帕金森病還可以這樣治療？

       Prosaposin（PSAP）調(diào)節(jié)糖脂代謝，其變異與帕金森?。≒D）有關(guān)。本研究中，作者發(fā)現(xiàn)PD患者的血漿、腦脊液（CSF）和死后大腦中PSAP水平發(fā)生變化。血漿和CSF中PSAP水平的改變與PD相關(guān)的運(yùn)動(dòng)損傷有關(guān)。多巴胺PSAP缺陷（cPSAP^DAT）小鼠表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)能力低下和抑郁/焦慮樣癥狀，多巴胺能神經(jīng)傳遞輕度受損，而血清素PSAP缺乏（cPSAP^SERT）小鼠表現(xiàn)正常?？臻g脂質(zhì)組學(xué)顯示，在cPSAP^DAT小鼠整個(gè)大腦中，高度不飽和與變短的脂質(zhì)發(fā)生積累，且鞘脂減少。與WT小鼠相比，AAV引起的α-突觸核蛋白過表達(dá)導(dǎo)致cPSAP^DAT小鼠更嚴(yán)重的多巴胺能衰退和更高的p-Ser129 α-突觸蛋白水平。在野生型嚙齒類動(dòng)物中，AAV引起的PSAP過表達(dá)和包封細(xì)胞生物遞送（ECB）可有效保護(hù)其免受6-OHDA和α-突觸核蛋白毒性。該研究于2023年9月發(fā)表在《nature communications》，IF：16.6。
技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1. PD患者死后SNc 的DA神經(jīng)元中PSAP減少而非PGRN
       作者在人類SNc中的酪氨酸羥化酶（TH）和神經(jīng)松弛素陽(yáng)性神經(jīng)元中檢測(cè)到高水平PSAP（圖1A）。檢測(cè)PD患者和對(duì)照組SNc DA神經(jīng)元中PSAP和PGRN的水平，其免疫熒光染色顯示PSAP和PGRN共定位（圖1A）。與對(duì)照組相比，PD中單個(gè)TH陽(yáng)性神經(jīng)元PSAP減少，而PGRN沒有變化（圖1A-C）。
2. 循環(huán)PSAP與PD運(yùn)動(dòng)癥狀相關(guān)，而PGRN與非運(yùn)動(dòng)癥狀相關(guān)
       在PD患者和對(duì)照組CSF和血漿中測(cè)定循環(huán)PSAP和PGRN。CSF PSAP與血漿PSAP相關(guān)，PGRN沒有發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性（圖2D，E）。關(guān)于臨床癥狀和體征，CSF和血漿PSAP均與UPDRS-III運(yùn)動(dòng)癥狀評(píng)分呈正相關(guān)（圖1F，G）。然而，PSAP水平與BDI-II、MADR-S、HADS-D、HADS-A和MFS非運(yùn)動(dòng)癥狀評(píng)分無(wú)關(guān)（圖1H，I）。相反，CSF和血漿PGRN與UPDRS-III評(píng)分不相關(guān)（圖1J，K），但與上述非運(yùn)動(dòng)癥狀評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（圖1L，M），這些發(fā)現(xiàn)表明PSAP和PGRN在PD中受到了不同調(diào)節(jié)，且PSAP與PD基本運(yùn)動(dòng)特征有關(guān)。

圖1：PD患者PSAP和PGRN受到不同調(diào)節(jié)，并與不同PD癥狀相關(guān)

