單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組分析揭示結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的細(xì)胞異質(zhì)性
結(jié)直腸癌（CRC）是全球第三大最常見(jiàn)的惡性腫瘤，14.5 - 17.5%的患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。癌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間通過(guò)分泌細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和蛋白酶來(lái)重塑腫瘤微環(huán)境（TME），從而促進(jìn)轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）描述了原發(fā)性CRC的免疫環(huán)境，但CRC肝轉(zhuǎn)移的總體細(xì)胞格局以及原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性CRC之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)差異很少有報(bào)道。在本研究中，作者使用單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序全面繪制了CRC和匹配的CRC肝轉(zhuǎn)移的細(xì)胞圖譜。在CRC原發(fā)腫瘤和肝轉(zhuǎn)移之間，觀察到CAF、CD8+ T細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等主要細(xì)胞類型的不同表型特征和高度變化的頻率，表明TME內(nèi)部的分子異質(zhì)性，為未來(lái)的CRC肝轉(zhuǎn)移的治療提供潛在的靶點(diǎn)。該研究于2023年6月發(fā)表在《Science Advances》，IF：13.6。
技術(shù)路線
主要研究結(jié)果
1. CRC原發(fā)腫瘤和CRC肝轉(zhuǎn)移瘤的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜
從6例CRC患者的原發(fā)結(jié)直腸癌（CC）、鄰近正常結(jié)直腸黏膜（CN）、肝轉(zhuǎn)移（LM）、鄰近正常肝組織（LN）和外周血（PB）收集了CD45?非免疫細(xì)胞和CD45+免疫細(xì)胞，用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析（圖1A）。在主要的非免疫細(xì)胞群中，進(jìn)一步的無(wú)監(jiān)督聚類產(chǎn)生11個(gè)腫瘤細(xì)胞簇、8個(gè)成纖維細(xì)胞簇和6個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞簇（圖1B）。LM中CA2和F2_MCAM富集，F(xiàn)4_F3和F5_CCL11在CC中顯著富集（圖1C）。根據(jù)已知marker的表達(dá)情況，將免疫細(xì)胞分為41個(gè)群體。雖然LN中單核細(xì)胞、NK細(xì)胞和黏膜相關(guān)不變T （MAIT）細(xì)胞占主導(dǎo)地位，但TIME被轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞重塑，Tregs和巨噬細(xì)胞顯著上調(diào)（圖1E）。這些結(jié)果表明，在CRCLM的不同組織中具有不同分布模式的多個(gè)細(xì)胞群。
圖1. 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的整體細(xì)胞景觀
2. CRC原發(fā)腫瘤及CRC肝轉(zhuǎn)移瘤的空間分布特征
收集6例患者的6個(gè)組織標(biāo)本，包括4例結(jié)直腸癌原發(fā)灶（C1 ~ C4）和2例肝轉(zhuǎn)移灶（L1和L2）。通過(guò)hematoxylin-eosin staining和每個(gè)樣本的基因表達(dá)特征確定腫瘤區(qū)域（T）和癌旁區(qū)域（PT）（圖2A）。與癌旁組織相比，腫瘤組織富集細(xì)胞周期相關(guān)通路，如G2-M檢查點(diǎn)、E2F靶點(diǎn)和有絲分裂紡錘體（圖2B）。根據(jù)基因表達(dá)譜將腫瘤組織和癌旁組織劃分為不同區(qū)域（圖2A）。與C1、C3、C4的瘤旁組織相比，腫瘤組織中的漿細(xì)胞比例降低（圖2C、D）。
圖2. 空間轉(zhuǎn)錄組樣本的細(xì)胞鑒定
3. TME重塑骨髓細(xì)胞的組成
