肺泡巨噬細(xì)胞外泌體分泌的Ficolin B通過cGAS-STING信號通路通過鐵死亡加劇博來霉素誘導(dǎo)的肺損傷
多年來，肺損傷一直危害著全球人類的健康，因此對肺損傷的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探索和及時(shí)干預(yù)是非常必要的。Ficolin B（Fcn B）是一種可識別多種配體的識別分子，在介導(dǎo)細(xì)胞周期、免疫反應(yīng)和肺組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。然而，F(xiàn)cn B在博萊霉素（BLM）誘導(dǎo)的肺損傷中的作用尚不明確。本研究旨在探討Fcn B在博萊霉素誘導(dǎo)的肺損傷中的來源及其機(jī)制。研究選取WT、Fcna-/-和Fcnb-/-小鼠構(gòu)建BLM誘導(dǎo)的肺損傷模型。利用肺上皮細(xì)胞構(gòu)建BLM誘導(dǎo)的細(xì)胞模型。臨床數(shù)據(jù)表明，間質(zhì)性肺病（ILD）患者血漿中的 M-ficolin（Fcn B的同源物）含量升高。在小鼠模型中，巨噬細(xì)胞衍生的Fcn B加劇了BLM誘導(dǎo)的肺損傷和肺纖維化。Fcn B進(jìn)一步促進(jìn)了自噬和鐵死亡的發(fā)展。值得注意的是，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BLM誘導(dǎo)的AMs外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的Fcn B通過激活cGAS-STING通路加速了肺上皮細(xì)胞的自噬和鐵死亡。與此相反，3-甲基腺嘌呤（3-MA）通過抑制自噬依賴性鐵死亡，逆轉(zhuǎn)了BLM誘導(dǎo)的AMs外泌體中的Fcn B對肺上皮細(xì)胞損傷的促進(jìn)作用。同時(shí)，在BLM誘導(dǎo)的小鼠模型中，BLM誘導(dǎo)的AMs外泌體分泌的Fcn B的干預(yù)作用通過鐵死亡促進(jìn)了肺損傷和肺纖維化。綜上所述，本研究表明，由AMs外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的Fcn B通過cGAS-STING信號通路促進(jìn)肺上皮細(xì)胞鐵死亡，從而加劇了BLM誘導(dǎo)的肺損傷。本文于2023年8月發(fā)表于《cell death & disease》，IF=9。
技術(shù)路線
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.巨噬細(xì)胞來源的Fcn B加重BLM誘導(dǎo)的肺損傷和纖維化
首先，作者的臨床數(shù)據(jù)顯示，間質(zhì)性肺?。↖LD）患者血漿中L-ficolin（Fcn A的同源物）的濃度與健康人相比無明顯差異，而M-ficolin（Fcn B的同源物）的濃度則明顯升高（圖1A）。為了探討Fcn B對肺損傷的影響，用BLM刺激WT、Fcna-/-和 Fcnb-/-小鼠。在BLM誘導(dǎo)前，WT、Fcna-/-和Fcnb-/-小鼠的存活率均為100%。然而，BLM誘導(dǎo)的WT小鼠的存活率明顯降低，而BLM誘導(dǎo)的Fcnb-/-（而非 Fcna-/-）小鼠的存活率則略有降低（圖1B）。HE染色證明，BLM誘導(dǎo)后小鼠肺泡結(jié)構(gòu)受到不同程度的損傷，肺泡壁增厚并伴有炎癥浸潤，表明肺損傷模型構(gòu)建成功。與WT+BLM 組相比，F(xiàn)cnb-/-+BLM 組的肺泡結(jié)構(gòu)相對完整，炎癥浸潤最少（圖1C）。代表組織纖維化的Masson染色顯示，只有Fcnb-/-+BLM組的肺間質(zhì)膠原纖維沉積量少于 WT+BLM組（圖1D）。同樣，F(xiàn)cnb-/-+BLM組BALF中的總蛋白濃度和肺組織中的羥脯氨酸濃度也明顯低于WT+BLM 組（圖1E、F）。此外，F(xiàn)cnb-/-+BLM組肺組織中α-SMA的表達(dá)也明顯低于WT+BLM組（圖1E，F(xiàn)）。此外，與WT+BLM組相比，F(xiàn)cnb-/-+BLM組小鼠肺中α-SMA的表達(dá)明顯下調(diào)（圖1G）。BLM誘導(dǎo)后，WT和Fcna-/-小鼠肺部和血液中Fcn B表達(dá)的增加主要來自巨噬細(xì)胞（部分來自中性粒細(xì)胞）（圖1H，I）。與BLM誘導(dǎo)的WT小鼠相比，BLM誘導(dǎo)的Fcnb-/-小鼠肺中巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少。這些結(jié)果證明巨噬細(xì)胞衍生的Fcn B加重了BLM誘導(dǎo)的肺損傷和肺纖維化。
圖1：來自巨噬細(xì)胞的Fcn B加重了BLM誘導(dǎo)的肺損傷和纖維化
