METTL1在前列腺癌中通過(guò)tRNA衍生片段生物發(fā)生促進(jìn)腫瘤發(fā)生

       前列腺癌(PCa)是世界范圍內(nèi)診斷頻率第二高的癌癥，也是男性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。RNA修飾普遍存在于轉(zhuǎn)移RNA (tRNAs)中。目前越來(lái)越多的證據(jù)表明，tRNA及其修飾酶的失調(diào)也參與了腫瘤的發(fā)生。作者的研究揭示了tRNA m7g甲基組在PCa中的復(fù)雜作用，并強(qiáng)調(diào)了靶向METTL1作為治療PCa的新治療策略的潛力。本文于2023年7月發(fā)布在《Molecular Cancer》，IF=37.3。
技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1、METTL1在人和小鼠PCa中升高
       為了研究RNA修飾在PCa腫瘤發(fā)生中的潛在作用，作者采用了一種確保選擇與PCa腫瘤發(fā)生相關(guān)的RNA修飾的方法。作者專(zhuān)注于在五項(xiàng)PCa研究的數(shù)據(jù)集中鑒定132組帶注釋的RNAmodifying proteins (RMPs)的表達(dá)變化(圖1A)。此外，作者使用基因工程PCa小鼠模型將作者的分析擴(kuò)展到小鼠PCa(圖1A)。作者發(fā)現(xiàn)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性PCa中表達(dá)差異最大的基因是METTL1(圖1B)。從原發(fā)性到轉(zhuǎn)移性腫瘤，METTL1的表達(dá)持續(xù)增加(圖1C)，在劍橋、斯德哥爾摩和泰勒隊(duì)列中，METTL1的高表達(dá)顯示出更差的預(yù)后(圖1C)。作者還發(fā)現(xiàn)WDR4的表達(dá)升高(圖1C)， WDR4是m7g RNA甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的調(diào)控亞基，在其他癌癥中也過(guò)表達(dá);然而，作者沒(méi)有發(fā)現(xiàn)WDR4過(guò)表達(dá)是不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素(圖1D)。來(lái)自當(dāng)?shù)仃?duì)列(Basurto醫(yī)院)的PCa樣本證實(shí)了METTL1和WDR4蛋白表達(dá)的增加(圖1E)?；谇傲邢侔┠[瘤的激素依賴(lài)性，作者進(jìn)行了METTL1、WDR4和AR的表達(dá)分析，但METTL1、WDR4與AR的表達(dá)沒(méi)有明顯的相關(guān)性(圖1E)。為了證實(shí)METTL1和WDR4的表達(dá)是否與晚期腫瘤狀態(tài)相關(guān)，作者通過(guò)S6K的磷酸化狀態(tài)來(lái)測(cè)量PI3K通路的活性，在大約70%的晚期PCa患者中，S6K的磷酸化狀態(tài)發(fā)生了改變。作者發(fā)現(xiàn)METTL1和WDR4表達(dá)與PI3K通路激活增強(qiáng)呈正相關(guān)(圖1E)，表明METTL1和WDR4表達(dá)在晚期PCa腫瘤中升高。綜上所述，作者的研究結(jié)果表明，METTL1是PCa中發(fā)生改變的主要表轉(zhuǎn)錄組調(diào)控因子，其過(guò)表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。

圖1. METTL1在前列腺癌中高表達(dá)

