全乳酸組揭示實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎中TH17分化的乳酸依賴機(jī)制

欄目：最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間：2024-03-08
?CD4+?T 細(xì)胞分化失調(diào)與自身免疫性疾病有關(guān)。從氧化磷酸化到糖酵解的代謝重編程以及乳酸的積累都與這一過程有關(guān)......



       CD4+ T 細(xì)胞分化失調(diào)與自身免疫性疾病有關(guān)。從氧化磷酸化到糖酵解的代謝重編程以及乳酸的積累都與這一過程有關(guān)。然而，其潛在機(jī)制仍不清楚。本研究表明，乳酸衍生的乳酸化調(diào)控CD4+ T 細(xì)胞的分化。CD4+ T細(xì)胞中的乳酸化水平隨著實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）的進(jìn)展而增加。抑制乳酸化可抑制TH17分化并減輕EAU炎癥。機(jī)制上，Ikzf1在Lys164處的高乳酸化通過直接調(diào)節(jié)TH17相關(guān)基因（包括Runx1、Tlr4、白細(xì)胞介素-2（IL-2）和IL-4）的表達(dá)，促進(jìn)TH17的分化。Ikzf1在Lys164處的脫乳作用損害TH17的分化。這些發(fā)現(xiàn)例證糖酵解如何調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)乳酸化的位點(diǎn)特異性以促進(jìn)TH17分化，并將Ikzf1乳酸化作為自身免疫性疾病的潛在治療靶點(diǎn)。該研究于2023年10月發(fā)表在《Science Advances》，IF：13.6。
技術(shù)路線


主要研究結(jié)果
1. EAU小鼠CD4+ T細(xì)胞中乳酸化水平升高
       建立EAU小鼠模型，并通過裂隙燈攝影和病理檢查評(píng)估葡萄膜炎的進(jìn)展。EAU 小鼠的脾臟重量明顯增加，但各組間體重?zé)o顯著差異（圖1A-B）。與年齡匹配的對(duì)照組相比，EAU 小鼠脾臟和 CD4+ T 細(xì)胞中的乳酸含量更高（圖1C）。使用免疫磁珠分離CD4+ T 細(xì)胞，CD4+ T細(xì)胞中的乳酸化水平隨著EAU的進(jìn)展而增加（圖1D）。同時(shí)，免疫熒光染色顯示，EAU小鼠脾臟中CD4+ T細(xì)胞的乳酸化水平過高（圖1E）。隨著葡萄膜炎的發(fā)展，病理免疫細(xì)胞破壞血液-視網(wǎng)膜屏障，并引發(fā)視網(wǎng)膜的破壞性反應(yīng)。第14天浸潤(rùn)視網(wǎng)膜的CD4+ T細(xì)胞乳酸化過度，第21天Pan-Kla陽(yáng)性的CD4+ T細(xì)胞比例下降（圖1F）。這些結(jié)果表明，乳酸化參與自身免疫性葡萄膜炎中CD4+ T細(xì)胞在病理刺激下的免疫反應(yīng)。


圖1. EAU小鼠CD4+ T細(xì)胞中乳酸化水平升高

2. 抑制乳酸化作用可抑制EAU的進(jìn)展
       在本研究中，DCA 治療減少CD4+ T 細(xì)胞中乳酸的產(chǎn)生和乳酸化水平（圖 2A -B）。它還降低EAU 小鼠的臨床和病理評(píng)分（圖2C -E）。相比之下，用魚藤酮阻斷線粒體代謝會(huì)增加 CD4+ T 細(xì)胞的乳酸化，加劇EAU的惡化（圖2A-E）。第14天，EAU+DCA組（用DCA治療的EAU小鼠）脾細(xì)胞中TH17細(xì)胞的比例下降，而EAU+魚藤酮組（用魚藤酮治療的EAU小鼠）脾細(xì)胞中TH17細(xì)胞的比例上升。然而，EAU+DCA組和EAU+魚藤酮組之間的TH1和Treg細(xì)胞比例沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異（圖2F-G）。這些結(jié)果表明，調(diào)節(jié)CD4+ T 細(xì)胞的乳酸化水平可影響TH17細(xì)胞的分化和EAU的進(jìn)展。


圖2. 抑制乳酸化作用可抑制EAU的進(jìn)展

3. 乳酸化作用調(diào)節(jié)體外TH17分化
       通過磁性分選分離純化的na?ve CD4+ T 細(xì)胞，并單獨(dú)使用抗CD3和CD28 抗體（TH0條件）或在 IL-6、TGF-β、IL-23 和 IL-1β 存在下（TH17 條件）進(jìn)行刺激。誘導(dǎo)5天后，使用 FCM 分析細(xì)胞質(zhì) IL-17 的產(chǎn)生。發(fā)現(xiàn)，TH17 條件下CD4+ T細(xì)胞的乳酸化水平高于 TH0 條件下的 CD4+ T 細(xì)胞（圖3A）。DCA 處理下調(diào)CD4+ T 細(xì)胞的乳酸化水平，抑制TH17 細(xì)胞的分化，而魚藤酮處理上調(diào)乳酸化水平，增強(qiáng)TH17 的分化（圖3B-C）。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)分泌型 IL-17，也得到類似的結(jié)果（圖3D）。這些結(jié)果表明，CD4+ T 細(xì)胞中的乳酸化對(duì) TH17 的分化非常重要。