3. 多巴胺能PSAP缺陷小鼠表現(xiàn)多巴胺能標(biāo)記物水平降低、紋狀體突觸可塑性功能障礙和行為障礙，而5-羥色胺能PSAP缺乏小鼠表現(xiàn)正常
       為研究多巴胺能系統(tǒng)中的PSAP，作者產(chǎn)生了一種在DA神經(jīng)元中具有特異性可誘導(dǎo)PSAP基因缺失小鼠（cPSAP^DAT）。將三苯氧胺給藥5周齡小鼠，通過PSAP mRNA熒光原位雜交（FISH）分析證實(shí)整個(gè)SNc中DA神經(jīng)元中PSAP缺失（圖2A）。高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)變化。16月齡cPSAP^DAT小鼠的紋狀體、伏隔核和海馬體中，DA、高香草酸（HVA）和3-甲氧基酪胺（3-MT）顯著減少（圖2B）。通過密度測(cè)定分析，作者注意到cPSAP^DAT小鼠紋狀體中存在輕度和進(jìn)行性TH損失（圖2C，D）。為探討PSAP在血清素神經(jīng)元中的作用。作者將具有固定PSAP等位基因的純合子小鼠與表達(dá)Cre重組酶的雜合子小鼠雜交，產(chǎn)生血清素神經(jīng)元中PSAP基因缺失小鼠（cPSAP^SERT）。FISH證實(shí)cPSAP^SERT小鼠5-羥色胺神經(jīng)元中PSAP mRNA特異性缺失（圖2E）。與cPSAP^DAT小鼠相比，通過HPLC在cPSAP^SERT小鼠海馬體中未檢測(cè)到5-羥色胺（5-HT）和5-羥基吲哚乙酸（5-HIAA）的變化（圖2F，G）。PSAP可被細(xì)胞吸收，作者在兩種小鼠系中用免疫熒光染色檢測(cè)PSAP蛋白。它莫西芬處理后，2月齡cPSAP^DAT小鼠DA神經(jīng)元中PSAP顯著減少，但隨著時(shí)間的推移會(huì)發(fā)生積累（圖2H，I）。PGRN遵循類似的軌跡（圖2H，J）。對(duì)4月齡、8月齡和16月齡cPSAP^DAT小鼠進(jìn)行行為評(píng)估（圖2K）。在8月齡和16月齡cPSAP^DAT小鼠中觀察到在open field test（OFT）中的Hypolocomotion（圖2L）。4月齡cPSAP^DAT小鼠在pole test中（圖2M）和16月齡cPSAP^DAT小鼠在beam traversal test中（圖2N）發(fā)現(xiàn)姿勢(shì)控制和精細(xì)運(yùn)動(dòng)損傷。cPSAP^DAT小鼠焦慮增加（圖2O），由OFT中心區(qū)域時(shí)間（圖2O）以及l(fā)ight-dark test燈箱中距離和時(shí)間測(cè)量得出（圖2P，Q）。8月齡cPSAP^DAT小鼠在強(qiáng)迫游泳測(cè)試中也表現(xiàn)出抑郁狀態(tài)（圖2R）。相反，通過一系列行為測(cè)試評(píng)估8月齡cPSAP^SERT小鼠，沒有顯示異常（圖2S-W）。

