抑制“行走的殺手”骨關節(jié)炎的“利器”之抑制PIM-1激酶

       骨關節(jié)炎（OA）是一種炎癥性關節(jié)炎，巨噬細胞驅(qū)動的滑膜炎被認為與軟骨破壞密切相關，可發(fā)生在任何階段。然而，目前還沒有有效的治療骨性關節(jié)炎進展的靶點?；ぞ奘杉毎械腘OD-、LRR-和pyrin結構域蛋白3（NLRP3）炎癥小體參與病理性炎癥過程，所以針對它的治療策略被認為是治療OA的有效途徑。PIM-1激酶作為多種細胞因子信號通路的下游效應者，在炎癥性疾病中發(fā)揮促炎作用。
       在這項研究中，研究者評估了PIM-1的表達和滑膜巨噬細胞在人骨性關節(jié)炎滑膜中的滲透。以小鼠和人巨噬細胞為模型，研究了PIM-1對脂多糖（LPS）和尼日利亞菌素、三磷酸腺苷、尿酸鈉（MSU）、鋁鹽等激動劑的作用及其機制。采用改良的巨噬細胞條件培養(yǎng)液（CM）共培養(yǎng)體系評價其對軟骨細胞的保護作用。體內(nèi)療效通過內(nèi)側半月板（DMM）誘導的小鼠骨性關節(jié)炎得到證實。
       PIM-1在人骨性關節(jié)炎滑膜中的表達增加，并伴有滑膜巨噬細胞的浸潤。在體外實驗中，特異性抑制劑SMI-4a對PIM-1的抑制作用迅速抑制了小鼠和人巨噬細胞中NLRP3炎癥小體的激活以及gasdermin-D（GSDME）介導的細胞焦亡。此外，PIM-1的抑制在組裝階段特異性阻斷了含有CARD（ASC）寡聚化的凋亡相關斑點樣蛋白。機制上，PIM-1的抑制可減輕線粒體活性氧（ROS）/氯離子胞內(nèi)通道蛋白（CLICs）依賴的Cl -外泄信號通路，最終導致ASC寡聚化和NLRP3炎性體活化受阻。此外，PIM-1的抑制在改良的共培養(yǎng)系統(tǒng)中顯示出軟骨保護作用。最后，SMI-4a顯著抑制滑膜中PIM-1的表達，并降低DMM誘導的OA模型中的滑膜炎評分和國際骨關節(jié)炎研究協(xié)會（OARSI）評分。本文于2023年7月發(fā)表在《Journal of Translational Medicine》期刊上，IF=7.4。
技術路線

主要實驗結果
1、人骨關節(jié)炎滑膜巨噬細胞PIM-1表達上調(diào)
       探討PIM-1在巨噬細胞和骨性關節(jié)炎進展中的作用。研究者研究了巨噬細胞標志物（F4/80）在人滑膜中的表達。與之前的研究一樣，與正?；は啾?，骨性關節(jié)炎患者滑膜中F4/80陽性細胞的數(shù)量增加（圖1a，b）。此外，在骨性關節(jié)炎患者的滑膜中，PIM-1陽性細胞的百分比也升高（圖1a，c）。有趣的是，PIM-1主要定位于巨噬細胞，PIM-1和F4/80共存。綜上所述，這些結果表明巨噬細胞在OA滑膜中聚集，并增加PIM-1的表達。

圖1 巨噬細胞和PIM-1在OA滑膜中表達上調(diào)

