，進(jìn)行MTT和EdU測定以驗(yàn)證siMYH9對MYH10過表達(dá)的SOC細(xì)胞增殖的作用（圖6A，C）。另外，進(jìn)行Transwell和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)探究siMYH9對MYH10過表達(dá)的SOC細(xì)胞遷移和侵襲的逆轉(zhuǎn)作用（圖6D，E）。此外，檢測IC50值以驗(yàn)證siMYH9對MYH10過表達(dá)的SOC細(xì)胞的作用（圖6B），并進(jìn)行WB以探究潛在的機(jī)制。WB顯示MYH9敲低能逆轉(zhuǎn)MYH10對EMT信號的促進(jìn)（圖6F）。這些數(shù)據(jù)表明MYH10對SOC癌發(fā)生、進(jìn)展和順鉑耐藥性的促進(jìn)作用可以通過敲低MYH9來逆轉(zhuǎn)。

圖6 敲低MYH9可逆轉(zhuǎn)MYH10誘導(dǎo)的SOC癌變、進(jìn)展和順鉑耐藥

7、MYH9對SOC致癌、進(jìn)展和順鉑耐藥的促進(jìn)作用可通過敲低snail逆轉(zhuǎn)
       為確定snail敲低是否逆轉(zhuǎn)MYH9對SOC癌發(fā)生，進(jìn)展和順鉑耐藥性的促進(jìn)，進(jìn)行MTT和EdU測定以驗(yàn)證si-snail對MYH9過表達(dá)的SOC細(xì)胞增殖的作用（圖7A，C）。另外，進(jìn)行Transwell和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)探究si-snail對MYH9過表達(dá)的SOC細(xì)胞遷移和侵襲的逆轉(zhuǎn)作用（圖7D，E）。此外，檢測IC50值以驗(yàn)證si-snail對MYH9過表達(dá)的SOC細(xì)胞的作用（圖7B），并進(jìn)行WB以探究其潛在的機(jī)制，WB顯示snail敲低能逆轉(zhuǎn)MYH9對EMT信號的促進(jìn)（圖7F）。這些數(shù)據(jù)表明，MYH9對SOC癌發(fā)生、進(jìn)展和順鉑耐藥性的促進(jìn)作用可以通過敲低snail來逆轉(zhuǎn)。

圖7 敲低snail可逆轉(zhuǎn)MYH9誘導(dǎo)的SOC癌變、進(jìn)展和順鉑耐藥

圖8 本研究模型圖

       綜上所述，本研究表明，MYH10在SOC樣本中上調(diào)，并預(yù)測SOC患者的預(yù)后不良。MYH10作為SOC中的癌基因，促進(jìn)順鉑耐藥。MYH9是MYH10互作蛋白，通過招募USP45去泛素化snail導(dǎo)致EMT信號通路激活，從而促進(jìn)SOC癌變、進(jìn)展和順鉑耐藥（圖8）。該研究為理解與SOC發(fā)生、進(jìn)展和順鉑耐藥相關(guān)的分子機(jī)制提供新的見解，并為SOC治療提供潛在的生物標(biāo)志物。

實(shí)驗(yàn)方法
轉(zhuǎn)染，qRT-PCR，MTT Assay，EdU分析，Transwell實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，裸鼠體內(nèi)外順鉑治療實(shí)驗(yàn)，WB，Co-IP，GST pull-down，菌落形成實(shí)驗(yàn)，共聚焦激光分析，動物增殖與轉(zhuǎn)移研究，免疫組織化學(xué)（IHC）染色
參考文獻(xiàn)
Liu L, Chen C, Liu P, et al. MYH10 Combines with MYH9 to Recruit USP45 by Deubiquitinating Snail and Promotes Serous Ovarian Cancer Carcinogenesis, Progression, and Cisplatin Resistance. Adv Sci (Weinh). 2023; 10 (14): e2203423. doi:10.1002/advs.202203423