圖2：cPSAP^DAT小鼠表現(xiàn)多巴胺能標(biāo)志物水平降低和行為缺陷，而cPSAP^SERT小鼠表現(xiàn)正常

4. 空間脂質(zhì)組學(xué)揭示cPSAP^DAT小鼠整個(gè)大腦中高度不飽和和縮短的脂質(zhì)積累以及鞘脂減少
       考慮到皂苷在鞘糖脂（GSL）代謝中的重要作用，作者使用了高通量雙極性MALDI-MSI方法。在cPSAP^DAT和對(duì)照小鼠大腦中進(jìn)行非靶向空間脂蛋白分析。他們發(fā)現(xiàn)，4月齡、8月齡和16月齡cPSAP^DAT小鼠與其對(duì)照組之間存在顯著差異，如PCA所示，如尾殼核、大腦皮層和其他幾個(gè)大腦區(qū)域紋狀體和SNc水平（圖3A）。所有已鑒定脂質(zhì)的火山圖，包括甘油脂質(zhì)和鞘脂，在4月齡、8月齡和16月齡cPSAP^DAT小鼠大腦區(qū)域中顯示出相似的改變模式（圖3B）。 進(jìn)一步分析16 月齡小鼠尾殼核中的甘油酯變化（圖3C）。選擇心磷脂（CL）和磷脂酰膽堿（PC）進(jìn)行分析。通過根據(jù)CLs的雙鍵和鏈長(zhǎng)對(duì)其進(jìn)行分類，在cPSAP^DAT小鼠大腦中捕捉到兩種模式：（i）高度不飽和CLs增加與低不飽和CL減少相一致，以及（ii）長(zhǎng)鏈CLs減少與短鏈CLs增加相一致（圖4D-G）。第一種模式表明脂肪酸過度去飽和，而第二種模式表明過氧化物酶體β-氧化過度活躍。cPSAP^DAT小鼠大腦中鞘脂減少（圖3H）。源自神經(jīng)酰胺棕櫚酸前體的棕櫚酰肉堿被還原（圖3I）。磷酸鞘脂，神經(jīng)酰胺的磷酸化衍生物，包括神經(jīng)酰胺-1-磷酸（CerP）、鞘磷脂（SM）和SM的Na+/K+加合物，也被還原（圖3I）。同樣，GM1、GM2和GM3（圖3I）通常減少。
5. 空間脂質(zhì)組學(xué)揭示了cPSAP^SERT小鼠腦中縫背核神經(jīng)節(jié)苷脂的有限積累和色氨酸代謝的增加
       與cPSAP^DAT小鼠相比，cPSAP^SERT小鼠表現(xiàn)出明顯的行為異常和神經(jīng)遞質(zhì)改變?nèi)狈?，作者檢測(cè)了脂質(zhì)變化是否會(huì)顯示出相應(yīng)的細(xì)胞類型特異性差異。作者進(jìn)行非校正多重t檢驗(yàn)，以檢查DRN中的脂質(zhì)變化（圖3J）。與cPSAP^DAT小鼠相比，cPSAP^SERT小鼠DRN中GSL普遍增加，包括GM1，GM2和GM3（圖 3K， L）。色氨酸、5-HT和5-HIAL在cPSAP^SERT小鼠中縫背核（DRN）中顯著上調(diào)，表明色氨酸代謝增加（圖3M，N）。

圖3：cPSAP^DAT小鼠顯示高度不飽和和縮短的脂質(zhì)增加以及整個(gè)大腦鞘脂減少，而cPSAP^SERT小鼠表現(xiàn)出神經(jīng)節(jié)苷脂有限積累和背側(cè)裂核中色氨酸代謝增加

6. cPSAP^DAT小鼠對(duì)α-syn誘導(dǎo)的多巴胺能變性表現(xiàn)出更高的易感性，而病毒過表達(dá)的PSAP保護(hù)小鼠免受α-syn毒性
       4月齡cPSAP^DAT和WT對(duì)照小鼠接受帶有或不帶有AAV-PSAP的AAV-α-syn或AAV-GFP的單側(cè)立體定向鼻內(nèi)注射。為評(píng)估α-syn介導(dǎo)的DA損失引起的紋狀體DA受體敏感化，在手術(shù)后6周、10周和14周進(jìn)行Apomorphine旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)（圖4A）。對(duì)側(cè)凈旋轉(zhuǎn)的重復(fù)測(cè)量（RM）雙向ANOVA顯示，當(dāng)注射AAV-α-syn但不注射AAV-GFP時(shí)，cPSAP^DAT小鼠比WT小鼠情況更加惡化（圖4B）。注射AAV-PSAP補(bǔ)充的PSAP阻止了AAV-α-syn對(duì)cPSAP^DAT小鼠旋轉(zhuǎn)行為的惡化作用（圖4B）。死后小鼠大腦的免疫熒光和免疫組織化學(xué)染色證實(shí)紋狀體和黑質(zhì)中α-syn和GFP強(qiáng)烈過表達(dá)（圖4C，E）。免疫熒光染色顯示，AAV-α-syn降低TH陽(yáng)性神經(jīng)元中的PSAP（圖4C，D），而AAV-GFP沒有。免疫組織化學(xué)染色密度分析顯示，在兩種基因型中，AAV-α-syn降低同側(cè)紋狀體TH，但AAV-GFP沒有降低（圖4E，F(xiàn)）。然而，與WT小鼠相比，AAV-α-syn在cPSAP^DAT小鼠中引起更顯著的紋狀體和黑質(zhì)TH損失（圖4E，F(xiàn)）。此外，與行為數(shù)據(jù)一致的是，通過比較AAV-α-syn注射與AAV-β-syn+AAV-PSAP注射cPSAP^DAT小鼠，揭示了AAV-PSAP過表達(dá)使紋狀體和黑質(zhì)TH顯著恢復(fù)（圖4E，F(xiàn)）。DAT不僅表現(xiàn)出與TH相似的恢復(fù)性變化，而且在AAV-α-syn注射的WT小鼠中通過AAV-PSAP過表達(dá)而正常化（圖4E，F(xiàn)）。磷酸化的α-syn Ser129（p-Ser129α-syn）被認(rèn)為是α-syn的病理形式。為研究PSAP是否影響α-syn過表達(dá)小鼠大腦中p-Ser129α-syn水平，作者對(duì)小鼠大腦切片中的p-Ser129 a-syn進(jìn)行染色。AAV-α-syn過表達(dá)導(dǎo)致WT小鼠中p-Ser129α-syn輕度積累，但不能被AAV-PSAP過表達(dá)逆轉(zhuǎn)（圖4G）。而在cPSAP^DAT小鼠大腦中，p-Ser129α-syn積累顯著增加，并通過AAV-PSAP過表達(dá)逆轉(zhuǎn)至與WT小鼠相似水平（圖4G）。僅考慮面積大于0.64μm²的p-Ser129α-syn積累，就獲得了類似結(jié)果（圖4H）。        

