新型TCF21high周細(xì)胞亞群通過重塑血管周圍基質(zhì)促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移

       血源性播散是結(jié)直腸癌（CRC）轉(zhuǎn)移的常見途徑。然而，作為血管的守門人，腫瘤周細(xì)胞（TPCs）在血源性轉(zhuǎn)移中的作用在很大程度上仍然未知。本文旨在研究TPCs的異質(zhì)性及其對(duì)CRC轉(zhuǎn)移的影響。通過scRNA-seq鑒定21個(gè)TPC亞群。TCF的新子集TCF21^high TPCs，稱為“基質(zhì)-周細(xì)胞”，與結(jié)直腸癌患者的肝轉(zhuǎn)移有關(guān)。TPCs中的TCF21增加血管周圍ECM硬度，膠原重排和基底膜降解，建立血管周圍轉(zhuǎn)移微環(huán)境，從而引發(fā)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（CRCLM）。TPCs中的Tcf21耗竭減輕血管周圍ECM重塑和CRCLM，而TCF21^high TPCs和CRC細(xì)胞的共注射顯著促進(jìn)CRCLM。在機(jī)制上，整合素α5的缺失抑制FAK/PI3K/AKT/DNMT1軸以損害TCF21^high TPCs中的TCF21 DNA高甲基化。本研究揭示TPC在血源性轉(zhuǎn)移中以前未確定的作用，并為CRC轉(zhuǎn)移提供潛在的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。本文于2023年4月發(fā)表在《Gut.》IF:24.5期刊上。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的不同TPCs亞群的鑒定

       為剖析TPCs的異質(zhì)性并評(píng)估其對(duì)CRC轉(zhuǎn)移的貢獻(xiàn)，從具有或不具有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者的原發(fā)性腫瘤組織中分離TPCs，并使用10×chromium平臺(tái)通過scRNA-seq進(jìn)行分析。從50000個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，其在t-隨機(jī)相鄰嵌入（t-SNE）空間中并置以鑒定不同的簇（圖1A）。TPC的基因表達(dá)譜被分類為13個(gè)不同的簇（圖1B），并且使用已知的周細(xì)胞標(biāo)記確定它們的起源。前10個(gè)簇特異性基因示于圖1C中。簇2中的細(xì)胞比例在具有（18.5%）和不具有（3.4%）肝轉(zhuǎn)移的CRC患者之間的所有亞組中顯示最大差異（圖1D），表明該亞組與CRCLM相關(guān)?；虮倔w（GO）富集分析表明，來自具有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者的樣品中上調(diào)的基因與與ECM相關(guān)的幾個(gè)GO術(shù)語(yǔ)相關(guān)（圖1E），包括MATN2、CHI3L1、C0L3A1、C0L1A2、CILP、MMP2、MFAP4、FBLN1和FBLN2（圖1F）。因此，將簇2中的細(xì)胞定義為基質(zhì)-周細(xì)胞。選擇僅在簇2中富集的基因之一MATN2作為基質(zhì)周細(xì)胞的生物標(biāo)志物，MATN2編碼蛋白質(zhì)matrilin-2（MATN2）。MATN2⁺ TPC的比率在來源于具有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者的腫瘤切片中比在沒有肝轉(zhuǎn)移的那些中更高（圖1G）。此外，受試者工作特征（ROC）曲線分析顯示，以高靈敏度和特異性預(yù)測(cè)CRCLM的MATN2⁺ TPCs的最佳截止百分比為30%（圖1H）。Kaplan-Meier生存分析顯示，在具有高（>30%）比例的MATN2⁺ TPCs的患者中，總生存期（OS）（圖1I）和無(wú)疾病生存期（DFS）（圖1J）較短。此外，MATN2⁺ TPC比值與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析顯示，MATN2⁺ TPC比值與結(jié)直腸癌患者的TNM分期和肝轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明基質(zhì)周細(xì)胞與CRC轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。

圖1 來自CRC患者的TPC中基質(zhì)周細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征

2、TPCs中的TCF21與CRC轉(zhuǎn)移有關(guān)