2、METTL1的表達(dá)受AKT - mTOR下游信號(hào)通路調(diào)控
       接下來(lái)，作者試圖闡明前列腺癌中METTL1表達(dá)上調(diào)的機(jī)制。由于雄激素受體(AR)活性增加是PCa的主要驅(qū)動(dòng)因素之一，作者分析了通過(guò)受體和下游靶基因(如KLK3)的表達(dá)來(lái)測(cè)量的AR表達(dá)或活性增加是否與PCa中METTL1的表達(dá)相關(guān)。在Grasso數(shù)據(jù)集中，作者觀察到METTL1與AR和KLK3之間幾乎顯著的直接相關(guān)。在Taylor數(shù)據(jù)集中，作者發(fā)現(xiàn)了METTL1和AR之間的直接相關(guān)性，支持了這兩個(gè)因素之間潛在關(guān)系的概念。作者使用TGCA數(shù)據(jù)集的分析揭示了METTL1和KLK3之間的直接相關(guān)性。然而，有趣的是，在這個(gè)特定的數(shù)據(jù)集中，作者沒(méi)有發(fā)現(xiàn)METTL1和AR之間的顯著相關(guān)性。由于作者發(fā)現(xiàn)與良性前列腺增生標(biāo)本相比，前列腺癌標(biāo)本中METTL1蛋白表達(dá)與磷酸化- s6k呈正相關(guān)(圖1E)，作者接下來(lái)分析了METTL1表達(dá)是否與PTEN表達(dá)相關(guān)，PTEN是PI3K/AKT/mTOR通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在大約70%的晚期前列腺癌患者中缺失。分析的所有數(shù)據(jù)集均顯示METTL1與PTEN表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(圖2A)，表明PI3K-mTOR軸調(diào)控了PCa中METTL1的表達(dá)。使用PI3K (BKM-120抑制劑)、AKT (MK2206)、mTORC1(rapamycin)和mTORC1/2 (Torin)的小分子抑制劑進(jìn)一步解剖PI3K - mTORC1/2通路發(fā)現(xiàn)，AKT抑制降低了METTL1 mRNA的水平，mTOR抑制劑持續(xù)降低了METTL1 mRNA和蛋白的表達(dá)(圖2B-C)，表明METTL1的表達(dá)是通過(guò)mTOR信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)的。接下來(lái)，作者研究了METTL1表達(dá)水平是否有助于確定PTEN缺失相關(guān)的患者生存率降低，這與臨床相關(guān)，并在臨床局部腫瘤患者中區(qū)分良性和侵襲性疾病。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)高M(jìn)ETTL1表達(dá)突出了PTEN -低患者預(yù)后不良的子集(圖2D)。為了確定前列腺癌中METTL1的上調(diào)是否是PTEN表達(dá)低或缺失的直接后果，作者分析了野生型(WT)小鼠和Probasine-Cre x PTENflox/flox小鼠(以下簡(jiǎn)稱(chēng)PTEN - ko)前列腺組織中METTL1 mRNA和蛋白水平，這些小鼠在前列腺上皮中有條件地缺失了PTEN。這些小鼠在12周后發(fā)展為高級(jí)別腫瘤前病變，在5個(gè)月大后發(fā)展為浸潤(rùn)性腺癌。作者觀察到PTEN缺失后METTL1的表達(dá)逐漸增加(圖2E-G)。有趣的是，來(lái)自小鼠前列腺腫瘤的tRNA在組織中提取的tRNA以及尿液中顯示m7g的沉積顯著增加(圖2H-K)。免疫組織化學(xué)分析進(jìn)一步顯示，METTL1在小鼠前列腺癌中的表達(dá)更高，在腔細(xì)胞中也有高表達(dá)，腔細(xì)胞是最常見(jiàn)的上皮細(xì)胞類(lèi)型，被普遍認(rèn)為是人類(lèi)前列腺癌的優(yōu)選起源細(xì)胞(圖2L)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明METTL1是mTORC1通路的下游效應(yīng)物，其激活可誘導(dǎo)METTL1在PCa中的表達(dá)增加。

圖2. PI3K-AKT-mTORC通路介導(dǎo)前列腺癌中METTL1表達(dá)上調(diào)

3、METTL1優(yōu)先甲基化tRNA
       為了了解METTL1在PCa腫瘤發(fā)生中的作用，作者通過(guò)結(jié)合兩種轉(zhuǎn)錄組的方法確定了METTL1 RNA底物。為了鑒定PCa細(xì)胞中METTL1特異性RNA靶點(diǎn)，作者使用了PAR-CLIP，將光反應(yīng)性核糖核苷類(lèi)似物納入新生RNA中，通過(guò)紫外線交聯(lián)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)和RNA之間的共價(jià)鍵，然后進(jìn)行下一代測(cè)序。以空載體感染多西環(huán)素誘導(dǎo)的細(xì)胞為對(duì)照。作者發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照樣本結(jié)合的RNA相比，tRNA代表了METTL1上最豐富的RNA物種，每個(gè)基因的reads密度最高，平均中位數(shù)密度為L(zhǎng)og2 12 rpm。(圖3)。與對(duì)照樣品相比，作者沒(méi)有觀察到HA-METTL1樣品上結(jié)合的其他RNA物種的富集(圖3A)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)果，作者下載了Bao等人生成的數(shù)據(jù)，分析了HEK293T細(xì)胞中METTL1結(jié)合的RNA。tRNA也是HEK293T細(xì)胞中與METTL1結(jié)合最豐富的RNA種類(lèi)，平均中位密度為log28 rpm。接下來(lái)，為了精確定位tRNA中的m7g，作者使用CRISPR/Cas9敲除PCa細(xì)胞系PC3中的METTL1(圖3B)。使用抗m7g抗體的North-dot blot分析和質(zhì)譜分析證實(shí)了METTL1 KO細(xì)胞tRNA中m7g的缺失(圖3B-C)。然后，作者進(jìn)行了AlkAnaline-seq，以單核苷酸分辨率繪制m7g的發(fā)生圖譜，并使用METTL1 KO tRNA作為對(duì)照。高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的分析證實(shí)了先前報(bào)道的鳥(niǎo)苷46可變環(huán)中強(qiáng)大的甲基化(圖3D, F)。作者鑒定出大約50%的同型受體為METTL1底物(圖3E, G)。綜上所述，作者的分析證實(shí)了METTL1優(yōu)先甲基化PCa細(xì)胞中可變環(huán)上的tRNA。