  
圖4：cPSAP^DAT小鼠更易受到AAV-α-突觸核蛋白誘導(dǎo)的毒性，而AAV-PSAP經(jīng)鼻注射可通過降低p-Ser129α-syn水平來(lái)抵消毒性

7. PSAP病毒過表達(dá)保護(hù)小鼠免受6-OHDA誘導(dǎo)的多巴胺能變性
       PSAP已被確定為iPSC衍生的人類神經(jīng)元中氧化應(yīng)激的易感基因。作者研究PSAP病毒過表達(dá)是否可以保護(hù)DA神經(jīng)元免受6-OHDA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。在6-OHDA紋狀體部分病變前6周，WT小鼠在同側(cè)SNc中注射AAV-PSAP或AAV-GFP，然后在病變后兩周進(jìn)行Apomorphine旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)，以監(jiān)測(cè)PSAP的保護(hù)作用（圖5A）。AAV-PSAP注射小鼠向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)明顯小于AAV-GFP注射小鼠，表明PSAP過表達(dá)對(duì)6-OHDA病變的紋狀體多巴胺支配受到保護(hù)（圖5B）。免疫熒光染色證實(shí)GFP或PSAP在小鼠中的過表達(dá)，并揭示SNc中部分保存的DA神經(jīng)元（圖5C）。免疫組織化學(xué)染色密度測(cè)定分析顯示，在AAV-GFP注射小鼠中，6-OHDA顯著降低紋狀體和黑質(zhì)TH和紋狀體DAT免疫反應(yīng)性，在AAV-PSAP注射小鼠中受到部分保護(hù)（圖5D，E）。

