調(diào)節(jié)核糖體生物發(fā)生——TERT加速BRAF突變誘導(dǎo)甲狀腺癌去分化與進(jìn)展
欄目：最新研究動(dòng)態(tài)
發(fā)布時(shí)間：2024-01-23
TERT再激活經(jīng)常發(fā)生在人類惡性腫瘤中，尤其是晚期癌癥。然而，TERT再激活在癌癥進(jìn)展中的體內(nèi)功能及其潛在機(jī)制尚不完全清楚......
TERT再激活經(jīng)常發(fā)生在人類惡性腫瘤中，尤其是晚期癌癥。然而，TERT再激活在癌癥進(jìn)展中的體內(nèi)功能及其潛在機(jī)制尚不完全清楚。在本研究中，作者在小鼠甲狀腺上皮中特異性表達(dá)了TERT和/或活性BRAF （BRAF V600E）。雖然BRAF V600E單獨(dú)誘導(dǎo)乳頭狀甲狀腺癌（PTC），BRAF V600E和TERT共同表達(dá)導(dǎo)致低分化甲狀腺癌（PDTC）?？臻g轉(zhuǎn)錄組分析顯示，共表達(dá)BRAF V600E和TERT的小鼠腫瘤具有高度異質(zhì)性，細(xì)胞去分化與核糖體生物發(fā)生呈正相關(guān)。從機(jī)制上講，TERT通過(guò)與參與核糖體生物發(fā)生的多種蛋白質(zhì)相互作用，促進(jìn)核糖體RNA （rRNA）的表達(dá)和蛋白質(zhì)合成。此外，作者發(fā)現(xiàn)CX-5461是一種rRNA轉(zhuǎn)錄抑制劑，能有效阻斷甲狀腺癌的增殖并誘導(dǎo)其再分化。因此，TERT通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞去分化來(lái)促進(jìn)甲狀腺癌進(jìn)展，而核糖體抑制是治療TERT再激活癌癥的潛在策略。本文于2023年8月發(fā)表在《Science Advances》IF: 13.6期刊上。
技術(shù)路線
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、TERT再激活在多種癌癥中經(jīng)常發(fā)生，預(yù)示著較差的預(yù)后
由于TERT啟動(dòng)子沒(méi)有被全外顯子測(cè)序所覆蓋，TERT再激活在癌癥基因組學(xué)研究中被低估。最近，隨著TERT啟動(dòng)子C228T和C250T突變的發(fā)現(xiàn)，TERT啟動(dòng)子狀態(tài)在幾項(xiàng)大規(guī)模泛癌癥測(cè)序研究中得到檢驗(yàn)。MSK-IMPACT、MSK-MET和China Origimed2020三個(gè)包括最豐富的癌癥類型和樣本的大型隊(duì)列，分析了TERT啟動(dòng)子區(qū)域?？紤]到TERT再激活主要通過(guò)啟動(dòng)子突變或基因擴(kuò)增發(fā)生，作者掃描了這三個(gè)隊(duì)列中的兩種事件，以及癌癥中的TERT擴(kuò)增基因組圖譜計(jì)劃（TCGA）隊(duì)列。作者發(fā)現(xiàn)TERT啟動(dòng)子突變（C228T或C250T）在甲狀腺癌、黑色素瘤、膀胱癌、肝癌、膠質(zhì)瘤和頭頸癌中經(jīng)常發(fā)生，而TERT擴(kuò)增在肺癌、卵巢癌和膀胱癌中常見(jiàn)（圖1A）。在不同的癌癥類型中，黑色素瘤和甲狀腺癌在不同的隊(duì)列中表現(xiàn)出高度的一致性。此外，在紀(jì)念斯隆·凱特琳癌癥中心（MSKCC）數(shù)據(jù)集顯示，TERT啟動(dòng)子突變預(yù)測(cè)甲狀腺癌、膠質(zhì)瘤和膀胱癌的預(yù)后較差（圖1B）。
作者還研究了503個(gè)細(xì)胞系，這些細(xì)胞系通過(guò)全基因組測(cè)序和/或靶向測(cè)序在癌細(xì)胞系百科全書(shū)（CCLE）數(shù)據(jù)集中定義了TERT啟動(dòng)子狀態(tài)（24）。啟動(dòng)子突變是甲狀腺癌和黑色素瘤中TERT激活的主要改變。在這兩種癌癥類型中，來(lái)自轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞系顯示出更高頻率的TERT啟動(dòng)子突變（圖1C），表明TERT激活在癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的潛在功能。