圖3. 乳酸化作用調(diào)節(jié)體外TH17分化

4. CD4+ T細(xì)胞中乳酸化蛋白的全貌
       為研究正常和EAU小鼠CD4+ T細(xì)胞上的Kla底物，采用一種包括免疫親和富集和四維質(zhì)譜儀的綜合方法。從每組10多只小鼠中分離出1×108個(gè)CD4+ T 細(xì)胞，然后進(jìn)行裂解。肽用胰蛋白酶消化，用固定的抗 Kla 增強(qiáng)，然后進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析（LC-MS/MS；圖4A）。乳算化蛋白分布在不同的亞細(xì)胞定位中。在細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)359個(gè)乳酸化蛋白（32.28%）；在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)448個(gè)乳酸化蛋白（40.29%）；在線粒體中發(fā)現(xiàn)123個(gè)乳酸化蛋白（11.06%）（圖4B）。
       圖4C顯示乳酸化賴氨酸殘基附近氨基酸的頻率變化。Motif-X分析發(fā)現(xiàn) KxAxxxxxxxK是 Kla 位點(diǎn)代表性極高的熱點(diǎn)（圖4D）。使用 NetSurfP 進(jìn)行的結(jié)構(gòu)特性分析表明，大多數(shù)乳酸化位點(diǎn)位于線圈（67%）和螺旋（28%）中，其余5%位于鏈中（圖4E）。與未乳酸化的殘基相比，乳酸化殘基更偏向于鏈狀和螺旋狀，這表明CD4+ T細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上更偏向于Kla。圖 4F 中的散點(diǎn)圖顯示Kla 位點(diǎn)與肽強(qiáng)度的量化關(guān)系。


圖4. CD4+ T細(xì)胞中乳酸化蛋白的全貌

5. Ikzf1在 Lys164處的高乳酸化對(duì)TH17的分化非常重要
       測(cè)量CD4+ T 細(xì)胞中 Kla 蛋白相對(duì)于總蛋白豐度的變化。前15種差異乳酸化蛋白（DLPs）如圖5A所示。GO分析顯示，乳酸化上調(diào)蛋白富集于多個(gè)生物過程，包括淋巴細(xì)胞分化和基因表達(dá)調(diào)控（圖5B）。圖5（C -D）顯示包括 Ikzf1 C端y離子和N端b離子在內(nèi)的MS/MS圖譜。觀察到對(duì)照組和EAU小鼠的 CD4+ T細(xì)胞（圖5E）之間以及TH0和TH17細(xì)胞（圖5F）之間的Ikzf1表達(dá)沒有明顯差異。免疫沉淀（IP）檢測(cè)后的免疫印跡證實(shí)，EAU小鼠CD4+ T細(xì)胞中Ikzf1的乳酸化水平上調(diào)（圖5E）。用短發(fā)夾RNA敲除內(nèi)源性Ikzf1，并在na?ve CD4+ T細(xì)胞中分別過表達(dá)Flag標(biāo)記的野生型（WT）Ikzf1、K164R突變Ikzf1和K373R突變Ikzf1（圖5G）。這些細(xì)胞被用于誘導(dǎo)TH17。結(jié)果顯示，敲除Ikzf1 會(huì)影響TH17的分化（圖5H），表明Ikzf1在調(diào)控TH17分化中的重要作用。WT和K373R Ikzf1過表達(dá)可挽救TH17的分化，但在oe-K164R組仍觀察到較低的分化率（圖5H）。這些結(jié)果表明，Ikzf1在Lys164 處的乳酸化對(duì)TH17的分化非常重要。


圖5. Ikzf1在 Lys164處的高乳酸化對(duì)TH17的分化非常重要

6. Ikzf1 K164la在EAU小鼠 CD4+ T細(xì)胞中上調(diào)
       為了進(jìn)一步驗(yàn)證不同條件下Ikzf1在Lys164處的乳酸化水平，開發(fā)針對(duì)Ikzf1修飾肽[NLLRHI-(lactyl)K-LHSGEK]的特異性抗體。點(diǎn)印跡檢測(cè)顯示，所構(gòu)建的抗體特異性地靶向Ikzf1的乳酸化肽，而不與未乳酸化的Ikzf1肽結(jié)合（圖6A）。利用這種特異性抗體，證實(shí)在TH17誘導(dǎo)下，CD4+ T 細(xì)胞中Ikzf1在Lys164處的乳酸化水平升高（圖 6B）。以前曾發(fā)現(xiàn)，魚藤酮處理可提高CD4+ T細(xì)胞的Pan-Kla水平并促進(jìn)TH17分化。在本研究中，發(fā)現(xiàn)這一過程伴隨著Ikzf1 K164乳酸化的上調(diào)，并且乳酸化水平在DCA處理后下降（圖6C）。同時(shí)，隨著EAU的進(jìn)展，Ikzf1 K164乳酸化上調(diào)，并且在體內(nèi)對(duì)魚藤酮和DCA處理有調(diào)節(jié)作用（圖6D-E）。這些結(jié)果進(jìn)一步表明Ikzf1 K164乳酸化在TH17分化和自身免疫性葡萄膜炎中的關(guān)鍵作用。