圖5：PSAP病毒過表達(dá)保護(hù)小鼠免受6-OHDA誘導(dǎo)的多巴胺能變性

8. ECB中的PSAP在紋狀體中保護(hù)大鼠免受α-syn誘導(dǎo)的多巴胺能損失
       由于PSAP和PGRN是分泌蛋白，并且兩者都被cPSAP^DAT小鼠DA神經(jīng)元吸收，作者推斷PSAP細(xì)胞外遞送可能抵消α-syn誘導(dǎo)的毒性。ECB提供了一種有效且可逆的方法，通過移植ECB裝置將治療劑遞送到腦實(shí)質(zhì)目標(biāo)區(qū)域。使用這種技術(shù)，作者單方面將PSAP遞送到在同一半球SNc中注射AAV-α-syn的大鼠紋狀體（圖6A）。在同時(shí)進(jìn)行腦內(nèi) AAV-α-syn 注射和紋狀體 ECB 裝置植入的立體定位手術(shù)后，在第 2 周、第 8 周和第 12 周的OFT中評(píng)估運(yùn)動(dòng)行為，然后在第 12 周進(jìn)行Apomorphine旋轉(zhuǎn)測(cè)試（圖 6B）。在OFT中RM雙向ANOVA距離分析顯示，沒有裝置的大鼠被AAV-α-syn誘導(dǎo)進(jìn)行性低運(yùn)動(dòng)，而對(duì)照ECB或ECB-PGRN大鼠在8周時(shí)表現(xiàn)出低運(yùn)動(dòng)。相反，ECB-PSAP或ECB-PSAP-PGRN大鼠表現(xiàn)出完整運(yùn)動(dòng)（圖6C，D）。時(shí)間×ECB-PSAP和時(shí)間×ECB-PSAP-PGRN的顯著互作表明，PSAP和PSAP-PGRN復(fù)合物補(bǔ)充保護(hù)大鼠免受α-syn誘導(dǎo)的低運(yùn)動(dòng)（圖6C，D）。在Apomorphine旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)中，與未使用裝置的大鼠和ECB-PGRN大鼠相比，使用ECB-PSAP的大鼠向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)明顯較少，這為PSAP對(duì)α-syn誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)障礙的保護(hù)作用提供進(jìn)一步的證據(jù)（圖6E）。死后免疫組織化學(xué)染色驗(yàn)證紋狀體和黑質(zhì)中α-syn過表達(dá)（圖6F）。為檢測(cè)α-syn誘導(dǎo)對(duì)多巴胺能標(biāo)志物的影響，TH，DAT和囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2（VMAT2）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。根據(jù)RPE細(xì)胞分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和左旋多巴，對(duì)照ECB裝置和其他裝置顯著抵消紋狀體TH的損失。然而，與沒有ECB的大鼠和具有對(duì)照ECB的大鼠相比，ECB-PSAP和ECB-PSAP-PGRN裝置對(duì)DAT水平也顯示出保護(hù)作用（圖6F，G）。此外，與沒有ECB的大鼠相比，具有ECB-PSAP的大鼠顯示出保守的VMAT2（圖6F，H）。

圖6：PSAP的ECB可防止AAV-α-突觸核蛋白誘導(dǎo)的大鼠帕金森綜合征

結(jié)論
       這些實(shí)驗(yàn)表明，帕金森病患者PSAP水平發(fā)生改變，反映了運(yùn)動(dòng)癥狀。對(duì)DA神經(jīng)元PSAP缺失的研究揭示PSAP在DA神經(jīng)元生理穩(wěn)態(tài)中的作用，尤其是在脂質(zhì)代謝中。DA神經(jīng)元中PSAP缺失增加小鼠對(duì)α-syn過表達(dá)的易感性。值得注意的是，經(jīng)鼻注射AAV-PSAP可以挽救α-syn誘導(dǎo)的帕金森病。同樣，AAV-PSAP對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和DA神經(jīng)毒性具有保護(hù)作用。此外，紋狀體ECB-PSAP植入在治療α-syn誘導(dǎo)的帕金森病方面顯示出治療效果。因此，PSAP是PD發(fā)病機(jī)制的潛在調(diào)節(jié)劑，其補(bǔ)充可能有利于阻止PD進(jìn)展。

實(shí)驗(yàn)方法
免疫熒光，ELISA，流式細(xì)胞術(shù)，Open field test，Light-dark transition tes，Pole test，F(xiàn)orced swim test，Accelerating rotarod test，Beam traversal test，Apomorphine-induced rotation，細(xì)胞培養(yǎng)，siRNA轉(zhuǎn)染，WB，F(xiàn)ISH，HPLC，MALDI-MSI
參考文獻(xiàn)
He Y, Kaya I, Shariatgorji R, Lundkvist J, Wahlberg LU, Nilsson A, Mamula D, Kehr J, Zareba-Paslawska J, Biverst?l H, Chergui K, Zhang X, Andren PE, Svenningsson P. Prosaposin maintains lipid homeostasis in dopamine neurons and counteracts experimental parkinsonism in rodents. Nat Commun. 2023 Sep 19;14(1):5804. doi: 10.1038/s41467-023-41539-5. PMID: 37726325; PMCID: PMC10509278.