       使用單細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推理和聚類（SCENIC）管道鑒定基質(zhì)-周細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，該管道將順式調(diào)控序列信息與scRNA-seq數(shù)據(jù)連接起來。SCENIC分析表明，TCF21的調(diào)節(jié)子活性在基質(zhì)-周細(xì)胞中最高（圖2A），這在所有細(xì)胞的t-SNE空間中得到證實(shí)（圖2B）。此外，TCF21^high TPCs的數(shù)量與無(wú)肝轉(zhuǎn)移的患者相比，在有肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者樣本中顯著增加（圖2C）。此外，肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者腫瘤切片中TCF21⁺ TPCs的比例增加（圖2D）。然而，在CRC患者肝轉(zhuǎn)移性腫瘤的TPCs中檢測(cè)不到TCF21。Pearson相關(guān)系數(shù)分析表明TCF21⁺ TPCs與MATN2⁺基質(zhì)-周細(xì)胞的比例呈正相關(guān)（r=0.805，P<0.001；圖2E）。這些數(shù)據(jù)表明TCF21⁺ TPCs與基質(zhì)-周細(xì)胞密切相關(guān)。ROC曲線分析顯示，用于預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者肝轉(zhuǎn)移的TCF21⁺ TPCs最佳百分比為44%（圖2F）。Kaplan-Meier生存分析表明，TCF21⁺ TPCs比率較高（>44%）的患者的OS（圖2G）和DFS（圖2H）明顯較短。此外，TCF21⁺ TPCs比值與結(jié)直腸癌患者的TNM分期和肝轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明，TPCs中的TCF21可以作為CRC轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。

圖2 基質(zhì)周細(xì)胞中的TCF21與CRC的肝轉(zhuǎn)移正相關(guān)

3、TCF21在TPCs中參與基質(zhì)-周細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變和血管周圍ECM的重塑

       TPCs中的TFC21上調(diào)與CRCLM呈正相關(guān)，表明TCF21可能參與TPCs的活化，并可能促進(jìn)基質(zhì)-周細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變。TPCs中TCF21的耗竭或過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖，粘附和遷移的影響可以忽略不計(jì)。基質(zhì)-周細(xì)胞中9個(gè)基因的水平，包括IGFBP5，CILP，MFAP4，c11orf96，A2M，SFRP2，MAF，PTGDS和MATN2，相比TPC _NM ^Vector，在TPC_NM ^TCF21中顯著升高（圖3A）。相反，這些基因在轉(zhuǎn)染siTCF21的TPC_LM（TPC_LM ^siTCF21）中的水平比那些轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA（TPC_LM ^siNC）顯著降低。此外，MATN2⁺基質(zhì)周細(xì)胞的百分比通過TPC_NM中TCF21的過表達(dá)而增加，并且通過TPC_LM中TCF21的敲低而降低（圖3B）。

       RNA-seq和ChIP-seq結(jié)果的GO富集分析表明，TCF21調(diào)控的基因與“ECM組織”和“ECM”類別相關(guān)（圖3C，D），與基質(zhì)-周細(xì)胞中的表達(dá)譜相似。此外，通過ChIP-seq分析檢測(cè)到的TCF21峰，通過RNA-seq檢測(cè)到的TCF21誘導(dǎo)基因和通過scRNA-seq檢測(cè)到的基質(zhì)-周細(xì)胞基因的比較確定139個(gè)重疊基因（圖3E）。對(duì)這些重疊基因的GO分析顯示它們與“含膠原蛋白的ECM”和ECM類別相關(guān)聯(lián)（圖3F）。這些結(jié)果通過RT-qPCR和ChIP-qPCR得到證實(shí)，并且在TCF21過表達(dá)TPC_NM中TCF21與基質(zhì)-周細(xì)胞特異性基因啟動(dòng)子的結(jié)合顯著上調(diào)（圖3G，H），通過蛋白質(zhì)印跡證實(shí)（圖3I）。這些結(jié)果表明，TCF21對(duì)于基質(zhì)-周細(xì)胞的產(chǎn)生至關(guān)重要。