2.Fcn B促進(jìn)BLM誘導(dǎo)肺損傷模型中的自噬和鐵死亡
接下來，為了探索Fcn B加重肺損傷的原因，作者檢測了小鼠模型中與自噬和鐵死亡相關(guān)的標(biāo)志物水平。與WT+BLM組相比，F(xiàn)cna-/-+BLM組和Fcnb-/-+BLM組的肺組織中LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達(dá)減少，而p62的表達(dá)增加（圖2A）。與WT+BLM組相比，F(xiàn)cnb-/-+BLM組肺和血清中MDA和Fe2+濃度降低，GSH濃度顯著升高（圖2B）。然后檢測肺組織的ROS水平，結(jié)果顯示Fcnb-/-+BLM組明顯低于WT+BLM 組（圖2C）。此外，與WT+BLM組相比，F(xiàn)cnb-/-+BLM組肺組織中GPX4、SLC7A11、FTH1、FTL1表達(dá)明顯增加，NCOA4表達(dá)減少（圖2D、E）。因此，這些結(jié)果表明，在BLM誘導(dǎo)的肺損傷模型中，F(xiàn)cn B可以促進(jìn)自噬和死亡。
圖2： Fcn B促進(jìn)BLM誘導(dǎo)的肺自噬和鐵死亡
3.BLM誘導(dǎo)的AMs外泌體加速肺上皮細(xì)胞中Fcn B的表達(dá)、自噬和鐵死亡
作者應(yīng)用外泌體抑制劑GW4869探討其對AMs外泌體功能的影響。BLM誘導(dǎo)后，AMs中Fcn B的mRNA表達(dá)上調(diào)（圖3A）。在Transwell細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，添加GW4869可抑制外泌體從上腔BLM誘導(dǎo)的AMs向下腔BLM誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞的分泌和遷移（圖3B）。當(dāng)BLM處理過的肺上皮細(xì)胞與BLM處理過的AMs共同培養(yǎng)時(shí)，F(xiàn)cn B的轉(zhuǎn)錄顯著增加。不幸的是，使用GW4869后這一趨勢被逆轉(zhuǎn)（圖3C）。隨后，Western印跡結(jié)果顯示，BLM處理過的肺上皮細(xì)胞與BLM處理過的AMs共同培養(yǎng)后，LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達(dá)上調(diào)，p62的表達(dá)下調(diào)。然而，添加GW4869可逆轉(zhuǎn)這些變化（圖3D, E）。生化檢測進(jìn)一步表明，與BLM處理過的AMs共同培養(yǎng)會顯著增加BLM處理過的肺上皮細(xì)胞中MDA和Fe2+ 的濃度，同時(shí)降低GSH的濃度。然而，GW4869的存在降低了MDA和Fe2+的濃度，但增加了GSH的濃度（圖3F，G）。此外，BLM處理的肺上皮細(xì)胞與BLM處理的AMs共培養(yǎng)后，ROS水平和死亡率也明顯升高，但在GW4869條件下則有所下降（圖3H，I）。同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)，BLM處理的肺上皮細(xì)胞與BLM處理的AMs共同培養(yǎng)后，GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達(dá)明顯下調(diào)，而NCOA4的表達(dá)明顯上調(diào)。然而，施用GW4869后，上述結(jié)果發(fā)生了逆轉(zhuǎn)（圖3J，K）。這些結(jié)果表明，AMs中Fcn B的調(diào)節(jié)可能是參與自噬和鐵死亡的一種機(jī)制，從而減輕BLM誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞損傷。
圖3：BLM誘導(dǎo)的AMs外泌體增加Fcn B表達(dá)，促進(jìn)肺上皮細(xì)胞自噬和鐵死亡
4.BLM誘導(dǎo)的AMs通過外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的Fcn B介導(dǎo)肺上皮細(xì)胞自噬和鐵死亡