使用subclustering分析確定八個(gè)集群的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和三個(gè)集群的常規(guī)DCs （cDCs）（圖3A）。髓樣細(xì)胞在各部位有明顯的分布規(guī)律（圖3 B），展示出器官特異性表征。與癌旁組織相比，Mac_SPP1亞群在腫瘤組織中富集，且大部分Mac_SPP1亞群細(xì)胞來(lái)自原發(fā)腫瘤。此外，在CXCL9高表達(dá)的LM中，Mac_CXCL9的比例顯著升高（圖3C），提示該亞群可以募集CXCR3陽(yáng)性的效應(yīng)性T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤。參與募集髓系細(xì)胞（尤其是粒細(xì)胞）的基因（如CXCL3）在Mac_SPP1亞群中富集（圖3D）。GSVA分析表明Mac_SPP1亞群參與炎癥反應(yīng)相關(guān)通路。然而，Mac_CXCL9亞群在干擾素-γ （IFN-γ）應(yīng)答和T細(xì)胞活化通路中富集（圖3E）。軌跡分析顯示Mac_CXCL9和Mac_SPP1亞群均出現(xiàn)終末分化，表明它們是腫瘤激活的亞群（圖3F）。
在CC和LM中均發(fā)現(xiàn)cDC1 （cDC_CPNE3）和cDC2 （cDC_CD1c）（圖3A）。此外，cDC_LAMP3在LM中被鑒定并富集（圖3C）。cDC_LAMP3高表達(dá)CCR7（圖3G）， CCR7是CCL19和CCL21的受體，表明其具有向淋巴結(jié)遷移的能力。此外，cDC_LAMP3亞群高表達(dá)共刺激分子CD40、CD80和CD86，這些分子是DC成熟的標(biāo)志（圖3H）。在LM中cDC_LAMP3亞群的比例顯著增加，表明腫瘤細(xì)胞在TIME上被馴化。
圖3. 骨髓細(xì)胞的免疫景觀
4. CXCL13+ T細(xì)胞在肝轉(zhuǎn)移瘤中富集
CD8+ T細(xì)胞和CD4+ T細(xì)胞中都有一簇表達(dá)CXCL13, CXCR5的趨化因子（圖4A、B）。與LN相比，LM中CD8_CXCL13細(xì)胞的百分比顯著增加。然而，這個(gè)亞群很少在CN、LN和PB中檢測(cè)到 （圖4C、D）。在結(jié)腸的穩(wěn)定狀態(tài)下約3 - 12%的CD4細(xì)胞呈CXCL13陽(yáng)性。在CC中，CD4_CXCL13的百分比減少，但與LN相比，LM中該亞群的百分比增加（圖4E）。
為進(jìn)一步研究CXCL13+ T細(xì)胞亞群的特征，作者分析了各亞群中上調(diào)的通路。GSVA分析顯示CD8_CXCL13亞群富集T細(xì)胞增殖通路，CD4_CXCL13亞群富集G2-M檢查點(diǎn)通路，顯示出這兩個(gè)亞群的增殖特性（圖4F、G）。CC和LM的CD69+ CD103+ CD8+ T細(xì)胞的Ki67表達(dá)水平均高于其他CD8+ T細(xì)胞。然而，CN和LN中不同CD8+ T細(xì)胞亞群的增殖特性幾乎相同（圖4H）。綜上所述，這些結(jié)果表明CD8_CXCL13和CD4_CXCL13細(xì)胞在結(jié)直腸癌LM中表達(dá)上調(diào)，因?yàn)樗鼈兙哂休^高的增殖能力。
圖4. 腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄重編程。
5. CXCL13+ T細(xì)胞與結(jié)直腸癌患者的良好預(yù)后相關(guān)
在上述結(jié)果中，作者發(fā)現(xiàn)與CD4_CXCL13亞群相比，CD8_CXCL13在CC和LM中富集（圖4D、E），表明CD8_CXCL13細(xì)胞可能是一個(gè)腫瘤激活亞群。因此，進(jìn)一步研究CD8_CXCL13亞群的特征。與其他亞群相比，在CD8_CXCL13亞群中觀察到高水平的耗竭標(biāo)志物，如PDCD1、HAVCR2、LAG3、CTLA4和TIGIT（圖5A、B）。軌跡分析顯示CD8_CXCL13細(xì)胞處于終末分化狀態(tài)（圖5C）。此外，CD8_CXCL13亞群還表達(dá)高水平的效應(yīng)分子，如GZMB（圖5A、B），這表明該亞群可能保留部分抗腫瘤功能。由于在組織中很難檢測(cè)到CXCL13，用CD69和CD103標(biāo)記CXCL13+ 細(xì)胞，IHC結(jié)果顯示CD69+ CD103 + CD8+ T細(xì)胞比其他腫瘤組織中的CD8+ T細(xì)胞更接近CK19+腫瘤細(xì)胞（圖5D、E），促進(jìn)其腫瘤殺傷功能。值得注意的是，CD103+ CD8+ T細(xì)胞存在于結(jié)直腸癌組織的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（TLSs）中，且TLS評(píng)分越高的患者，其CD8_CXCL13評(píng)分越高，這表明該亞群可能參與TLS的形成（圖5F、G）。將基因表達(dá)綜合（GEO）隊(duì)列中的CRC患者分為CXCL13高表達(dá)和CXCL13低表達(dá)組，發(fā)現(xiàn)CC中CXCL13的高表達(dá)預(yù)示著較好的總生存期（圖5H）。綜上所述，在TME中富集的CXCL13+ T細(xì)胞是腫瘤反應(yīng)性的亞群，有助于改善CRC患者的預(yù)后。
圖5. CXCL13+ T細(xì)胞的特性及預(yù)后影響
6. 結(jié)直腸癌的原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶中存在不同的成纖維細(xì)胞亞群