TERT啟動(dòng)子突變（C228或C250）的頻率與甲狀腺癌的病理分期和分化狀態(tài)有關(guān)。分化型甲狀腺癌與良好的生存率相關(guān)，TERT啟動(dòng)子突變的發(fā)生頻率為4%至12%。同時(shí)，約50%預(yù)后不良的低分化甲狀腺癌（PDTC）和間變性甲狀腺癌（ATC）存在TERT啟動(dòng)子突變（圖1D）。值得注意的是，大多數(shù)TERT啟動(dòng)子突變的腫瘤也表現(xiàn)出BRAF或NRAS突變（圖1E）。TCGA計(jì)劃建立了甲狀腺分化評(píng)分（TDS）系統(tǒng)，通過(guò)16個(gè)基因（TG, TPO, PAX8， DIO1, DIO2, DUOX1, DUOX2, FOXE1, GLIS3, NKX2-1，SLC26A4, SLC5A5, SLC5A8, THRA, THRB, TSHR）的mRNA表達(dá)水平評(píng)估甲狀腺癌分化水平。表達(dá)分析顯示，在CCLE甲狀腺癌細(xì)胞系中，TERT表達(dá)水平與TDS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（R = - 0.73, Spearman P = 0.021）（圖1F）?？傊@些結(jié)果表明，TERT再激活，特別是啟動(dòng)子突變，在各種癌癥中經(jīng)常發(fā)生，并與腫瘤進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)。
圖1 TERT再激活預(yù)示著更糟糕的預(yù)后
2、TERT加速BRAF v600e誘導(dǎo)的甲狀腺癌進(jìn)展
如上所述，TERT啟動(dòng)子突變通常與BRAF或NRAS激活突變同時(shí)發(fā)生（圖1E）。作者推測(cè)，TERT過(guò)表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)已有致癌信號(hào)的癌癥進(jìn)展，而不是啟動(dòng)癌變。先前的研究表明，TERT在體外誘導(dǎo)增殖、侵襲和許多其他腫瘤樣行為。
為了闡明體內(nèi)TERT再激活與腫瘤進(jìn)展之間的潛在機(jī)制，作者通過(guò)將Loxp -stop- loxp- Tert - 3xFlag - IRES - EGFP序列插入Rosa26等位基因（RsmTERTLSL/+小鼠;圖1G）建立了條件TERT轉(zhuǎn)基因小鼠模型。然后將小鼠與TPOCreERT2小鼠雜交，產(chǎn)生甲狀腺特異性Tert轉(zhuǎn)基因小鼠模型（TC小鼠），該模型模擬腫瘤中TERT的高表達(dá)。然后，作者采用先前使用的甲狀腺癌小鼠模型，通過(guò)在甲狀腺濾泡細(xì)胞(BC小鼠)中表達(dá)BRAF V600E誘導(dǎo)，與Rs-mTERTLSL/+小鼠雜交，生成BTC小鼠(圖1G)。
隨訪超聲顯示，在誘導(dǎo)后的前7 ~ 10個(gè)月，BC和BTC甲狀腺腫瘤的生長(zhǎng)模式無(wú)顯著差異（圖1,H ~ J）。然而，在10至14個(gè)月后，BTC小鼠的甲狀腺腫瘤生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)快于BC小鼠（圖1,H至J）。BTC和BC小鼠的腫瘤進(jìn)展也通過(guò)18F-FDG正電子發(fā)射斷層掃描-計(jì)算機(jī)斷層掃描（PET-CT）進(jìn)行了分析。12個(gè)月BTC甲狀腺腫瘤的最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值（SUVmax）遠(yuǎn)高于12個(gè)月BTC和8個(gè)月BTC小鼠，而12個(gè)月的BC和8個(gè)月的BTC小鼠FDG SUVmax相似（圖1K）。與上述結(jié)果一致，BTC組預(yù)后較差，中位生存期為406天，而B(niǎo)C組為486.5天（圖1L）?？傊@些結(jié)果表明，當(dāng)BRAF和TERT同時(shí)被激活時(shí)，腫瘤進(jìn)展更快。
3、TERT促進(jìn)BRAF v600e誘導(dǎo)的甲狀腺癌的去分化