圖3. METTL1優(yōu)先甲基化trna

4、METTL1介導(dǎo)的甲基化保護(hù)tRNA不被切割成小的非編碼RNA
       在酵母和人類(lèi)中,當(dāng)m7g甲基化降低時(shí)，tRNA的穩(wěn)定性降低。為了確定METTL1缺失可能會(huì)擾亂PCa細(xì)胞中單個(gè)METTL1靶向tRNA的水平，作者對(duì)從PC3 WT和METTL1 KO細(xì)胞中分離的tRNA進(jìn)行了高通量測(cè)序。與之前的研究結(jié)果相反，作者沒(méi)有發(fā)現(xiàn)證據(jù)表明METTL1特異性甲基化的缺失會(huì)降低特異性成熟tRNA同受體的豐度(圖4A)。最近的報(bào)道表明，tRNA修飾保護(hù)或誘導(dǎo)tRNA切割成抑制性小ncRNA。作者分析了來(lái)自PC3 WT和METTL1 KO細(xì)胞的小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，以尋找tRNA片段的主要類(lèi)別的差異。有趣的是，作者在PC3 METTL1 KO細(xì)胞中檢測(cè)到一致的5’tRNA片段富集(圖4B);然而，與WT細(xì)胞相比，大多數(shù)METTL1 KO細(xì)胞的富集程度適度增加(圖4C)。作者的分析顯示，與WT細(xì)胞相比，在所有5'tRNA片段中，一個(gè)特定的類(lèi)別，即5 '末端低鳥(niǎo)嘌呤tRNA片段(5'TOGs)，在KO細(xì)胞中顯著過(guò)度代表(log2 FC>2, p值<0.05)(圖4B;圖4C)。5 ' togs長(zhǎng)約20或30個(gè)核苷酸，主要來(lái)源于METTL1靶tRNA Cys(產(chǎn)生含有5 ' togs的5個(gè)末端鳥(niǎo)嘌呤(5G))和Ala(產(chǎn)生含有5 ' togs的4G)的裂解(圖4DE)。Northern blotting證實(shí)，與WT細(xì)胞相比，PC3 METTL1 KO細(xì)胞的兩個(gè)獨(dú)立克隆中cys衍生的5 ' trf的積累較弱，但明顯較高(圖4F)。在PC3、DU145和22Rv1細(xì)胞中，METTL1下調(diào)時(shí)觀察到5'tRFs，表明5'tRFs的形成與PTEN、p53和AR狀態(tài)無(wú)關(guān)(圖4F)。一小部分tRNA切割成tRNA衍生的ncRNA是對(duì)應(yīng)激的保守反應(yīng)，tRNA修飾保護(hù)它們免受應(yīng)激誘導(dǎo)的切割。在應(yīng)激反應(yīng)中，tRNA切割在METTL1 KO細(xì)胞中比在WT細(xì)胞中更為突出，早在氧化應(yīng)激暴露2小時(shí)達(dá)到峰值，在應(yīng)激刺激8小時(shí)后下降，可能是因?yàn)闊o(wú)法解決應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加(圖4G, H)。總之，作者的數(shù)據(jù)表明，METTL1介導(dǎo)的甲基化是一種保守的機(jī)制，它調(diào)節(jié)了PCa細(xì)胞在應(yīng)激反應(yīng)中源自5’tRNA片段的一類(lèi)新型小ncRNA的生物發(fā)生，而不管它們的遺傳狀態(tài)如何。

