Netrin-1 阻斷可抑制子宮內(nèi)膜癌的腫瘤生長和 EMT 特征

摘要
       Netrin-1 作為一種促腫瘤機(jī)制在癌癥中上調(diào)。在這里，我們描述了大多數(shù)人類子宮內(nèi)膜癌 (EC) 中 netrin-1 的上調(diào)，并證明使用抗 netrin-1 抗體 (NP137) 阻斷 netrin-1 可有效減少 EC 小鼠模型中的腫瘤進(jìn)展。接下來，我們在一項由 14 名晚期 EC 患者組成的 I 期試驗中檢查了 NP137 作為一種首創(chuàng)的單一藥物的療效。我們觀察到 8 例疾病穩(wěn)定和 1 例 RECIST v.1.1 客觀緩解。為了評估 NP137 的作用機(jī)制，對小鼠腫瘤基因進(jìn)行了分析，我們觀察到，除了誘導(dǎo)細(xì)胞死亡之外，NP137 還抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)。通過對 NP137 試驗中 EC 患者的治療前和治療中配對活檢進(jìn)行批量 RNA 測序、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細(xì)胞RNA-seq，我們注意到腫瘤 EMT 的凈減少。這與免疫浸潤的變化以及癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間相互作用的增加有關(guān)。鑒于 EMT 在抵抗當(dāng)前護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)中的重要性，我們在 EC 小鼠模型中表明，NP137 與卡鉑-紫杉醇的組合優(yōu)于單獨(dú)的卡鉑-紫杉醇。我們的結(jié)果確定 netrin-1 阻斷是一種觸發(fā)腫瘤減滅和 EMT 抑制的臨床策略，從而有可能減輕對標(biāo)準(zhǔn)治療的耐藥性。
       該研究于2023年8月發(fā)表在《Nature》，IF：64.8。
技術(shù)路線

結(jié)果
1、Netrin-1 和子宮內(nèi)膜腺癌
       我們通過逆轉(zhuǎn)錄定量 PCR (RT-qPCR) 分析了 72 個人類子宮內(nèi)膜腫瘤隊列中 netrin-1 的表達(dá)。netrin-1 在子宮內(nèi)膜腺癌 (EC) 中顯著上調(diào)，而級別或亞型沒有具體變化。其主要受體 UNC5B 在腫瘤組織中的表達(dá)量也高于正常子宮內(nèi)膜。通過免疫組織化學(xué) (IHC) 監(jiān)測大多數(shù)子宮內(nèi)膜腫瘤的 Netrin-1（和 UNC5B）陽性率。
       因此，我們轉(zhuǎn)向使用基因工程、時間控制的 Pten f/f 缺失小鼠模型（即他莫昔芬誘導(dǎo)的 CAG-CreERT+/- 啟動子）來概括 EC 發(fā)展的臨床前模型，該模型已被證明可以發(fā)展 EC原位快速發(fā)生，以及甲狀腺增生（圖1a）。因此，我們用 NP137（10 mg kg-1，每周 3 次）治療對照小鼠和 Pten 缺失小鼠 3-4 周，并分析 netrin-1 表達(dá)和腫瘤進(jìn)展。如圖1b、c所示，在Pten缺失后，netrin-1在小鼠腫瘤中上調(diào)，而在NP137治療后這種上調(diào)有所減少。有趣的是，NP137 與子宮內(nèi)膜腫瘤的發(fā)展減少和生存增加相關(guān)（圖 1d；請注意，Pten 刪除后 7 周后研究沒有擴(kuò)展，因為大多數(shù)小鼠表現(xiàn)出呼吸困難或其他癥狀。由于甲狀腺腫瘤的發(fā)展而引起的疾?。?。病理學(xué)家觀察到 NP137 治療后癌細(xì)胞數(shù)量減少（圖 1e），子宮內(nèi)膜組織更健康（圖 1f）。同樣，在接受 NP137 治療的小鼠的甲狀腺中也觀察到了抗腫瘤活性。這些結(jié)果表明，針對 EC 中的 netrin-1 可以抑制腫瘤進(jìn)展。