與BC小鼠相比，BTC小鼠腫瘤生長(zhǎng)加快，預(yù)后更差（圖1,J和L）。作者隨后表征了不同階段腫瘤的形態(tài)和分子變化。超聲檢查、解剖后的大體外觀、hematoxylin和伊紅（H&E）病理顯示，大多數(shù)BTC腫瘤進(jìn)展為10 ~ 14個(gè)月出現(xiàn)較大的PDTC（15 / 17, 88.2%）。與此形成鮮明對(duì)比的是，盡管一些老年BC小鼠（16 - 18個(gè)月）的腫瘤進(jìn)展為PDTC（5 / 14, 35.7%），但大多數(shù)BC甲狀腺腫瘤仍然是乳頭狀甲狀腺癌（PTCs）（圖2A）。免疫組化（IHC）結(jié)果顯示，BC小鼠腫瘤中甲狀腺癌標(biāo)志物高表達(dá)，包括甲狀腺球蛋白（TG）、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（TTF-1）、配對(duì)盒8（PAX8）、鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體（NIS；Slc5a5）和CK19。這些標(biāo)志物已廣泛用于臨床甲狀腺癌的鑒定。然而，TG和TTF-1在BC腫瘤中的表達(dá)低于鄰近的正常濾泡細(xì)胞（圖2A）。另一方面，BTC小鼠的腫瘤表達(dá)低水平的TG、TTF-1、NIS和PAX8，高水平的Ki67，表明過(guò)度增殖和去分化（圖2A）。從異位Flag-TERT的表達(dá)可以看出，BTC小鼠的腫瘤起源于甲狀腺濾泡細(xì)胞（圖2A）。
晚期甲狀腺癌經(jīng)常轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官，包括肺。作者觀察到BTC肺內(nèi)廣泛的轉(zhuǎn)移灶（圖2B）。轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞SP-C（AT2肺細(xì)胞的標(biāo)志物）和TG呈陰性，TTF-1呈陽(yáng)性，PAX8和NIS呈弱陽(yáng)性，表明這些轉(zhuǎn)移細(xì)胞起源于甲狀腺（圖2C）。
作者分析BC和BTC腫瘤的轉(zhuǎn)錄組，以確定細(xì)胞去分化和腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制。收集BC和BTC小鼠（n = 4和5）的腫瘤，進(jìn)行RNA測(cè)序（RNA-seq）。主成分分析表明BTC和BC甲狀腺腫瘤的基因表達(dá)譜明顯不同（圖2D）。整體評(píng)估顯示BTC腫瘤的TDS評(píng)分要低得多（圖2E）。在BTC腫瘤中，甲狀腺特異性基因如Tg、Pax8、Tshr和Tpo下調(diào)，而多種腫瘤基因如Lgr5、Clu、Mmp9、Pappa2、Mki67和Arg1上調(diào)（圖2F）。作者能夠從BTC腫瘤（312BTC）中分離和永生化原代腫瘤細(xì)胞。這些結(jié)果與免疫組化分析一致，表明BTC小鼠腫瘤具有高增殖和去分化表型。
為確定與BTC小鼠從PTC到PDTC進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵癌癥途徑，對(duì)標(biāo)記基因集進(jìn)行基因集富集分析（GSEA）和基因集變異分析（GSVA）。幾個(gè)癌癥標(biāo)志，如E2F靶點(diǎn)、G2-M檢查點(diǎn)、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、炎癥反應(yīng)、程序性細(xì)胞死亡1配體1（PD-L1）表達(dá)和程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）檢查點(diǎn)通路，在BTC腫瘤中被激活，而氧化磷酸化和脂肪酸代謝則被下調(diào)（圖2、G、H）。此外，KEGG富集分析差異表達(dá)基因表明，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-AKT信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17（IL-17）信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）-受體相互作用和腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路在BTC腫瘤中富集（圖2I）。
圖2 TERT促進(jìn)BRAF突變誘導(dǎo)的甲狀腺癌的去分化
4、BTC腫瘤的空間轉(zhuǎn)錄組分析揭示了rRNA代謝相關(guān)的去分化