2、PIM?1的抑制抑制了NLRP3炎性體的激活
       為了確定Smi-4a是否特異性地抑制巨噬細胞中的PIM-1，研究者用Smi-4a對脂多糖誘導的BMDM（骨髓源性巨噬細胞）進行了2 h的蛋白質(zhì)印跡分析。結果表明，SMI-4在LPS刺激（3.3 μm, 10 μm, 30 μm）后可下調(diào)jak2、stat的磷酸化水平，并呈劑量依賴性（圖2a）。這意味著PIM-1活性被SMI-4a抑制。此外，研究者在尼日利亞菌素或ATP刺激用Smi-4a培養(yǎng)脂多糖誘導的BMDM。結果表明，SMI-4a以劑量依賴性（3.3 μm, 10 μm, 30 μm抑制pro-IL-1β（P31）和pro-caspase-1（P45）裂解為IL-1β（P17）和caspase-1（P20）（圖2b、c），但不影響TNF-a的分泌。生長因子IL-3可通過JAK/ STAT信號通路上調(diào)PIM-1的活性。值得注意的是，研究者的研究結果表明，添加IL-3（25和50ng/ml）可以恢復SMI-4a（10 μm）誘導的jak2、stat的低磷酸化水平（圖2d）。這意味著補充IL-3（25和50ng/ml）可以恢復PIM-1的活性。此外，PIM-1的激活能夠“挽救”SMI-4a（30 μm）誘導的IL-1β分泌下調(diào)（圖2e和f），而不改變TNF-a分泌。這些發(fā)現(xiàn)表明，PIM-1可以參與NLRP3炎性小體激活的組裝階段，而不影響啟動階段。
       為了觀察PIM-1對巨噬細胞中NLRP3炎癥小體的啟動階段和組裝階段的作用，在LPS刺激前和刺激后應用SMI-4a。結果表明，在LPS刺激前預處理SMI-4a抑制了TNF-α的產(chǎn)生、pro-IL-1β和NLRP3蛋白的表達，而在LPS刺激后用SMI-4a處理時，這些沒有明顯變化（圖2g–i）。這些發(fā)現(xiàn)表明，PIM-1的抑制可抑制NF-κB信號通路，并可在啟動期和裝配期抑制NLRP3炎癥小體的激活。研究者繼續(xù)探索當巨噬細胞在LPS刺激后用SMI-4a處理時，PIM-1在裝配階段的作用。有趣的是，被SMI-4a抑制的PIM-1顯示出對NLRP3炎癥小體激活的快速抑制作用（圖2j–l）。為了進一步消除SMI-4a脫靶的可能性，這項研究還發(fā)現(xiàn)，另一種PIM-1抑制劑AZD1208可以快速抑制NLRP3炎癥小體激活的組裝階段，而不影響啟動階段。

圖2 . PIM-1的阻斷抑制了巨噬細胞NLRP3炎性體活化

3、阻斷PIM?1可廣泛抑制NLRP3、AIM2、NLRC4炎性體和焦亡，并特異性減輕ASC低聚物的形成
       為了進一步研究PIM-1是否在NLRP3炎性小體激活中起共同作用，研究者在不同的巨噬細胞中使用不同的激動劑研究了PIM-1對NLRP3炎性小體激活的作用。研究者發(fā)現(xiàn)SMI-4a劑量依賴性地抑制小鼠和人巨噬細胞NLRP3炎性體的激活，如雄性C57BL/6小鼠的PMs（圖3a, b），THP-1細胞（圖3c, d），健康人的外周血單核細胞（PBMC）。除尼日利亞菌素外，SMI-4a還能抑制MSU和Alum誘導的caspase-1裂解和IL-1β分泌（圖3e, f）。
       為了探究PIM-1是否在NLRP3炎性小體激活中起特定作用，研究者研究了PIM-1在NLRC4和AIM2炎性小體激活中的作用。結果顯示SMI-4a對AIM2炎性小體和NLRC4炎性小體具有抑制作用，可由poly（dA:dT）轉(zhuǎn)染或沙門氏菌感染觸發(fā)（圖3g, h），導致IL-1β產(chǎn)生減少。
       LDH釋放和GSDMD裂解是炎性小體誘導的焦亡的兩個關鍵特征。然后，研究者發(fā)現(xiàn)SMI-4a對PIM-1的抑制可以抑制LDH的釋放，阻斷GSDMD的裂解（圖3i, j）。接下來，研究者研究了PIM-1如何影響NLRP3炎性體形成的組裝階段。NLRP3和ASC之間的相互作用對于NLRP3炎性體的組裝至關重要。共免疫沉淀（CO-IP）結果表明SMI-4a不影響NLRP3和ASC的相互作用。在NLRP3和ASC裝配后，隨后的ASC募集形成ASC寡聚體和ASC斑點。結果首先表明，PIM-1抑制可以特異性減弱尼日利亞菌素誘導的DSS交聯(lián)的ASC寡聚體和ASC-斑點（圖3k - m）。