為了研究AMs與Fcn B之間的聯(lián)系，作者提取了外泌體并進(jìn)行了一系列表征。NTA結(jié)果顯示，大多數(shù)外泌體的大小在40到160 nm之間（圖4A）。TEM圖像顯示，外泌體通常呈碟形，呈單一分布（圖4B）。Western 印跡進(jìn)一步顯示，外泌體中表達(dá)了特定的標(biāo)記物CD9、CD63和CD81（圖4C）。PKH67標(biāo)記的外泌體被肺上皮細(xì)胞成功吸收并分布在細(xì)胞核周圍（圖4D）。經(jīng)BLM處理的肺上皮細(xì)胞與經(jīng)BLM處理的AMs衍生的外泌體共培養(yǎng)后，F(xiàn)cn B的mRNA表達(dá)上調(diào)（圖4E）。BLM處理的肺上皮細(xì)胞與轉(zhuǎn)染了oe-Fcnb的AMs衍生的外泌體共培養(yǎng)后，F(xiàn)cn B的mRNA表達(dá)有更明顯的增加。用si-Fcnb轉(zhuǎn)染肺上皮細(xì)胞并用BLM處理后，F(xiàn)cn B的mRNA表達(dá)明顯受到抑制。然而，與轉(zhuǎn)染了oe-Fcnb并經(jīng)BLM處理的AMs衍生的外泌體共同培養(yǎng)可逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)（圖4F）。隨后的Western印跡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-Fcnb可顯著下調(diào)BLM處理的肺上皮細(xì)胞中LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達(dá)，并上調(diào)p62的表達(dá)。然而，與轉(zhuǎn)染了oe-Fcnb和BLM處理過的AMs衍生外泌體共同培養(yǎng)卻得到了相反的結(jié)果（圖4G，H）。此外，生化檢測結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染了oe-Fcnb和BLM處理過的AMs衍生外泌體共培養(yǎng)后，si-Fcnb對MDA和Fe2+濃度的抑制作用以及對BLM處理過的肺上皮細(xì)胞中GSH的促進(jìn)作用被逆轉(zhuǎn)（圖4I）。同樣，與轉(zhuǎn)染oe-Fcnb 和BLM處理的AMs衍生外泌體共培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)染si-Fcnb和BLM處理的肺上皮細(xì)胞的ROS水平和死亡率顯著增加（圖4J，K）。Western 印跡結(jié)果顯示，在 BLM 處理的肺上皮細(xì)胞中，si-Fcnb轉(zhuǎn)染可明顯促進(jìn) GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達(dá)，抑制NCOA4的表達(dá)。然而，當(dāng)與轉(zhuǎn)染了oe-Fcnb和BLM處理過的AMs衍生的外泌體共同培養(yǎng)時(shí)，這一趨勢發(fā)生了逆轉(zhuǎn)（圖4L，M）。這些結(jié)果表明，BLM誘導(dǎo)的AMs 通過外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的Fcn B介導(dǎo)了肺上皮細(xì)胞的自噬和鐵死亡。
圖4：由BLM誘導(dǎo)的AMs轉(zhuǎn)運(yùn)的Fcn B外泌體有助于肺上皮細(xì)胞自噬和鐵死亡
5.BLM誘導(dǎo)的AMs外泌體中的Fcn B通過cGAS-STING通路促進(jìn)肺上皮細(xì)胞自噬和鐵死亡
當(dāng)用BLM誘導(dǎo)si-Fcnb或si-cGAS轉(zhuǎn)染的肺上皮細(xì)胞時(shí)，cGAS、LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達(dá)下調(diào)，STING的磷酸化也降低，而p62的表達(dá)上調(diào)。然而，當(dāng)它們與轉(zhuǎn)染oe-Fcnb和BLM誘導(dǎo)的AMs共同培養(yǎng)時(shí)，cGAS、LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達(dá)上調(diào)，STING的磷酸化也增加，而p62的表達(dá)下調(diào)（圖5A-C）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BLM誘導(dǎo)后，si-Fcnb或si-cGAS轉(zhuǎn)染的肺上皮細(xì)胞中MDA和Fe2+的水平降低，而GSH的水平升高。然而，將轉(zhuǎn)染oe-Fcnb的AMs與BLM誘導(dǎo)的AMs共同培養(yǎng)后，MDA和Fe2+的水平升高，而GSH的水平則相反（圖5D，E）。同樣，當(dāng)轉(zhuǎn)染了si-Fcnb或si-cGAS的肺上皮細(xì)胞被BLM誘導(dǎo)時(shí)，ROS水平和細(xì)胞死亡率均下降。相反，當(dāng)它們與轉(zhuǎn)染oe-Fcnb和BLM誘導(dǎo)的AMs共同培養(yǎng)時(shí)，ROS水平和細(xì)胞死亡率均升高（圖5F，G）。鐵死亡相關(guān)蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)染si-Fcnb或si-cGAS的肺上皮細(xì)胞被BLM誘導(dǎo)時(shí)，GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達(dá)上調(diào)，NCOA4的表達(dá)下調(diào)。