為了進(jìn)一步探討TERT在BRAF V600e誘導(dǎo)的甲狀腺癌去分化中的作用，作者對(duì)來(lái)自BTC小鼠的具有高度異質(zhì)性的腫瘤進(jìn)行了Visium 10X空間轉(zhuǎn)錄組(ST)分析。腫瘤具有正常濾泡細(xì)胞、PTC和PDTC的特征區(qū)域，可能代表了甲狀腺癌的整個(gè)發(fā)展軌跡（圖3A）。
為探索甲狀腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，作者重新聚集了637個(gè)甲狀腺上皮斑點(diǎn)（圖3B和C）。簇0（c0）中的細(xì)胞表達(dá)高水平的Tg和Tpo，標(biāo)志著分化良好的濾泡細(xì)胞（圖3D）。一些TDS特征基因如Slc5a5、Thrb、Duox1、Duox2和Tshr在ST分析中未檢測(cè)到；因此，作者定義一個(gè)以Tg、Tpo、Dio1、Fhl1和Sorbs2為特征基因的mST_TDS（小鼠ST TDS）。mST_TDS評(píng)分顯示，c0是分化較好的聚類，其次是c1和分化較差的c2/c3/c4/c5（圖3E）。
為了追蹤甲狀腺簇的進(jìn)化動(dòng)態(tài)，作者使用Monocle3進(jìn)行了軌跡分析，并將分化良好的濾泡細(xì)胞c0作為軌跡起始根（圖3F）。在UMAP投影顯示，甲狀腺細(xì)胞表現(xiàn)出“c0-c1/c2/c3/c4-c5”的進(jìn)化模式，其中c0和c5分別收集在軌跡路線的起點(diǎn)和終點(diǎn)，其他四個(gè)簇分布在兩者之間（圖3G）。因此，作者可以假設(shè)甲狀腺細(xì)胞從c0（表示為state1）進(jìn)化，通過(guò)中間簇c2/c3/c4（state2），最終去分化為c5（state3）。為進(jìn)一步確定分子途徑的改變，使用AUCell計(jì)算三種狀態(tài)的Reactome富集分?jǐn)?shù)（圖3H）。與c0正常甲狀腺表現(xiàn)一致，state1富集于甲狀腺素生物合成途徑。State2呈現(xiàn)介于state1和state3之間的中間狀態(tài)，主要富集ECM和免疫相關(guān)通路。有趣的是，state3在端粒維持中比stat1/2更活躍，并且在rRNA加工和翻譯途徑中富集，這反映了核糖體的生物發(fā)生和活性（圖3H和I）。此外，細(xì)胞對(duì)缺氧和饑餓的反應(yīng)等物理應(yīng)激也在state3細(xì)胞中豐富（圖3H）。這一觀察結(jié)果表明，核糖體生物發(fā)生在c05/state3細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。
圖3 空間轉(zhuǎn)錄組分析揭示了BTC小鼠甲狀腺的異質(zhì)性
5、TERT誘導(dǎo)rRNA合成和核糖體活性
細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）激活被認(rèn)為是rRNA轉(zhuǎn)錄的上游信號(hào)，可能通過(guò)上游結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（UBF）的磷酸化。此外，TERT已被證明可以誘導(dǎo)rRNA和tRNA轉(zhuǎn)錄。作者評(píng)估NTHYCTL、NTHY-B（BRAF V600E）和NTHY-BT（BRAF V600E）細(xì)胞中pre-45SrRNA水平。作者發(fā)現(xiàn)BRAF V600E上調(diào)pre-45SrRNA轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)一步被TERT誘導(dǎo)。因此，TERT和BRAF V600E可能共同促進(jìn)核糖體的生物發(fā)生。