2、EC 患者的客觀反應(yīng)
       基于先前的結(jié)果表明 netrin-1 阻斷是一種可行的癌癥治療策略，我們開發(fā)了一種 netrin-1 阻斷抗體用于臨床使用，并正在進(jìn)行 I/II 期評估。我們從正在進(jìn)行的 1 期研究中提取了 14 名 EC 患者的療效數(shù)據(jù)。在這項研究中，NP137 作為單一療法每 2 周 (Q2W) 給藥一次，直至臨床/放射學(xué)進(jìn)展。如圖 2a 和擴(kuò)展數(shù)據(jù)表 1a 所示，沒有觀察到劑量限制性毒性，超過一半的患者的疾病控制為最佳反應(yīng)。此外，一名患有晚期 EC 的 74 歲女性患者出現(xiàn)了 RECIST1.1 定義的部分緩解。該患者的最初診斷顯示子宮內(nèi)膜樣起源、微衛(wèi)星穩(wěn)定表型以及 CK7、PAX8 和雌激素受體表達(dá)，但不表達(dá) CK20 或孕激素受體。在給予 NP137 之前，她已接受多次治療嘗試，包括輔助放療和卡鉑-紫杉醇，隨后使用 lurbinectedin 作為轉(zhuǎn)移性疾病的一線治療，并第二次嘗試使用卡鉑-紫杉醇，但盡管進(jìn)行了這些治療，肝轉(zhuǎn)移仍出現(xiàn)進(jìn)展。
       納入時進(jìn)行的正電子發(fā)射斷層掃描-計算機(jī)斷層掃描 (PET-CT) 掃描證實(shí)了氟脫氧葡萄糖的強(qiáng)烈攝?。ㄔ?C1D1 之前）。她接受了 14mg/kg 靜脈注射 NP137 Q2W，并在第 6 周（即 NP137 第 3 個周期后）接受了 PET-CT 掃描，根據(jù) RECIST v.1.1 顯示部分緩解，目標(biāo)肝臟病變減少了 51%（圖 2b、c)。 3 個月時 PET-CT 掃描證實(shí)部分緩解（圖 2c），然后在 6 個月時再次確認(rèn)，此時目標(biāo)病灶尺寸縮小達(dá)到 55%。該患者最終在 NP137 17 個周期后出現(xiàn)疾病進(jìn)展，并繼續(xù)接受額外治療，包括來曲唑 A、免疫療法和他莫昔芬，但沒有出現(xiàn)額外的客觀反應(yīng)。

3、Netrin-1 阻斷抑制腫瘤 EMT
       為了深入了解 netrin-1 阻斷與腫瘤生長抑制之間的聯(lián)系，我們首先根據(jù) netrin-1 阻斷的假設(shè)作用模式分析了腫瘤生長抑制是否與 Pten f/f 腫瘤中的腫瘤細(xì)胞死亡相關(guān)用NP137處理。如圖 3a、b 所示，通過 IHC 對活性 caspase-3 進(jìn)行測量，NP137 增加了癌癥細(xì)胞凋亡。接下來，我們對經(jīng)過 NP137 治療的 Pten f/f 小鼠腫瘤與未經(jīng)治療的 Pten f/f 小鼠腫瘤進(jìn)行了 RNA 測序。在 NP137 給藥后調(diào)節(jié)的途徑/基因中，我們注意到治療后 EMT 相關(guān)基因的減少。幾項體外研究表明 netrin-1 參與 EMT，通常與 PI3K/AKT 通路相關(guān)，該通路在子宮內(nèi)膜癌中經(jīng)常發(fā)生改變。然后我們研究了 NP137 是否可能影響 Pten f/f 小鼠模型中的腫瘤 EMT。我們首先評估了對照組與 NP137 治療腫瘤中 EpCAM 上皮標(biāo)志物的表達(dá)，并觀察到該上皮標(biāo)志物在 NP137 治療腫瘤中顯著增加（圖 3c，d）。為了更全面地了解腫瘤基因表達(dá)，我們利用了常用的泛癌 EMT 特征，可用于確定 EMT 評分。我們觀察到，NP137治療降低了EMT評分（圖3e），與間充質(zhì)基因表達(dá)減少和上皮基因表達(dá)增加相關(guān)（圖3f）。這些臨床前數(shù)據(jù)支持這樣的觀點(diǎn)，即 netrin-1 阻斷對腫瘤細(xì)胞具有雙重作用：觸發(fā)癌細(xì)胞死亡和抑制 EMT 特征，使整體 NP137 治療的腫瘤更具上皮性。