圖4. tRNA中缺乏m7g甲基化導(dǎo)致5'tRNA片段積累

5、METTL1的缺失通過(guò)tRNA片段生物發(fā)生抑制翻譯起始
       由于已知5'TOGs抑制全局翻譯，作者接下來(lái)研究了5'TOGs的積累是否導(dǎo)致了PC3 METTL1缺失細(xì)胞的翻譯改變。作者證實(shí)，與WT細(xì)胞相比，METTL1 KO細(xì)胞中通過(guò)o -丙基嘌呤霉素(OP-puro)摻入測(cè)量的蛋白質(zhì)翻譯減少(圖5A)。細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中5’tRNA片段的產(chǎn)生在應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制中起關(guān)鍵作用。這個(gè)過(guò)程有助于抑制整體蛋白質(zhì)合成，使細(xì)胞能夠恢復(fù)并在壓力條件下生存。為了確定METTL1的去除是否會(huì)影響應(yīng)激反應(yīng)，作者測(cè)量了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)后的蛋白質(zhì)合成速率。m7g的缺失顯著抑制了蛋白合成，并且這一過(guò)程與eIF2α磷酸化狀態(tài)無(wú)關(guān)。接下來(lái)，作者試圖確定METTL1 KO細(xì)胞獨(dú)特的翻譯抑制及其對(duì)5'TOGs的依賴(lài)的分子基礎(chǔ)。先前的證據(jù)表明，5'TOGs通過(guò)取代mRNA帽上的翻譯起始復(fù)合物eIF4A/G/E和調(diào)控因子YB1和PABP1的組分，從而損害翻譯起始。為了確定翻譯起始因子是否從PC3 METTL1 KO細(xì)胞中7-甲基-鳥(niǎo)苷化(m7g)覆蓋的mRNA中轉(zhuǎn)移，作者分析了翻譯起始因子對(duì)m7g -帽狀結(jié)構(gòu)被的sepharose beads的親和力。作者發(fā)現(xiàn)，與WT細(xì)胞相比，METTL1 KO細(xì)胞中eIF4G和PABP1的m7 g -cap親和力顯著降低(圖5B)。這表明，5'TOGs積累的增加破壞了翻譯起始復(fù)合物某些因子的組裝和結(jié)合的穩(wěn)定性，導(dǎo)致METTL1 KO細(xì)胞中的翻譯受到抑制。作者進(jìn)一步評(píng)估了在WT細(xì)胞中表達(dá)的合成5'TOG是否能夠結(jié)合翻譯起始因子和調(diào)節(jié)因子，以及它們對(duì)這些因子的親和力是否可以通過(guò)合成的逆補(bǔ)體5'TOG RNA(或抗tog)來(lái)阻斷。為此，作者用5 '生物素化的5'TOG RNA(包含PC3 METTL1 KO細(xì)胞中最豐富的5'TOG序列)轉(zhuǎn)染PC3 WT細(xì)胞，并添加或不添加抗tog。在去除5 '生物素化-5 ' togs后，作者發(fā)現(xiàn)在抗togs存在下，PABP1和YB1對(duì)5'TOG的親和力顯著降低(圖5C)。接下來(lái)，作者研究了人工合成的5'TOGs是否可以在WT細(xì)胞中表型化翻譯起始復(fù)合物的位移，以及抗tog RNA是否可以在METTL1 KO細(xì)胞中挽救這種觀察到的效應(yīng)。作者發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染5'TOGS的WT細(xì)胞中，PAPB1與m7g -cap的結(jié)合被取代，但在轉(zhuǎn)染抗tog RNA的METTL1 KO細(xì)胞中，PAPB1與m7g -cap的親和力顯著增加(圖5D)?？偟膩?lái)說(shuō)，這表明5'TOGs的形成通過(guò)取代PAPB1來(lái)抑制蛋白質(zhì)翻譯。有趣的是，PAPB1先前已被證明對(duì)其他細(xì)胞類(lèi)型的5'TOGs具有很強(qiáng)的親和力。因此，作者的研究結(jié)果證實(shí)，METTL1 KO細(xì)胞中表達(dá)的5'TOGs可以取代mRNA帽上的翻譯調(diào)節(jié)因子，并為METTL1介導(dǎo)的翻譯抑制的分子基礎(chǔ)提供了關(guān)鍵見(jiàn)解。

圖5. METTL1下調(diào)抑制體內(nèi)蛋白合成、增殖和腫瘤生長(zhǎng)