不幸的是，當(dāng)它們與轉(zhuǎn)染oe-Fcnb和BLM誘導(dǎo)的AMs共培養(yǎng)時(shí)，GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達(dá)下調(diào)，而NCOA4的表達(dá)上調(diào)（圖5H，I）。這些結(jié)果表明，BLM誘導(dǎo)的AMs外泌體中的Fcn B促進(jìn)了cGAS-STING通路介導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞自噬和鐵死亡。
圖5：cGAS-STING通路介導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞自噬和鐵死亡，由BLM誘導(dǎo)的AMs外泌體的Fcn B促進(jìn)
6.BLM誘導(dǎo)的AMs外泌體中的Fcn B通過cGAS-STING途徑促進(jìn)的肺上皮細(xì)胞鐵死亡是自噬依賴性的
為進(jìn)一步闡明肺上皮細(xì)胞鐵死亡與自噬的關(guān)系，將si-cGAS轉(zhuǎn)染和 BLM誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞與不同AMs的外泌體共同培養(yǎng)，并結(jié)合自噬抑制劑3-MA進(jìn)行研究。si-cGAS轉(zhuǎn)染的肺上皮細(xì)胞和BLM誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞的線粒體損傷均有所減輕。當(dāng)它們與轉(zhuǎn)染oe-Fcnb和BLM處理過的AMs外泌體共同培養(yǎng)時(shí)，線粒體損傷加劇。然而，使用3-MA逆轉(zhuǎn)了oe-Fcnb轉(zhuǎn)染對細(xì)胞造成的損傷，細(xì)胞中的大多數(shù)線粒體保持正常狀態(tài)（圖6A）。此外，3-MA還降低了BLM誘導(dǎo)的AMs外泌體中的Fcn B對si-cGAS轉(zhuǎn)染細(xì)胞和BLM誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞的自噬促進(jìn)作用，表現(xiàn)出 LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7表達(dá)減少，p62表達(dá)增加（圖6B）。接著，轉(zhuǎn)染oe-Fcnb和BLM處理的AMs外泌體促進(jìn)了si-cGAS轉(zhuǎn)染和BLM處理的肺上皮細(xì)胞中MDA和Fe2+的積累，并抑制了GSH的合成，而添加3-MA則顯示出相反的效果（圖6C，D）。此外，si-cGAS轉(zhuǎn)染和BLM處理的肺上皮細(xì)胞與oe-Fcnb轉(zhuǎn)染和BLM處理的AMs外泌體共培養(yǎng)后，GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達(dá)下調(diào)，NCOA4的表達(dá)上調(diào)，但這些變化在3-MA條件下相反（圖6G，H）。這些結(jié)果表明，抑制自噬可通過cGAS-STING 通路減輕BLM誘導(dǎo)的AMs外泌體中的Fcn B促進(jìn)的肺上皮細(xì)胞鐵死亡。
圖6：抑制自噬可通過cGAS-STING通路減輕BLM誘導(dǎo)的AMs外泌體中的Fcn B 促進(jìn)的肺上皮細(xì)胞鐵死亡
7.在BLM誘導(dǎo)的小鼠模型中，從AMs外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的Fcn B通過鐵死亡促進(jìn)肺損傷和纖維化
為了研究AMs外泌體衍生的Fcn B在體內(nèi)的功能，WT和Fcnb-/-小鼠受到BLM刺激后，尾靜脈注射轉(zhuǎn)染oe-Fcnb和BLM誘導(dǎo)的AMs外泌體進(jìn)行干預(yù)。HE 染色顯示，與WT+BLM組相比，F(xiàn)cnb-/-+BLM組的肺泡結(jié)構(gòu)更完整，炎癥浸潤更少。然而，與Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組相比，F(xiàn)cnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組的肺泡結(jié)構(gòu)不完整，炎癥浸潤增加（圖7A）。Masson染色還顯示，F(xiàn)cnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組的肺間質(zhì)纖維化增加（圖7B）。