圖3  PIM-1的抑制廣泛抑制了NLRP3、AIM2、NLRC4炎性體和焦亡，并特異性減輕了ASC低聚物形成

4、PIM-1的抑制阻斷了Cl-外排以抑制ASC寡聚化
       Cl^-外排在ASC寡聚化中起著至關重要的作用，并且是NLRP3炎癥小體激活的重要上游事件。為了了解PIM-1對Cl^-流出的影響，研究者進行了離子置換實驗來驅(qū)動K⁺或Cl^-的流出。與以前的研究一致，單獨的無氯條件不會引起IL-1β的釋放，但它可以進一步增強無鉀條件引起的IL-1β的釋放。此外，在用SMI-4a處理的這些上清液中沒有觀察到IL-1β（圖4a）。此外，在無K⁺和Cl^-的條件下，SMI-4a可以劑量依賴性地抑制IL-1β的釋放（圖4b，c）。與先前的研究一致，研究者發(fā)現(xiàn)無K⁺和無Cl^-的條件可以激活ASC寡聚化。SMI-4a可以減輕由尼日利亞菌素或無K⁺和Cl^-條件引起的ASC寡聚化（圖4d）。以上結果提示，PIM1抑制NLRP3炎性小體激活可能與Cl^?外流有關。
       如圖4e，f所示，nigericin或無K⁺和Cl^-條件顯著增加了細胞內(nèi)熒光強度，表明細胞內(nèi)Cl^-水平降低，Cl^-流出增強。但是，這些進程被SMI-4a阻止了。氯離子細胞內(nèi)通道蛋白（CLICs）家族由CLIC1、CLIC4和CLIC5組成，存在于胞漿和質(zhì)膜中。CLICs可以移位到質(zhì)膜上，形成陰離子通道，介導細胞內(nèi)的Cl^-外流。研究者進一步探索SMI-4a誘導的Cl^-外排變化是否是通過阻斷CLICs轉(zhuǎn)運介導的。蛋白質(zhì)印跡分析表明，SMI-4a可以阻斷由尼日利亞菌素和無K⁺和Cl^-條件誘導的CLICs易位（圖4g，h）。綜上所述，研究者首次表明PIM-1在CLICs轉(zhuǎn)運和Cl^-外流中發(fā)揮關鍵作用，以實現(xiàn)ASC寡聚化和NLRP3炎癥小體激活。

圖4  PIM-1的抑制可阻斷Cl^?外排，從而抑制巨噬細胞中ASC的低聚化

5、PIM-1的抑制通過線粒體ROS阻斷Cl^-外排
       線粒體ROS在Cl^-流出的上游起作用，加速NLRP3炎癥體的激活，并在AIM2和NLRC4炎癥體的激活中起關鍵作用。為了研究PIM-1抑制是否通過調(diào)節(jié)線粒體ROS阻斷Cl-外排和NLRP3炎癥小體激活，研究者首先使用MitoSOX紅色探針檢測巨噬細胞中線粒體ROS的水平。結果顯示，伴隨線粒體ROS和SMI-4a而產(chǎn)生的NLRP3炎癥激活可以抑制線粒體的ROS水平（圖5a，b）。此外，在SMI-4a和尼日利亞菌素孵育之前，用魚藤酮（一種線粒體電子傳遞鏈復合物I抑制劑）處理LPS誘導的BMDMs時，線粒體ROS的產(chǎn)生顯著增加。這一發(fā)現(xiàn)表明魚藤酮阻斷了SMI-4a對線粒體ROS產(chǎn)生的抑制功能（圖5c，d）。此外，魚藤酮預處理后，Cl^-外排和NLRP3炎癥小體的激活增強（圖5e - h）。總之，這些結果首次表明PIM-1的抑制抑制了線粒體ROS的產(chǎn)生并阻斷了Cl^-外排，導致了對NLRP3炎癥小體的抑制作用。