在結(jié)直腸癌的TME中，發(fā)現(xiàn)8個(gè)具有不同基因表達(dá)模式的成纖維細(xì)胞簇，分別為F1_PRELP、F2_MCAM、F3_HAS1、F4_F3、F5_CCL11、F6_IGFL2、F7_COCH和F8_MKI67 （圖6A）。與CC相比，LM中F2_MCAM簇的百分比較高。F4_F3和F5_CCL11亞群主要包含來(lái)自CC的細(xì)胞（圖6B）。根據(jù)批量RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，F(xiàn)4_F3在CC中的浸潤(rùn)較CN中增加。然而，在CC中F5_CCL11亞群的百分比下降，基于軌跡分析，可能會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)镕4_F3亞群（圖6C）。軌跡分析還預(yù)測(cè)F2_MCAM和F4_F3是兩個(gè)不同的終末分化簇（圖6C）。IHC分析證實(shí)F2_MCAM存在于CC和LM中（圖6D）。然而，與單細(xì)胞分析一致，F(xiàn)4_F3亞群只在CC中存在，而在LM中不存在，這種現(xiàn)象可能是由于LN中不存在F4_F3而CN中存在（圖6E、F）。ST分析也證實(shí)，CC中F4_F3亞群的浸潤(rùn)比LM中更多（圖6G、H）。CN和CC中F4_F3亞群緊密地圍繞在上皮細(xì)胞周圍，促進(jìn)其與上皮細(xì)胞的相互作用（圖6I）。此外，F(xiàn)4_F3在CC中的浸潤(rùn)增加可能導(dǎo)致預(yù)后惡化（圖6J）。綜上所述，在結(jié)直腸癌的原發(fā)腫瘤和肝轉(zhuǎn)移腫瘤中，觀察到不同的表型特征和高度可變的成纖維細(xì)胞頻率，這表明在不同的癌癥環(huán)境中TME內(nèi)的細(xì)胞異質(zhì)性。
圖6. 原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征和異質(zhì)性
7. 表達(dá)F3的成纖維細(xì)胞亞群在結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤中富集并分泌腫瘤因子，與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后相關(guān)
進(jìn)一步分析CC和LM的特征，F(xiàn)4_F3富集C3和CXCL1，表明該亞群參與補(bǔ)體和炎癥反應(yīng)通路（圖7A、B）。F4_F3也表達(dá)高水平的MMP2和MMP3，這可能有助于細(xì)胞外基質(zhì)的組織（圖7A ）。此外，參與血管生成和腫瘤侵襲的腫瘤因子，如VEGFA、NRG1、HGF、GDF15、AREG和BMP2，在F4_F3中富集（圖7C）。F4_F3與腫瘤細(xì)胞的相互作用分析進(jìn)一步揭示它們通過(guò)NRG1和Erb-B2受體酪氨酸激酶3 （ERBB3）通路進(jìn)行交叉對(duì)話，ERBB3在腫瘤細(xì)胞中富集，并能與ERBB2形成異二聚體，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和CRC患者對(duì)西妥昔單抗的耐藥（圖7D）。ST分析也表明F3與NRG1共定位，包圍ERBB3+腫瘤細(xì)胞（圖6G和圖7E-I）。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示，重組人NRG1 （rNRG1）可以促進(jìn)RKO和SW620細(xì)胞的遷移（圖7J）。F3和NRG1高表達(dá)的CRC患者總生存期較差（圖7K）。這些結(jié)果表明，CC富集的成纖維細(xì)胞F4_F3可能通過(guò)分泌腫瘤因子導(dǎo)致CRC患者的不良預(yù)后。
圖7. F3+成纖維細(xì)胞的特性及預(yù)后影響
8. LM TME中表達(dá)MCAM的成纖維細(xì)胞通過(guò)Notch信號(hào)通路調(diào)控CD8_CXCL13細(xì)胞的生成
Notch信號(hào)傳導(dǎo)因子RBPJ優(yōu)先表達(dá)于CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亞群（圖5A）。LM中的RBPJ表達(dá)與CXCL13和ITGAE呈正相關(guān)，而在CC中未觀察到這一情況（圖8A）。CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亞群主要表達(dá)NOTCH1受體（圖8B）。F2_MCAM亞群富集JAG1, F5_COCH亞群富集DLL1，而E2_DLL4子集富集DLL4、JAG1和JAG2（圖8C）。使用CellPhone DB對(duì)Notch及其配體的相互作用分析顯示，在內(nèi)皮細(xì)胞中，E2_DLL4亞群與CXCL13+ T細(xì)胞的相互作用最強(qiáng)，而在成纖維細(xì)胞中，F(xiàn)2_MCAM亞群通過(guò)JAG1-NOTCH1與CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亞群的相互作用最強(qiáng)（圖8D）。