在癌細(xì)胞中，核糖體經(jīng)常失控，導(dǎo)致不受控制的增殖和轉(zhuǎn)移。探索TERT再激活是否與癌癥中核糖體活性相關(guān)，作者分析CCLE數(shù)據(jù)集中與TERT共表達(dá)的基因。與TERT表達(dá)呈正相關(guān)的基因（Spearman R > 0.25, P < 0.01）參與細(xì)胞周期進(jìn)程和rRNA代謝（圖4A）。核糖體由rRNA和核糖體蛋白組成，核糖體的生物發(fā)生需要所有RNA聚合酶（Pol I/II/III），以及小核RNA（snoRNA）和參與rRNA過(guò)程和成熟的多種其他酶的參與。作者發(fā)現(xiàn)在CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)中TERT與rRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子UBTF、POLR3E和FBL以及rRNA外切酶EXOSC2呈正相關(guān)（圖4B）。然后作者分析了最近的甲狀腺癌單細(xì)胞RNA-seq（scRNA-seq）數(shù)據(jù)集。由于在scRNA-seq中沒(méi)有有效檢測(cè)到TERT，因此作者使用Reactome_端粒維持富集評(píng)分作為T(mén)ERT活性的替代品。在甲狀腺細(xì)胞（n = 42，708個(gè)細(xì)胞）中，Reactome_端粒維持富集評(píng)分與rRNA加工（R = 0.53, P < 2.2 × 10?16）和翻譯（R = 0.56, P < 2.2 × 10?16）呈正相關(guān)（圖4C）。這些結(jié)果表明TERT與核糖體代謝密切相關(guān)。
作者進(jìn)一步檢查T(mén)ERT對(duì)不同癌細(xì)胞中rRNA的影響。在K1（甲狀腺癌）、OCM1（黑色素瘤）和BCPAP（甲狀腺癌）細(xì)胞（均有TERT啟動(dòng)子C228T或C250T突變）中TERT敲低后，觀察到rRNA水平急劇下降（圖4D至F）。rRNA的下調(diào)不僅發(fā)生在Pol I轉(zhuǎn)錄的18S、5.8S和28S中，也發(fā)生在Pol Ⅲ轉(zhuǎn)錄的5S rRNA中（圖4E）。相反，異位TERT在甲狀腺細(xì)胞系MDA-T41和結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO和HT-29[均具有野生型（WT） TERT啟動(dòng)子]中顯著誘導(dǎo)rRNA表達(dá)（圖4F）。由于80%以上的細(xì)胞RNA是rRNA，因此采用乙基尿苷（EU）法標(biāo)記新生RNA，尤其是rRNA。在K1和OCM1細(xì)胞中，TERT敲低顯著抑制細(xì)胞核新生rRNA合成，而纖維蛋白（FBL；Cajal體成分）沒(méi)有改變（圖4G到J）?？傊?，這些結(jié)果表明TERT是最佳rRNA合成所必需的。
由于TERT是端粒酶的主要亞基之一，作者想知道端粒酶活性是否參與rRNA的合成。作者發(fā)現(xiàn)，在BCPAP細(xì)胞中，TERC（端粒酶的另一個(gè)主要成分）的敲低導(dǎo)致rRNA表達(dá)減少（圖4K），表明TERT對(duì)rRNA合成的調(diào)控至少部分依賴于端粒酶活性。
核糖體的主要功能是翻譯，以mRNA為模板合成蛋白質(zhì)。由于TERT可以增強(qiáng)rRNA轉(zhuǎn)錄，作者想知道TERT是否可以調(diào)節(jié)翻譯過(guò)程。在作者的ST數(shù)據(jù)和CCLE數(shù)據(jù)集中，高TERT表達(dá)與翻譯相關(guān)（圖3H和4L）。為了驗(yàn)證TERT在翻譯中的作用，作者采用了兩種方法來(lái)檢驗(yàn)翻譯效率。有趣的是，表面翻譯感知（SUnSET）實(shí)驗(yàn)表明，TERT敲低導(dǎo)致BRAF和TERT啟動(dòng)子突變的K1和SW1736細(xì)胞中新生蛋白的產(chǎn)生減少（圖4M）。在雙順?lè)醋訄?bào)告實(shí)驗(yàn)中，TERT的敲低抑制了5’帽和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）依賴的翻譯效率（圖4N）。因此，在TERT再激活的癌細(xì)胞中，蛋白質(zhì)合成似乎依賴于TERT。
圖4 TERT誘導(dǎo)rRNA合成和核糖體活性
6、TERT與核糖體支架相互作用并增強(qiáng)MTORC1活動(dòng)