       ECM重塑對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，表現(xiàn)為異常的膠原蛋白產(chǎn)生和交聯(lián)導(dǎo)致組織僵硬，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。此外，蛋白酶（如基質(zhì)金屬蛋白酶）對(duì)血管基底膜的降解有助于腫瘤細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤部位逃逸。作者提出TCF21可能在血管周圍ECM重塑和CRC轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。TCF21在TPCs中的過表達(dá)或敲低均未改變體外腫瘤細(xì)胞增殖，遷移，EMT或內(nèi)皮細(xì)胞管形成。原子力顯微鏡（AFM）顯示TPC_NM ^TCF21在誘導(dǎo)膠原蛋白的局部排列、卷曲和片狀膠原蛋白纖維重組成放射狀和成束結(jié)構(gòu)以及增加粗糙度方面具有比TPC_NM ^Vector更大的能力（圖3J）。此外，TPC_NM ^TCF21在硬化膠原蛋白的機(jī)械性能（圖3K）和增加膠原蛋白收縮（圖3L）方面優(yōu)于TPC_NM ^Vector，從而增強(qiáng)ECM硬度。為進(jìn)一步評(píng)估TCF21介導(dǎo)的血管周圍ECM重塑對(duì)CRC細(xì)胞迀移的影響，將與TPC_NM ^Vector、TPC_NM ^TCF21、TPC_LM ^siNC或TPC_LM ^siTCF21混合的PKH- 67標(biāo)記的HCT116或DLD-1細(xì)胞接種到基質(zhì)膠中。TPC_NM ^TCF21在促進(jìn)CRC細(xì)胞通過Matrigel包被的transwell膜侵襲方面優(yōu)于TPC_NM ^Vector（圖3M），而TPC_LM ^siTCF21與TPC_LM ^siNC相比，降低CRC細(xì)胞的侵襲。在器官典型培養(yǎng)系統(tǒng)上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，與TPC_NM ^Vector相比，當(dāng)由膠原蛋白I和基質(zhì)膠組成的基質(zhì)與TPC_NM ^TCF21預(yù)混合時(shí)，侵入的HCT 116細(xì)胞的數(shù)量顯著增加（圖3N）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明基質(zhì)-周細(xì)胞中的TCF21誘導(dǎo)血管周圍ECM重塑并促進(jìn)CRC細(xì)胞通過血管周圍基質(zhì)侵襲。

       作者進(jìn)一步研究MATN2是否具有與TCF21相似的促轉(zhuǎn)移作用。鑒于TCF21^high TPCs通過ECM重塑促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，在過表達(dá)或敲低MATN2的TPC中通過RT-qPCR檢查編碼ECM蛋白的基因水平，例如COL1A2，COL3A1，MMP2，CHI3L1和FBLN1。結(jié)果表明，TPCs中的MATN2對(duì)這些ECM相關(guān)基因水平的影響可以忽略不計(jì)。此外，TPCs中的MATN2對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲的影響可以忽略不計(jì)。這些數(shù)據(jù)表明，MATN2⁺ TPCs不能為腫瘤細(xì)胞提供類似于TCF21^high TPCs的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移表型，可能僅作為基質(zhì)-周細(xì)胞的特征標(biāo)記物。

圖3 TCF21對(duì)于基質(zhì)周細(xì)胞的形成至關(guān)重要，并通過ECM重塑促進(jìn)CRC細(xì)胞侵襲。

4、敲除TPCs中的Tcf21抑制CRC轉(zhuǎn)移

       為確定TPCs中的TCF21是否對(duì)體內(nèi)CRC轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，產(chǎn)生周細(xì)胞譜系追蹤小鼠（PC^lin）和他莫昔芬誘導(dǎo)型Cspg4驅(qū)動(dòng)的周細(xì)胞特異性Tcf21敲除小鼠（PC^lin-KO）（圖4A）。向PC^lin和PC^lin-KO小鼠施用他莫昔芬導(dǎo)致用tdT熒光標(biāo)記周細(xì)胞，以及PC^lin-KO小鼠中Tcf21的敲除。在體內(nèi)，Tcf21的TPC特異性缺失顯著抑制肝轉(zhuǎn)移的形成（圖4B）。與PC^lin小鼠相比，PC^lin-KO小鼠中肝轉(zhuǎn)移灶的面積和數(shù)量顯著減少（圖4C）。此外，PC^lin-KO小鼠中EpCAM⁺ CD45^? CTCs的數(shù)量顯著低于PC^lin小鼠（圖4D）。這些數(shù)據(jù)表明TPCs中的TCF21促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移，獨(dú)立于腫瘤生長(zhǎng)和EMT。