圖6. Ikzf1 K164la在EAU小鼠CD4+ T細(xì)胞中上調(diào)

7. CUT& Tag分析揭示Ikzf1在TH17分化條件下的轉(zhuǎn)錄后果
       進(jìn)行CUT& Tag分析，以探索CD4+ T細(xì)胞中可能受Ikzf1 K164la調(diào)控的基因，并研究Ikzf1 K164la在TH17發(fā)育中的潛在功能意義。簡(jiǎn)而言之，用 oe-WT Ikzf1或oe-K164R Ikzf1過表達(dá)Ikzf1敲除的na?ve CD4+ T 細(xì)胞，用于TH17 誘導(dǎo)。誘導(dǎo)5天后，收獲細(xì)胞進(jìn)行CUT& Tag分析。CUT& Tag結(jié)果顯示，在TH17分化條件下，CD4+ T細(xì)胞中的Ikzf1峰明顯富集，兩組中都發(fā)現(xiàn)超過15,000個(gè)Ikzf1結(jié)合峰，其中>60%位于啟動(dòng)子序列（≤3 kb；圖7A-B）。GO 分析顯示，下調(diào)的峰值相關(guān)基因富集在多個(gè)免疫過程中，包括淋巴細(xì)胞分化（圖7C）。
       具體而言，在TH17分化調(diào)控基因（包括IL-2、IL-4、Tlr4和Runx1）的候選基因組位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)的調(diào)用峰顯示，K164R組Ikzf1在這些基因啟動(dòng)子上的富集水平降低（圖7D）。意外的是，反轉(zhuǎn)錄qPCR（RT-qPCR）結(jié)果顯示，在sh-Ikzf1 組中，阻止TH17分化的基因，包括IL-2和IL4的表達(dá)水平上調(diào)，而促進(jìn)TH17分化的基因，包括Runx和Tlr4的表達(dá)水平下調(diào)（圖7E）。WT和K373R Ikzf1的過表達(dá)抑制IL-2和IL-4的表達(dá)，并挽救Runx1和Tlr4的表達(dá)，但K164R Ikzf1的過表達(dá)沒有顯示出這種效應(yīng)（圖7E）。這些結(jié)果進(jìn)一步證明Ikzf1在Lys164乳酸化調(diào)控下的雙重轉(zhuǎn)錄激活和抑制能力。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)用于驗(yàn)證Ikzf1的不同轉(zhuǎn)錄能力。一致的是，Ikzf1敲除會(huì)影響Runx1的轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)IL-2的轉(zhuǎn)錄，WT和K373R Ikzf1overexpression能逆轉(zhuǎn)這種情況，但K164R過表達(dá)則不能（圖7F-G）。在Ikzf1敲除的na?ve CD4+ T 細(xì)胞中應(yīng)用重組抗IL-2抗體。結(jié)果顯示，抗IL-2處理挽救TH17分化，并上調(diào)IL-17的表達(dá)（圖7H-I）?？傊@些結(jié)果表明，Ikzf1在Lys164 處的乳酸化作用通過激活Runx1和Tlr4的轉(zhuǎn)錄以及抑制 IL-2和IL4的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)TH17的分化（圖8）。


圖7. CUT& Tag分析揭示Ikzf1在TH17分化條件下的轉(zhuǎn)錄后果

圖8. 本研究的示意圖

       總之，本研究探討了乳酸化在TH17細(xì)胞分化和EAU進(jìn)展中的潛在作用。描述了CD4+ T細(xì)胞的乳酸化圖譜，并報(bào)告了Ikzf1在Lys164處的乳酸化調(diào)節(jié)TH17 的分化。此外，還驗(yàn)證了 Ikzf1在TH17相關(guān)基因中的雙重轉(zhuǎn)錄激活和抑制作用，這些基因都受到乳酸化作用的調(diào)控。因此，本研究擴(kuò)大了乳酸化蛋白質(zhì)組的范圍，并證明了以前未被發(fā)現(xiàn)的乳酸化作用。

實(shí)驗(yàn)方法
EAU的誘導(dǎo)和治療，體外誘導(dǎo)TH1和TH17細(xì)胞，腺病毒感染和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，免疫熒光染色，HE染色，乳酸水平的定量，Real-time qPCR，WB，免疫沉淀，染色質(zhì)免疫共沉淀，熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)，Pan-Kla-based PTM富集，LC-MS/MS分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，CUT& Tag
參考文獻(xiàn)
Fan W, Wang X, Zeng S, Li N, Wang G, Li R, He S, Li W, Huang J, Li X, Liu J, Hou S. Global lactylome reveals lactylation-dependent mechanisms underlying TH17 differentiation in experimental autoimmune uveitis. Sci Adv. 2023 Oct 20;9(42): eadh4655. doi: 10.1126/sciadv.adh4655. Epub 2023 Oct 18. PMID: 37851814.