功能性端粒酶復(fù)合體除TERT和TERC外，還包括DKC1和核糖體生物發(fā)生因子1（PES1）等多種組分。DKC1和PES1與核糖體功能有關(guān)。因此，作者探究TERT是否通過(guò)與rRNA代謝相關(guān)蛋白相互作用參與核糖體途徑。作者采用免疫沉淀和質(zhì)譜法來(lái)鑒定TERT的潛在結(jié)合伙伴。已經(jīng)確定參與RNA分解代謝過(guò)程、核糖體生物發(fā)生、翻譯控制、rRNA加工和端粒維持的幾種蛋白質(zhì)（圖5A）。此外，TERT與參與酵母和人pre-rRNA加工的Bystin Like (BYSL)之間的相互作用在人胚胎腎(HEK) 293T和甲狀腺癌細(xì)胞K1中都被鑒定出來(lái)（圖5B）。此外，作者在K1、HEK293T和小鼠原發(fā)性甲狀腺癌細(xì)胞系312BTC中驗(yàn)證TERT與BYSL以及EIF2亞基之間存在蛋白相互作用（圖5C）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明TERT可能通過(guò)與已知的核糖體調(diào)節(jié)劑相互作用來(lái)調(diào)節(jié)核糖體的生物發(fā)生。
PI3K-AKT和MTORC1信號(hào)通路在調(diào)節(jié)核糖體的蛋白質(zhì)合成中起主要作用。在作者的整體和空間轉(zhuǎn)錄組分析中，PI3K-AKT和MTORC1信號(hào)通路在BTC腫瘤中富集（圖5D）。與此一致的是，參與MTORC1通路的多個(gè)基因，如Rpn1、Xbp1、Eif2s2，在BTC組中上調(diào)（圖5E）。此外，甲狀腺癌的scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示，端粒維持與甲狀腺細(xì)胞中MTORC1介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)存在顯著相關(guān)性（R = 0.43, P < 2.2× 10?16）（圖5F）。此外，作為MTORC1激酶活性的讀數(shù)，p-S6水平在BTC小鼠腫瘤中顯著增強(qiáng)（圖5G）。為了進(jìn)一步研究TERT在甲狀腺癌MTORC1信號(hào)傳導(dǎo)中的作用，作者在MDA-T41細(xì)胞中表達(dá)WT-TERT或DN-TERT（無(wú)端粒酶活性的突變體），并分析MTORC1已知下游效應(yīng)物的磷酸化（圖5H和I）。與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，WT-TERT的表達(dá)有效地誘導(dǎo)了S6和S6K的磷酸化，特別是在血清饑餓條件下（圖5I和J）。因此，MTORC1也可能參與TERT對(duì)核糖體的激活。
圖5 TERT與核糖體支架相互作用，增強(qiáng)MTORC1活性
7、靶向抑制rRNA轉(zhuǎn)錄可阻斷腫瘤進(jìn)展
TERT下游的靶向機(jī)制，如核糖體生物發(fā)生和MTORC1信號(hào)傳導(dǎo)，可能作為與TERT抑制劑相比副作用更小的替代抗腫瘤策略。作者分析癌癥藥物敏感性基因組學(xué)（GDSC）數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)TERT表達(dá)水平較高的細(xì)胞對(duì)CX-5461更敏感，CX-5461是一種Pol Ⅰ介導(dǎo)的rRNA轉(zhuǎn)錄抑制劑，在正常體細(xì)胞中耐受。CX-5461呈現(xiàn)出與之前的端粒酶靶向藥物如BIBR 1532和端粒酶抑制劑IX類似的模式（圖6A）。采用BRAF V600E和TERT啟動(dòng)子共突變體BCPAP和OCM1細(xì)胞以及小鼠312BTC細(xì)胞檢測(cè)CX-5461的作用。CX-5461以劑量依賴的方式抑制癌細(xì)胞增殖（圖6B至D）。隨后建立BCPAP, OCM1和小鼠611BTPC（Trp53失活的312BTC細(xì)胞）皮下腫瘤模型，并口服CX-5461在體內(nèi)檢測(cè)CX-5461的抗腫瘤作用。作者發(fā)現(xiàn)CX-5461在所有三種模型中都有效地抑制了腫瘤生長(zhǎng)，并且在所測(cè)試的小鼠中沒(méi)有或輕微的體重減輕（圖6E至J）。此外，在CX-5461治療后，腫瘤中Ki67的表達(dá)也降低了（圖6K至C）。綜上所述，這些結(jié)果表明CX-5461能夠有效抑制BRAF突變和TERT再激活細(xì)胞的增殖。
圖6 CX-5461抑制多發(fā)性腫瘤進(jìn)展
8、CX-5461誘導(dǎo)甲狀腺癌再分化