       通過評(píng)估周細(xì)胞覆蓋率和腫瘤血管中MATN2⁺基質(zhì)周細(xì)胞的百分比，進(jìn)一步評(píng)價(jià)TPCs中TCF21對(duì)血管結(jié)構(gòu)和功能的影響。免疫熒光染色顯示，TPCs中Tcf21的缺失對(duì)總周細(xì)胞覆蓋率具有可忽略的影響，而MC38-luc-LM3CRCLM異種移植物的原發(fā)性腫瘤組織中MATN2⁺基質(zhì)周細(xì)胞的數(shù)量在PC^lin-KO小鼠中比在PC^lin小鼠中更低（圖4E）。此外，來自PC^lin小鼠的TPC中ECM重塑相關(guān)蛋白（包括MMP2、C0L1A2、C0L3A1和CHI3L1）的表達(dá)顯著高于來自PC^lin-KO小鼠（圖4F）。Masson染色顯示，與PC^lin小鼠相比，來自PC^lin-KO小鼠的腫瘤切片中纖維狀膠原組分的密度顯著降低（圖4G）。透射電子顯微鏡分析表明，在血管周圍區(qū)域的膠原束在來自PC^lin-KO的腫瘤切片中比在來自PC^lin小鼠的那些中更薄（圖4H）。組織硬度和腫瘤細(xì)胞的局部侵襲性需要膠原沉積，膠原取向的變化也有助于腫瘤轉(zhuǎn)移。通過二次諧波產(chǎn)生和雙光子激發(fā)熒光進(jìn)一步檢查血管周圍膠原的結(jié)構(gòu)。PC^lin-KO小鼠的血管周圍膠原纖維不規(guī)則地排列在腫瘤血管周圍，有卷曲的和不固定的輪廓，而PC^lin小鼠中的血管周圍膠原蛋白具有幾乎平行的取向，并且緊密地包圍在腫瘤血管周圍（圖4I）。通過AFM測(cè)定血管周圍區(qū)域的硬度，并用楊氏模量模式分析，并且作者發(fā)現(xiàn)PC^lin-KO小鼠中的血管周圍區(qū)域比PC^lin小鼠中的血管周圍區(qū)域顯著更軟（圖4J、K）。由于基底膜充當(dāng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)滲的物理屏障，基底膜的降解可削弱其屏障功能并增加血管通透性。結(jié)果顯示，層粘連蛋白（血管基底膜中最豐富的組分）的表達(dá)在PC^lin-KO小鼠中顯著高于PC^lin小鼠（圖4L），并且與PC^lin小鼠相比，TPCs中Tcf21的缺失導(dǎo)致PC^lin-KO小鼠的血管通透性降低（圖4M）?？傊?，基質(zhì)-周細(xì)胞中的TCF21可能是血管周圍ECM重塑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其建立促進(jìn)CRC細(xì)胞內(nèi)滲的PMM。

圖4 Tcf21的周細(xì)胞特異性敲除抑制血管周ECM的重塑和CRC轉(zhuǎn)移

5、整合素α5缺失降低TCF21啟動(dòng)子甲基化并增加TCF21在TPC中的表達(dá)

       整合素，ECM組分的關(guān)鍵受體，作為機(jī)械換能器起作用以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果顯示，在13個(gè)TPCs簇中，ITGA2、ITGA5和ITGB1在基質(zhì)周細(xì)胞中顯著減少（圖5A）。功能獲得和功能喪失實(shí)驗(yàn)表明，TCF21在mRNA和蛋白質(zhì)水平均受到整合素α5的負(fù)調(diào)控（圖5B）。

       TCF21 DNA的超甲基化抑制各種類型的腫瘤細(xì)胞中的TCF21表達(dá)，包括非小細(xì)胞肺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和CRC。對(duì)TPCs中TCF21啟動(dòng)子內(nèi)CpG島的甲基化的評(píng)估顯示，TPCs中TCF21表達(dá)與其甲基化狀態(tài)負(fù)相關(guān)。此外，整合素α5正調(diào)節(jié)TCF21 DNA超甲基化，并且TPCs中整合素α5的缺失減弱TPCs中TCF21啟動(dòng)子的DNA超甲基化（圖5C）。

       據(jù)報(bào)道，DNMT1可調(diào)節(jié)肺癌中TCF21的DNA超甲基化。研究結(jié)果表明，整合素α5的缺失通過抑制FAK/PI3K/AKT軸降低TPC_NM中DNMT1的表達(dá)，而TPC_LM中整合素α5的過表達(dá)產(chǎn)生相反的作用，這可以被FAK抑制劑Y15逆轉(zhuǎn)（圖5D）。此外，Y15或DNMT抑制劑SGI1027降低DNMT1的表達(dá)并抑制TCF21的DNA超甲基化（圖5E），隨后TPC_LM ^ITGA5中TCF21的表達(dá)增加（圖5D）。這些結(jié)果表明，整合素α5的缺失通過抑制TCF21的DNA超甲基化來上調(diào)TPC中的TCF21。