       接下來我們確定在臨床前模型中觀察到的 EMT 特征的抑制是否也發(fā)生在接受 NP137 治療的患者中。在 NP137 1 期試驗中，在上述 EC 患者中，在納入時 (C1D1) 以及使用抗 netrin-1 化合物治療 1 個月后（即在第三次輸注 NP137 之前 (C3D1) 收集配對活檢））。對 12 個配對的治療前和治療中活檢組織成功進(jìn)行了批量 RNA 測序（補(bǔ)充表 1b），如圖 4a、b 所示，發(fā)現(xiàn)兩次 NP137 注射足以引發(fā)胰腺癌 EMT 評分顯著下降如上所述，表明在用 NP137 治療 1 個月后，患者的腫瘤總體上皮表型更多。經(jīng) NP137 治療的患者腫瘤樣本中 EpCAM IHC 染色的增加證實(shí)了向上皮表型的轉(zhuǎn)變（圖 4c、d）。我們還觀察到共表達(dá)全細(xì)胞角蛋白和波形蛋白的腫瘤細(xì)胞比例下降（圖4e）。
       有趣的是，在分析基線和治療活檢之間 EMT 評分的變化時，我們觀察到，以疾病進(jìn)展作為對 NP137 最佳反應(yīng)的患者樣本（第 6 周首次評估時疾病進(jìn)展）未能顯示 EMT 評分的變化。相反，在疾病控制的患者樣本中，EMT 評分出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)顯著下降。
       為了更正式地證明患者接受 NP137 治療后出現(xiàn)的 EMT 評分的大量變化專門發(fā)生在癌細(xì)胞中，作為第一種方法，我們使用了與福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 組織兼容的 10x Visium 空間基因表達(dá)系統(tǒng)。對兩名 EC 患者的兩對 C1D1/C3D1 FFPE 切片進(jìn)行了分析，并在病理學(xué)家選擇的感興趣區(qū)域中進(jìn)行了空間基因表達(dá)譜分析，其中H&E染色只能識別癌細(xì)胞。在這兩種情況下，與 C1D1 相比，C3D1 的 EMT 評分均大幅下降（圖 4f）。因此，在患者中，用 NP137 治療 1 個月后，與治療前狀態(tài)相比，剩余的癌細(xì)胞表現(xiàn)出減少的 EMT 特征。
       為了將這些研究擴(kuò)展到單細(xì)胞水平，我們直接對 NP137 試驗中納入時和 1 個月后獲得的新鮮活檢組織（C1D1，9,216 個細(xì)胞）進(jìn)行了 3′?單細(xì)胞 RNA 測序（10x Genomics Next GEM 3′?試劑盒）來自晚期 EC 患者（圖 5a）的治療結(jié)果（C3D1，7,159 個細(xì)胞）。無監(jiān)督聚類顯示存在不同的細(xì)胞群，包括腫瘤細(xì)胞（表達(dá) EpCAM、PGR 和 TFF3 - ECs21 的所有標(biāo)記）、免疫細(xì)胞（以 CD45 (PTPRC) 表達(dá)標(biāo)記）、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF，以 αSMA (ACTA2 標(biāo)記)）和內(nèi)皮細(xì)胞（PECAM1 陽性）（圖 5b）。NP137 治療導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞區(qū)室顯著減少（圖 5b、c）。