6、METTL1下調(diào)可抑制前列腺腫瘤在體內(nèi)和體外的生長(zhǎng)
       鑒于METTL1 KO細(xì)胞合成的蛋白質(zhì)較少，作者假設(shè)METTL1抑制可以降低細(xì)胞和腫瘤的生長(zhǎng)。事實(shí)上，作者觀察到METTL1的敲低會(huì)損害PC3、DU145和22Rv1細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖5E)。METTL1下調(diào)還會(huì)減少細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，增加細(xì)胞凋亡，損害球體形成能力，并顯著降低腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)和增殖(圖5F-I)。因此，作者的數(shù)據(jù)表明，下調(diào)METTL1可以有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)，有力地支持METTL1在調(diào)節(jié)PCa進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。接下來(lái)，作者研究了METTL1甲基化酶活性是否足以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。作者在PC3 METTL1 KO細(xì)胞中重新表達(dá)了野生型METTL1 (WT)和催化死亡突變體(AFPA)(圖5J-L)。與用空載體(eV)轉(zhuǎn)導(dǎo)的KO細(xì)胞相比，重新表達(dá)WT METTL1的KO細(xì)胞的增殖和球體形成能力增強(qiáng)。相比之下，無(wú)催化活性突變體的表達(dá)未能促進(jìn)METTL1 KO細(xì)胞生長(zhǎng)和球體形成能力(圖5M-N)。由于METTL1的催化活性得到了與調(diào)控亞基WDR4形成復(fù)合物的支持，并且WDR4在PCa中過(guò)表達(dá)(圖1C, E)，因此作者測(cè)試了WDR4的致癌潛力。誘導(dǎo)沉默WDR4并不會(huì)降低細(xì)胞或腫瘤的生長(zhǎng)。綜上所述，這些結(jié)果表明METTL1以酶活性依賴(lài)的方式促進(jìn)PCa細(xì)胞的生長(zhǎng)，但不依賴(lài)于WDR4。為了進(jìn)一步確定5'TOG是否足以誘導(dǎo)生長(zhǎng)停滯和凋亡，作者用5'TOG轉(zhuǎn)染PC3 WT細(xì)胞，用抗tog轉(zhuǎn)染METTL1 KO細(xì)胞，并測(cè)量細(xì)胞凋亡和增殖。作者檢測(cè)到WT細(xì)胞轉(zhuǎn)染5'TOG RNA后，凋亡顯著增加，增殖顯著減少，而METTL1 KO細(xì)胞轉(zhuǎn)染抗togs后，凋亡顯著減少，但不顯著，增殖顯著增加(圖50,P)?？傊?，作者的數(shù)據(jù)表明，METTL1失活和5'TOGs是誘導(dǎo)生長(zhǎng)停滯的必要條件。METTL1催化活性版本和抗togs的重新表達(dá)可以部分修復(fù)METTL1 KO細(xì)胞中觀察到的缺陷。
7、METTL1丟失激活I(lǐng)FN信號(hào)通路
       鑒于翻譯受到METTL1抑制的影響，作者探討了METTL1缺失對(duì)翻譯體即刻變化的影響。為此，作者利用OP-puro特性來(lái)標(biāo)記新生蛋白，隨后將其偶聯(lián)到生物素包被的微球上，然后進(jìn)行微球上的消化和LC-MS /MS(圖6A)?；虮倔w(GO)術(shù)語(yǔ)富集分析發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞分裂和有絲分裂相關(guān)的基因翻譯減少，證實(shí)了觀察到的METTL1 KO細(xì)胞增殖缺陷(圖6B)。