此外，我們還發(fā)現(xiàn)Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組比Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組肺組織BALF總蛋白濃度增加、羥脯氨酸和α-SMA表達(dá)增加（圖7C-E）。此外，與Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC 組相比，F(xiàn)cnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組肺部組織中受損線粒體數(shù)量增加（圖8A）。此外，與Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組相比，F(xiàn)cnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組肺中LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達(dá)明顯上調(diào)，p62的表達(dá)明顯下調(diào)（圖8B）。生化檢測顯示，與Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組相比，F(xiàn)cnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組肺組織和血清中MDA和Fe2+濃度顯著升高，而GSH濃度降低（圖8C，D）。流式細(xì)胞術(shù)顯示，F(xiàn)cnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組肺組織中的ROS水平高于Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組（圖8E）。此外，與Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組相比，F(xiàn)cnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組肺組織中GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達(dá)顯著下調(diào)，而NCOA4的表達(dá)上調(diào)（圖8F，G）。此外，F(xiàn)cnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組中cGAS的表達(dá)和STING的磷酸化明顯高于Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組（圖8H）。這些結(jié)果表明，在BLM誘導(dǎo)的小鼠模型中，從AMs外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的Fcn B通過鐵死亡促進(jìn)了肺損傷和肺纖維化。
圖7：AMs外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的Fcn B有助于BLM誘導(dǎo)的小鼠模型的肺損傷和肺纖維化
圖8：AMs外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的Fcn B促進(jìn)了BLM誘導(dǎo)的小鼠的鐵死亡
結(jié)論
總之，這是第一篇研究Fcn B在BLM誘導(dǎo)的肺損傷中的作用的報(bào)道，它表明由AMs外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的Fcn B可通過cGAS-STING途徑促進(jìn)肺上皮細(xì)胞鐵凋亡，從而加重BLM誘導(dǎo)的肺損傷（圖9）。
圖9
參考文獻(xiàn)
Wu, X., Jiang, Y., Li, R. et al. Ficolin B secreted by alveolar macrophage exosomes exacerbates bleomycin-induced lung injury via ferroptosis through the cGAS-STING signaling pathway. Cell Death Dis 14, 577 (2023). https://doi.org/10.1038/s41419-023-06104-4
常規(guī)分子實(shí)驗(yàn)
外泌體的提取和鑒定、HE染色、Masson染色、生化檢測、蛋白質(zhì)印跡檢測、RT-qPCR
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
細(xì)胞培養(yǎng)和處理、流式細(xì)胞術(shù)
動物模型及病理實(shí)驗(yàn)
BLM誘導(dǎo)肺損傷模型的構(gòu)建與干預(yù)