接下來(lái)，根據(jù)LM中F2_MCAM的比例將患者分為兩組，發(fā)現(xiàn)F2_MCAM-high組患者的LM中CD8_CXCL13亞群比例更高（圖8E）。GEO數(shù)據(jù)集分析顯示，F(xiàn)2_MCAM浸潤(rùn)評(píng)分較高的患者在LM中有較高的CD8_CXCL13亞群浸潤(rùn)評(píng)分，而在CC中CD4_CXCL13亞群無(wú)此情況（圖8F）。此外，通過(guò)ST檢測(cè)F2_MCAM和CD8_CXCL13在LM中的位置。與單細(xì)胞結(jié)果一致，在ST樣本中，F(xiàn)2_MCAM浸潤(rùn)評(píng)分較高的區(qū)域CD8_CXCL13浸潤(rùn)評(píng)分較高（圖8G、H）。
圖8. TME中NOTCH信號(hào)調(diào)節(jié)CD8_CXCL13細(xì)胞的生成
9. ST組織的細(xì)胞間相互作用網(wǎng)絡(luò)
作者還研究了原發(fā)腫瘤和肝轉(zhuǎn)移腫瘤ST中不同簇之間的細(xì)胞相互作用。結(jié)果表明，VEGFA-NRP1和VEGFA-NRP2配體-受體對(duì)在原發(fā)性和肝轉(zhuǎn)移瘤中均有富集。還發(fā)現(xiàn)CC和LM之間存在多種不同的富集的配體-受體對(duì)。ERBB3-NRG1對(duì)在C1和C3豐富,但在L1和L2中均缺失（圖9A），表明ERBB3-NRG1相互作用在原發(fā)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中具有潛在作用。綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤中富集的F3+成纖維細(xì)胞可以通過(guò)產(chǎn)生各種腫瘤因子（包括NRG1）來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展和遷移，NRG1與腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的ERBB3相互作用來(lái)發(fā)揮其腫瘤功能。然而，與CC中的腫瘤亞群F3+成纖維細(xì)胞不同，LM中富集的MCAM+成纖維細(xì)胞可以通過(guò)Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)CD8_CXCL13細(xì)胞的生成，表明不同腫瘤環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞異質(zhì)性（圖9B）。
圖9. ST組織中細(xì)胞配體和受體的相互作用
結(jié)論
綜上所述，本研究使用單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序全面繪制了結(jié)直腸癌和匹配的肝轉(zhuǎn)移CRC的細(xì)胞圖譜。結(jié)直腸癌原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶的不同表型和主要細(xì)胞類型，如CAF、CD8+ T細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的頻率高度變化，提示TME內(nèi)的分子異質(zhì)性，并為未來(lái)的腫瘤治療提供了潛在的靶點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)方法
單細(xì)胞RNA文庫(kù)制備及測(cè)序，scRNA-seq數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與預(yù)處理，無(wú)監(jiān)督細(xì)胞聚類和注釋，單樣品基因集富集分析，基因集變異分析，SCENIC分析，細(xì)胞分化軌跡推理，流式細(xì)胞術(shù)，分子相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，免疫組化染色，結(jié)直腸癌患者生存分析，基因表達(dá)相關(guān)性分析，ST組織處理、數(shù)據(jù)處理和細(xì)胞類型浸潤(rùn)評(píng)分計(jì)算，細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
參考文獻(xiàn)
Wang F, Long J, Li L, Wu ZX, Da TT, Wang XQ, Huang C, Jiang YH, Yao XQ, Ma HQ, Lian ZX, Zhao ZB, Cao J. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 2023 Jun 16;9(24):eadf5464. doi: 10.1126/sciadv.adf5464. Epub 2023 Jun 16. PMID: 37327339; PMCID: PMC10275599.