出乎意料的是，作者還發(fā)現(xiàn)METTL1 KO細(xì)胞中與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本翻譯增加，包括I型和II型干擾素(IFN)信號(hào)通路、免疫效應(yīng)過(guò)程和分解代謝過(guò)程(圖6B)。翻譯的差異反映在PC3 METTL1 KO細(xì)胞的整體蛋白質(zhì)組組成中，但與RNA表達(dá)水平無(wú)關(guān)，這表明轉(zhuǎn)錄后或翻譯調(diào)控是導(dǎo)致METTL1 KO細(xì)胞中不相關(guān)的RNA -蛋白表達(dá)水平的原因(圖6C)。為了進(jìn)一步測(cè)試METTL1 KO細(xì)胞中某些轉(zhuǎn)錄本的翻譯效率是否存在差異，作者進(jìn)行了多體分析。這種方法使作者能夠確認(rèn)METTL1 KO細(xì)胞中活性多體的形成減少，同時(shí)整體蛋白合成減少(圖6D)。對(duì)METTL1 KO細(xì)胞多體部分mRNA富集的分析顯示，與干擾素信號(hào)相關(guān)的特定轉(zhuǎn)錄物的翻譯增加，如干擾素調(diào)節(jié)因子9 (IRF9)和干擾素刺激基因15 (ISG15)(圖6D)。作為翻譯變化特異性的對(duì)照，作者沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在METTL1 KO細(xì)胞的多體部分中富集GAPDH、Catenin β、KIF20A或STAT1等轉(zhuǎn)錄本(圖6D)。綜上所述，作者的研究結(jié)果表明，METTL1介導(dǎo)的tRNA甲基化引導(dǎo)著一個(gè)獨(dú)特的翻譯程序。由于5'TOGs可以重新編程翻譯機(jī)制，以支持癌細(xì)胞所需的翻譯程序，作者接下來(lái)研究了METTL1 KO細(xì)胞的翻譯變化是否由5'TOGs的生物發(fā)生增加介導(dǎo)。為此，作者用5'TOG和抗tog RNA轉(zhuǎn)導(dǎo)PC3 WT和METTL1 KO細(xì)胞，并評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。作者發(fā)現(xiàn)，WT細(xì)胞中轉(zhuǎn)染5'TOGs增加了IRF9和ISG15蛋白的表達(dá)，而在METTL1 KO細(xì)胞中轉(zhuǎn)染抗tog RNA輕微但顯著地降低了這兩種蛋白的表達(dá)(圖6E)。作者還觀察到METTL1 KO細(xì)胞和異種移植物中STAT1的蛋白表達(dá)和磷酸化增加(圖6E)，但其表達(dá)的增加與翻譯的增加無(wú)關(guān)(圖6D)，而是轉(zhuǎn)錄依賴(lài)的，這表明STAT1表達(dá)的增加是由METTL1 KO細(xì)胞中IFN信號(hào)通路的激活誘導(dǎo)的?？紤]到STAT1激活的抗增殖和促凋亡作用，作者測(cè)試了下調(diào)STAT1是否可以逆轉(zhuǎn)METTL1 KO PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)缺陷。作者發(fā)現(xiàn)，在STAT1敲除后，PC3 METTL1 KO細(xì)胞的凋亡減少，增殖增加(圖6F, G)，這表明METTL1抑制的抗增殖作用可能部分是通過(guò)激活STAT1信號(hào)通路介導(dǎo)的。綜上所述，作者的數(shù)據(jù)表明，METTL1介導(dǎo)的tRNA甲基化和tRNA片段生物發(fā)生誘導(dǎo)了激活I(lǐng)FN信號(hào)通路的翻譯程序。為了證實(shí)METTL1的高表達(dá)與人類(lèi)PCa樣本中IFN通路活性的降低相關(guān)，作者在三個(gè)PCa表達(dá)數(shù)據(jù)集中評(píng)估了ISGs的表達(dá)。綜上所述，作者的數(shù)據(jù)表明，在PCa細(xì)胞和腫瘤中，METTL1的表達(dá)與IFN通路的激活呈負(fù)相關(guān)，METTL1的抑制可翻譯激活I(lǐng)FN信號(hào)通路。