放射性碘（RAI）治療被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌的一線治療方法。然而，幾乎所有的PDTC和ATC，以及一些分化良好的甲狀腺癌，由于功能性甲狀腺濾泡標(biāo)志物尤其是碘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NIS的表達(dá)減少，不能有效地吸收碘。這些患者被歸類為RAI難治性，而難治RAI是甲狀腺癌相關(guān)死亡的主要原因之一。鑒于TERT在腫瘤進(jìn)展中的主要作用是誘導(dǎo)腫瘤去分化，阻斷TERT或其下游效應(yīng)物可能導(dǎo)致腫瘤分化。
因此，作者評(píng)估CX-5461對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞分化標(biāo)志物的影響。在CX-5461處理24或48小時(shí)后，K1、BCPAP和SW1736細(xì)胞中PAX8、DIO1、THRA、THRB、FOXE1和TSHR的表達(dá)水平明顯上調(diào)（圖7A至C）。CX-5461治療后，K1和SW1736細(xì)胞中的NIS和PAX8蛋白表達(dá)水平也升高（圖7D至F）。隨后，作者測(cè)試CX-5461治療是否可以增加甲狀腺腫瘤的碘攝取。采用611BTPC同基因腫瘤模型檢測(cè)CX-5461給藥前后腫瘤碘攝取的差異。結(jié)果顯示，CX-5461治療誘導(dǎo)了皮下611BTPC腫瘤的碘攝取，而原生甲狀腺的碘攝取保持不變（圖7G和H）。綜上所述，rRNA轉(zhuǎn)錄阻斷是誘導(dǎo)甲狀腺癌再分化的有效途徑。
圖7 CX-5461誘導(dǎo)甲狀腺癌再分化
結(jié)論
作者在本研究中證明了TERT的條件轉(zhuǎn)基因表達(dá)促進(jìn)了小鼠甲狀腺BRAF V600E突變驅(qū)動(dòng)的去分化和腫瘤轉(zhuǎn)移。TERT在小鼠和人BRAF V600E腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)誘導(dǎo)rRNA轉(zhuǎn)錄和核糖體生物發(fā)生。rRNA轉(zhuǎn)錄抑制劑CX-5461誘導(dǎo)腫瘤分化，減緩腫瘤進(jìn)展（圖8）。
圖8 研究示意圖
綜合結(jié)合動(dòng)物模型、ST測(cè)序、數(shù)據(jù)庫(kù)分析和實(shí)驗(yàn)揭示了核糖體途徑中的TERT。
實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞培養(yǎng)；建立小鼠甲狀腺原代細(xì)胞系；質(zhì)粒和慢病毒包；質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染；動(dòng)物超聲成像和PET-CT；活體[125I]攝取實(shí)驗(yàn)；免疫組織化學(xué)染色；RNA提取，cDNA合成和RT-qPCR；Bulk RNA-seq；ST樣品制備，文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序；ST數(shù)據(jù)處理和可視化；軌跡分析；甲狀腺癌單細(xì)胞數(shù)據(jù)集分析；單細(xì)胞或ST富集分析；EU assay；免疫印跡；免疫沉淀；液相色譜-質(zhì)譜；端粒重復(fù)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)；表面翻譯感知；雙鏈雙熒光素酶報(bào)告基因；集落形成；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒；甲狀腺癌患者OncoVee MiniPDX
參考文獻(xiàn)
Yu P, Qu N, Zhu R, Hu J, Han P, Wu J, Tan L, Gan H, He C, Fang C, Lei Y, Li J, He C, Lan F, Shi X, Wei W, Wang Y, Ji Q, Yu FX, Wang YL. TERT accelerates BRAF mutant-induced thyroid cancer dedifferentiation and progression by regulating ribosome biogenesis. Sci Adv. 2023 Sep; 9（35）: eadg7125. doi: 10.1126/sciadv.adg7125.