       經(jīng)過兩個周期的 NP137 治療后，抗 netrin-1 治療后的腫瘤細(xì)胞比例降低了 3.19 倍。有趣的是，除了癌細(xì)胞的凈減少外，我們還注意到整個腫瘤區(qū)室的 EMT 評分在統(tǒng)計上顯著下降，表明與 NP137 治療相關(guān)的總體上皮表型更多（圖 5d）。我們還僅在腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行了無偏差異表達(dá)和通路分析。值得注意的是，EMT 是最重要的術(shù)語，在暴露于 NP137 后下調(diào)。有趣的是，在 NP137 治療后，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的亞區(qū)室以類似的方式減少，我們注意到腫瘤簇?2 的減少幅度最強(qiáng)，也顯示出較高的 EMT 評分（圖 5e-h；注意簇?2）具有高 EMT 評分，在 NP137 處理后未檢測到，但我們不能排除它們未被捕獲的可能性，因為這些簇在 C1D1 時已經(jīng)具有很少的細(xì)胞）。
       腫瘤區(qū)室中發(fā)生的變化也與基質(zhì)細(xì)胞的變化相關(guān)（圖5b、c和6）。值得注意的是，NP137 治療顯然對免疫細(xì)胞有影響（圖 6a、b）。更具體地說，在NP137治療后，我們注意到具有細(xì)胞毒功能的淋巴細(xì)胞（CD8+T細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞；圖6c）增加。在用 NP137 治療的 Pten f/f 小鼠中也注意到 CD8+ 細(xì)胞的類似增加。有趣的是，在 NP137 治療后，我們在 2 號患者的單細(xì)胞分析中注意到了這兩種情況。 01-40 號患者的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。 01-034和01-039增加了T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間相互作用的數(shù)量和強(qiáng)度（圖6d，e）。特別是，單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)顯示CD8+T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間相互作用的數(shù)量和強(qiáng)度增加（圖6d）。檢測到 M2 巨噬細(xì)胞減少，同時主要組織相容性 I/II 類抗原呈遞增加。 NP137 治療與更有效的抗原呈遞細(xì)胞 (APC) 相關(guān)，因為我們觀察到與癌細(xì)胞相互作用的 C1D1 中的單核細(xì)胞明顯轉(zhuǎn)變?yōu)?C3D1 中的樹突狀細(xì)胞（圖 6d、e）。

   
4、NP137 抑制化療耐藥
       由于大量文獻(xiàn)將 EMT 描述為化療耐藥的主要原因，并且我們的數(shù)據(jù)表明靶向 netrin-1 會抑制 EMT，因此我們評估了是否將 NP137 添加到卡鉑-紫杉醇（卡博紫杉醇）（標(biāo)準(zhǔn)化療藥物）中。子宮內(nèi)膜癌臨床環(huán)境中使用的非護(hù)理化療可能會增強(qiáng) Pten f/f 小鼠子宮內(nèi)膜腺癌模型中單獨(dú)使用卡波紫杉醇的療效。NP137/卡博他賽治療被證明優(yōu)于單獨(dú)的卡博他賽，導(dǎo)致小鼠totally緩解?？偠灾@些臨床前和臨床數(shù)據(jù)表明，臨床階段的藥物既能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞減滅，又能引發(fā) EMT 特征的全面抑制，從而有可能減輕對傳統(tǒng)療法的耐藥性。

實(shí)驗方法
RT–qPCR、Bulk RNA-seq、scRNA-seq、IHC分析、多重免疫組化、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)。
參考文獻(xiàn)
Cassier, P.A., Navaridas, R., Bellina, M. et al. Netrin-1 blockade inhibits tumour growth and EMT features in endometrial cancer. Nature 620, 409–416 (2023).