圖6. m7G tRNA甲基化的缺失導(dǎo)致不同的翻譯程序

8、前列腺癌中METTL1的低表達(dá)與促炎免疫細(xì)胞極化增加相關(guān)
       最近，表觀遺傳靶向治療已被證明在幾種癌癥類(lèi)型中觸發(fā)IFN抗病毒反應(yīng)，包括PCa，引發(fā)先天免疫反應(yīng)并導(dǎo)致許多細(xì)胞因子的產(chǎn)生。為了闡明METTL1抑制是否可以通過(guò)激活I(lǐng)FN信號(hào)通路引發(fā)先天免疫反應(yīng)，作者研究了METTL1下調(diào)是否會(huì)改變PCa細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌?？傮w而言，在METTL1 KO細(xì)胞中，細(xì)胞因子組成分析顯示，參與促炎活性的細(xì)胞因子分泌增加，并使巨噬細(xì)胞極化為m1樣內(nèi)型，包括粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子α (TNF-α)(圖7A)。METTL1的去除也誘導(dǎo)了抗炎細(xì)胞因子的下調(diào)，包括巨噬細(xì)胞或集落刺激因子(M-CSF)、IL10和IL13(圖7A)，可使巨噬細(xì)胞極化為m2樣內(nèi)型。這些數(shù)據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞中METTL1的抑制可以使腫瘤微環(huán)境(TME)中的免疫細(xì)胞向細(xì)胞毒性殺瘤內(nèi)型分化。分子技術(shù)的出現(xiàn)，如單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，使審計(jì)腫瘤免疫微環(huán)境的組成成為可能。無(wú)監(jiān)督的scRNAseq聚類(lèi)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，在先天免疫群體中，巨噬細(xì)胞在PCa中所占比例最大。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tam)通常表現(xiàn)出m2樣或促腫瘤巨噬細(xì)胞的表達(dá)模式特征，是支持腫瘤發(fā)生的TME的主要組成部分。眾所周知，它們促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲性、血管生成和免疫耐受，同時(shí)也有助于對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療、免疫治療和化療的耐藥性。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)能夠消耗巨噬細(xì)胞或誘導(dǎo)其向m1樣或抗腫瘤狀態(tài)再極化的臨床藥物?？紤]到這些情況，以及觀察到表達(dá)METTL1的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子已知可驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞向m2樣內(nèi)型極化，作者重點(diǎn)闡明了METTL1在巨噬細(xì)胞極化中的作用。作者用PC3 WT或METTL1 KO細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(cm)培養(yǎng)人單核細(xì)胞系THP1，并研究了m1樣和m2樣巨噬細(xì)胞內(nèi)源性標(biāo)記物的表達(dá)(圖7B)。tSNE分析顯示，WT細(xì)胞中的c.m.誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向m1樣內(nèi)型轉(zhuǎn)變，而抑制PCa細(xì)胞中的METTL1則誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向m1樣內(nèi)型轉(zhuǎn)變(圖7B)。此外，PC3 METTL1 KO細(xì)胞cm存在下培養(yǎng)的外周血巨噬細(xì)胞對(duì)CD3+T細(xì)胞的增殖和遷移具有更高的誘導(dǎo)作用(圖7C, D)?？傊?，作者的數(shù)據(jù)表明，METTL1在癌細(xì)胞中的抑制可能會(huì)刺激TME的細(xì)胞毒性和抗腫瘤炎癥反應(yīng)。為了在體內(nèi)驗(yàn)證作者的發(fā)現(xiàn)，作者使用免疫組織化學(xué)分析評(píng)估了人類(lèi)前列腺腫瘤的腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞組成。分析表明，在PCa石蠟樣品中，m2樣巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與METTL1表達(dá)之間存在顯著的直接相關(guān)，但m1樣巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)呈相反趨勢(shì)。同樣，CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)與METTL1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖7E)?？傊?，作者的研究結(jié)果表明，抑制前列腺癌細(xì)胞中METTL1的表達(dá)可以在體外引發(fā)細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)，并進(jìn)一步支持人前列腺癌中METTL1的低表達(dá)與腫瘤內(nèi)細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的增加有關(guān)。

圖7. METTL1在PCa中的低表達(dá)與細(xì)胞毒性浸潤(rùn)增加和對(duì)ICB治療的良好反應(yīng)相關(guān)