圖5 PIM-1的抑制抑制了線粒體ROS的產(chǎn)生，從而阻斷了巨噬細胞中Cl^-的流出

6、在共培養(yǎng)體系中，PIM-1的抑制抑制了軟骨細胞凋亡并改善軟骨細胞增殖和ECM代謝
       研究者進一步利用共培養(yǎng)系統(tǒng)來研究巨噬細胞和軟骨細胞的相互作用。首先，研究者應該檢測SMI-4a對軟骨細胞的細胞毒性作用。結果顯示濃度< 50 μM的SMI-4a 處理軟骨細胞24或48小時沒有顯著的細胞毒性作用（圖6b）。隨后，研究者用參與NLPR3炎癥體激活的各種單一成分刺激巨噬細胞，并用CM培養(yǎng)軟骨細胞。有趣的是，與對照組相比，Nigericin組軟骨細胞的活性降低，而其他組無明顯變化。這意味著從用尼日利亞菌素處理的巨噬細胞收集的CM對軟骨細胞具有明顯的毒性作用（圖6c）。最終，研究者放棄了尼日利亞菌素，選擇了無K⁺和Cl^-的條件來激活NLRP3炎癥小體。因此，建立了改良的巨噬細胞-軟骨細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)（圖6a）。
       在該共培養(yǎng)系統(tǒng)中，與無LPS+KCl組相比，在SMI4a處理下軟骨細胞的存活力增加（圖6d）。從TUNEL染色中觀察到一致的結果（圖6g，h）。此外，與無LPS+KCl組相比，SMI-4a處理后，裂解的caspase 3和Bax的表達降低，Bcl-2的表達升高（圖6e）。這些結果表明，PIM-1的抑制可以減輕軟骨細胞凋亡。此外，與無LPS+KCl組相比，在SMI-4a處理下，膠原II和聚集蛋白聚糖的表達水平增加，MMP13和ADAMTS5的表達水平降低（圖6f）。這些結果表明，抑制PIM-1可以恢復軟骨細胞的細胞外基質(zhì)代謝。EDU染色顯示，與無LPS+ KCl組相比，用SMI-4a處理的軟骨細胞的增殖水平增加（圖6i和j）。基于該結果，如Toloniumchloride和S&F染色的染色強度和細胞面積分數(shù)的增加所示（圖6k – n），用SMI-4a處理的軟骨細胞的數(shù)量增加。這些結果首次證明PIM-1的抑制對軟骨細胞增殖有有益的影響。

圖6 在共培養(yǎng)體系中PIM-1的抑制防止了軟骨細胞損傷

7、PIM-1的抑制可以改善DMM模型小鼠骨關節(jié)炎的進展
       該研究進一步探索了PIM-1抑制對體內(nèi)OA的潛在治療作用。H&E染色顯示，smim4a治療DMM小鼠改善了滑膜的肥大和增生，并降低了滑膜襯里細胞層的厚度（圖7b）。結果表明SMI-4a可以降低滑膜炎評分，該評分在DMM組中升高（圖7c）。此外，與人類OA滑膜一致，與巨噬細胞共定位的PIM-1（F4/80）在DMM小鼠中顯著上調(diào)（圖7d–f）。然而，用SMI-4a處理對PIM-1的抑制表明滑膜中的這些陽性細胞顯著下調(diào)。此外，S&F染色顯示，與DMM組相比，SMI-4a的治療改善了粗糙和糜爛的關節(jié)表面軟骨、軟骨細胞減少和異常狹窄的關節(jié)間隙。結果表明SMI-4a可以降低在DMM組中升高的OARSI評分（圖7h）。這些蛋白質(zhì)的免疫組織化學在OA的發(fā)展中起著特征性的病理學指示作用，如膠原II、聚集蛋白聚糖、MMP13、ADAMTS5和cleaved-caspase3。與DMM組相比，用SMI-4a處理改善了II型膠原和聚集蛋白聚糖的下調(diào)，并抑制了MMP13、ADAMTS5和cleaved-caspase3的上升（圖7i）。出于SMI-4a的安全性考慮，測試了肝酶丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）的血清水平的肝毒性（圖7j），評估了血尿素氮（BUN）和肌酐（Cre）的腎毒性（圖7k），評估了體重的全身毒性（圖7l）。與對照組和DMM組相比，這些參數(shù)在SMI-4a處理后均無明顯變化。此外，從肝、脾和腎的H&E染色中沒有觀察到明顯的變化（圖7m）。研究者的體內(nèi)研究結果首次表明PIM-1抑制可以在OA小鼠中發(fā)揮保護作用。

圖7  PIM-1抑制改善了小鼠DMM模型中OA的進展

       總之，我們的研究強調(diào)PIM-1是治療OA的有效靶點。抑制PIM-1可抑制NLRP3炎癥體和GSDMED介導的細胞焦亡，其機制可能是通過阻斷組裝階段線粒體ROS/Cl?外流來實現(xiàn)。我們的研究表明，PIM-1特異性抑制劑能有效地治療小鼠骨性關節(jié)炎。因此，PIM-1代表了一類新的有希望的治療OA的靶點，靶向于巨噬細胞中的這些機制，并拓寬了治療OA策略的道路。

實驗方法
酶聯(lián)免疫吸附、乳酸脫氫酶釋放試驗、WB、細胞內(nèi)氯離子水平的評估、H&E染色、S&F染色
參考文獻
Zhang, Z. et al. Targeting macrophagic PIM-1 alleviates osteoarthritis by inhibiting NLRP3 inflammasome activation via suppressing mitochondrial ROS/Cl? efflux signaling pathway. Journal of Translational Medicine 2023 Jul, 21:452 doi:10.1186/s12967-023-04313-1