       在原位異種移植模型中研究TPCs中整合素α5對(duì)體內(nèi)CRC轉(zhuǎn)移的影響，所述原位異種移植模型通過共注射HCT116-luc-LM3或DLD1-luc-LM3細(xì)胞和整合素α5-過表達(dá)或α5-敲低的TPCs產(chǎn)生（圖5F）。與TPC_NM ^shNC相比，TPC_NM ^shITGA5增加腫瘤組織血管周圍區(qū)域的膠原密度（圖5G），促進(jìn)血管周圍基底膜降解，并顯著增加肝臟中轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和面積（圖5H）。相反地，腫瘤細(xì)胞和TPC_LM ^ITGA5的共同注射顯示出與使用TPC_LM^Vector的那些相比相反的效果（圖5G、H）。這些數(shù)據(jù)表明，TPC中整合素α5的缺失促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移。

圖5 整合素α5缺失抑制TCF21啟動(dòng)子的高甲基化并上調(diào)TCF21在TPC中的表達(dá)

6、TCF21^high基質(zhì)周細(xì)胞與結(jié)直腸癌患者血管周圍ECM重塑和肝轉(zhuǎn)移相關(guān)

       為確定上述發(fā)現(xiàn)是否適用于CRC患者，在有和沒有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者中評(píng)估血管周圍膠原沉積和排列。與沒有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者相比，在具有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者中，血管周圍膠原蛋白豐度和血管周圍膠原蛋白纖維重新定向成徑向排列更顯著（圖6A、B）。此外，與沒有肝轉(zhuǎn)移的那些相比，在來自具有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者的腫瘤組織中，血管周圍區(qū)域的硬度顯著增強(qiáng)（圖6C、D）。此外，在來自具有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者的TPC中，COL1A2、COL3A1和CHI3L1（圖6E）以及參與基底膜降解的關(guān)鍵蛋白酶MMP2（圖6F）的表達(dá)高于來自具有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者的TPCs。相應(yīng)地，整合素α5的表達(dá)在來自具有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者的TPCs中比在沒有肝轉(zhuǎn)移的那些中更低（圖6G）。Pearson相關(guān)分析表明，TPCs中MMP2、C0L1A2、C0L3A1和CHI3L1的水平呈正相關(guān)，而TPCs中整合素α5的水平與TCF21^high TPCs的比率呈負(fù)相關(guān)（圖6E-G）。這些臨床數(shù)據(jù)表明，整合素α5缺失誘導(dǎo)的TCF21上調(diào)是血管周圍ECM重塑和PMM建立的重要調(diào)節(jié)因子，從而促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移。

圖6 基質(zhì)周細(xì)胞中的TCF21與源自CRC患者的原發(fā)性腫瘤中血管周圍ECM的重塑相關(guān)。

       總之，本研究使用scRNA-seq揭示CRC患者中TPCs的異質(zhì)性，并鑒定與CRCLM相關(guān)的TCF21^high TPCs的新亞群。這些發(fā)現(xiàn)揭示TCF21^high TPCs在構(gòu)建PMM中的作用和機(jī)制，通過重塑血管周圍ECM促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移，并提供潛在的血源性轉(zhuǎn)移的診斷標(biāo)志物。

實(shí)驗(yàn)方法

scRNA-seq，流式細(xì)胞術(shù)，血管通透性測(cè)定，染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）和ChIP-Seq，RT-qPCR assay，細(xì)胞轉(zhuǎn)染，免疫印跡實(shí)驗(yàn)，免疫熒光分析，H&E染色、免疫組織化學(xué)和Masson染色，RNA測(cè)序分析，遷移和侵襲測(cè)定，膠原凝膠收縮試驗(yàn)，細(xì)胞增殖測(cè)定，粘附試驗(yàn)，管形成分析，透射電鏡分析，二次諧波產(chǎn)生和雙光子激發(fā)熒光（SHG/TPEF），原子力顯微鏡（AFM）測(cè)量，DNA提取和亞硫酸氫鹽測(cè)序

參考文獻(xiàn)

Li X, Pan J, Liu T, et al. Novel TCF21high pericyte subpopulation promotes colorectal cancer metastasis by remodelling perivascular matrix. Gut. 2023;72（4）:710-721. doi:10.1136/gutjnl-2022-327913