9、METTL1抑制增強(qiáng)了前列腺癌患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的應(yīng)答
       PTEN-KO小鼠前列腺上皮中METTL1雜合缺失(PTEN-KO/METTL1+/-)和METTL1條件缺失(PTEN-KO/ mett1flox /flox)導(dǎo)致腹側(cè)和前葉腫瘤體積顯著減少，PTEN-KO/METTL1+/+小鼠的腫瘤體積始終較大(圖7F)?；谄涮卣魇钦T導(dǎo)m1樣巨噬細(xì)胞極化，以及體外CD8+T細(xì)胞的增殖和遷移增強(qiáng)(圖7AD)，作者隨后的研究重點(diǎn)是分析METTL1缺陷前列腺腫瘤中巨噬細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的組成。免疫組織化學(xué)分析顯示，與METTL1+/+腫瘤相比，m1樣巨噬細(xì)胞(iNOS+)的瘤內(nèi)浸潤(rùn)顯著增加，而m2樣巨噬細(xì)胞(Arg1/CD68+)的浸潤(rùn)則顯著增加，并且METTL1+/-和METTL1+/+和METTL1 /flox腫瘤中CD8+T細(xì)胞增加(圖7G)。細(xì)胞毒性T細(xì)胞，以其CD8的表達(dá)而聞名，具有直接識(shí)別和消除癌細(xì)胞的非凡能力，使其成為抗癌免疫反應(yīng)中最有效的效應(yīng)器。為了確定小鼠METTL1缺失的抗腫瘤作用是否由于腫瘤內(nèi)細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)增加，作者檢測(cè)了抗CD8α抗體處理PTEN-KO/METTL1+/+和PTEN-KO/METTL1fl/fl小鼠全身消除CD8+T細(xì)胞的效果。為了闡明METTL1抑制對(duì)免疫腫瘤組成重編程的影響，作者分析了免疫調(diào)節(jié)分子，包括細(xì)胞因子和趨化因子，作為腫瘤中存在的免疫細(xì)胞的替代標(biāo)記物。作者的研究結(jié)果揭示了細(xì)胞因子組成的顯著變化，其特征是促腫瘤細(xì)胞因子的分泌減少。此外，作者觀察到在PTEN-KO/ mePCa1fl /fl腫瘤中，已知與免疫檢查點(diǎn)阻斷(ICB)治療有利應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞因子分泌增加(圖7H)。這些發(fā)現(xiàn)表明，抑制METTL1可能有助于改善ICB治療結(jié)果的免疫微環(huán)境，突出了靶向METTL1作為增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)的治療策略的潛力。為了確定mett1缺陷腫瘤的腫瘤內(nèi)細(xì)胞因子組成是否可以增強(qiáng)ICB治療的療效，作者用抗pd1和抗ctl4a抗體治療小鼠。與未治療的小鼠相比，PTEN-KO/METTL1+/+小鼠在ICB治療后未顯示腫瘤體積減少，而PTEN-KO/ mett1flox /flox小鼠在ICB治療后腫瘤體積顯著減少(圖7I)。作者還研究了METTL1表達(dá)水平是否可以預(yù)測(cè)患者ICB治療的療效。使用ROC繪圖儀平臺(tái)，作者分析了METTL1在抗pd1治療的幾種腫瘤類(lèi)型中的表達(dá)水平。作者發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中，對(duì)ICB治療有反應(yīng)的METTL1表達(dá)低于無(wú)反應(yīng)的METTL1表達(dá)，這表明高M(jìn)ETTL1表達(dá)預(yù)示著對(duì)ICB治療的不良反應(yīng)(圖7J)?？傊?，作者的研究結(jié)果表明，METTL1的表達(dá)水平可以決定腫瘤內(nèi)細(xì)胞毒性免疫浸潤(rùn)和ICB治療的成功。
結(jié)論
       作者的研究為METTL1在前列腺癌(PCa)中的致癌功能和過(guò)表達(dá)提供了令人信服的證據(jù)。作者還通過(guò)tRNA片段生物發(fā)生發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的表達(dá)調(diào)控和選擇性翻譯控制層。通過(guò)抑制METTL1介導(dǎo)的甲基化，作者能夠增加一類(lèi)新的ncRNA (5'TOGs)的生物發(fā)生，這些ncRNA調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中干擾素信號(hào)通路的激活。此外，癌細(xì)胞中METTL1的抑制導(dǎo)致細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)增加，從而將免疫抑制的前列腺TME轉(zhuǎn)變?yōu)闅⒘鰞?nèi)型。這些結(jié)果表明，單獨(dú)靶向METTL1或聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑具有開(kāi)發(fā)有效治療策略的巨大潛力，特別是對(duì)于治療選擇有限的去勢(shì)抵抗性前列腺癌患者。

實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞培養(yǎng)、PI3K通路抑制和DHT治療、患者樣本收集、人類(lèi)前列腺腫瘤數(shù)據(jù)集的計(jì)算表達(dá)和突變負(fù)荷分析、穩(wěn)定細(xì)胞系的克隆和生成、WB、RNA提取、qPCR、斑點(diǎn)印跡、免疫組化、免疫熒光、PAR?CLIP、AlkAniline?seq、tRNA?seq、Northern blotting、流式細(xì)胞術(shù)、Cap binding assay、轉(zhuǎn)染、pulldown、增殖實(shí)驗(yàn)、外周血T細(xì)胞分離、增殖和遷移試驗(yàn)
參考文獻(xiàn)
García-Vílchez R, A?azco-Guenkova AM, Dietmann S, López J, Morón-Calvente V, D'Ambrosi S, Nombela P, Zamacola K, Mendizabal I, García-Longarte S, Zabala-Letona A, Astobiza I, Fernández S, Paniagua A, Miguel-López B, Marchand V, Alonso-López D, Merkel A, García-Tu?ón I, Ugalde-Olano A, Loizaga-Iriarte A, Lacasa-Viscasillas I, Unda M, Azkargorta M, Elortza F, Bárcena L, Gonzalez-Lopez M, Aransay AM, Di Domenico T, Sánchez-Martín MA, De Las Rivas J, Guil S, Motorin Y, Helm M, Pandolfi PP, Carracedo A, Blanco S. METTL1 promotes tumorigenesis through tRNA-derived fragment biogenesis in prostate cancer. Mol Cancer. 2023 Jul 29;22(1):119. doi: 10.1186/s12943-023-01809-8IF: 37.3 Q1 . PMID: 37516825IF: 37.3 Q1 ; PMCID: PMC10386714IF: 37.3 Q1 .