生理代謝物α-酮戊二酸通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體自噬和氧化應(yīng)激來(lái)改善骨關(guān)節(jié)炎

       骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種與年齡相關(guān)的代謝性疾病。低度炎癥和氧化應(yīng)激是OA最后的常見(jiàn)途徑。α-酮戊二酸（α-KG）是線粒體三羧酸（TCA）循環(huán)中必需的生理代謝產(chǎn)物，具有抗炎和抗氧化等多種功能，并且隨著年齡的增長(zhǎng)，血清水平會(huì)降低。本研究旨在探討α-KG對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的治療作用及其機(jī)制。作者首次定量檢測(cè)了α-KG在IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨組織和骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平。此外，對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞用不同濃度的α-KG進(jìn)行處理。分析軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解以及炎癥介質(zhì)。用核糖核酸測(cè)序的方法探討α-KG的作用機(jī)制，并進(jìn)一步檢測(cè)吞噬作用和氧化應(yīng)激水平。這些結(jié)果在前交叉韌帶切斷（ACLT）誘導(dǎo)的年齡相關(guān)性骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型中得到了驗(yàn)證。作者發(fā)現(xiàn)損傷的內(nèi)側(cè)軟骨α-KG含量比正常外側(cè)軟骨減少了31.32%，IL-1β誘導(dǎo)的人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞比對(duì)照組減少了36.85%。α-KG可逆轉(zhuǎn)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡，增加ACAN和COL2A1的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，但抑制MMP13、ADAMTS5、IL-6和TNF-α的表達(dá)。在機(jī)制上，α-KG促進(jìn)有絲分裂，抑制ROS的產(chǎn)生，這種作用可被Mdivi-1（有絲分裂抑制物）所阻斷。總體而言，α-KG在人骨關(guān)節(jié)炎軟骨和IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的含量減少。此外，補(bǔ)充α-KG可通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體自噬和氧化應(yīng)激來(lái)減輕骨關(guān)節(jié)炎的表型，提示其有可能成為改善骨關(guān)節(jié)炎的治療靶點(diǎn)。本文于2023年6月發(fā)表于期刊《Redox Biology》，IF=11.4

主要技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1、人骨關(guān)節(jié)炎軟骨中α-KG含量及IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響

       α-KG是戊二酸的酮基衍生物之一（圖1A），戊二酸來(lái)自異檸檬酸，在生理上產(chǎn)生丁二酰輔酶A（圖1B）。因此，作者首先檢測(cè)了α-KG在IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨組織和軟骨細(xì)胞中的含量（圖1C）。結(jié)果表明，損傷內(nèi)側(cè)軟骨α-KG含量較正常外側(cè)軟骨降低31.32%（P<0.0821，圖1D），人軟骨細(xì)胞經(jīng)IL-1β處理24 h后含量下降36.85%，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0821，圖1E）。然后，檢測(cè)α-KG對(duì)原代人軟骨細(xì)胞的影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)α-KG濃度小于2 mM或作用時(shí)間小于72h時(shí)，對(duì)軟骨細(xì)胞活力無(wú)明顯影響（P<0.05，圖1F，G）。因此，作者觀察了2 mM α-KG作用24 h對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響。EDU結(jié)果顯示，IL-1β可抑制原代培養(yǎng)的人軟骨細(xì)胞的增殖，而α-KG可逆轉(zhuǎn)這一作用（圖1H和I）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，IL-1β可促進(jìn)原代培養(yǎng)的人軟骨細(xì)胞的凋亡，α-KG也可在一定程度上減輕這一作用（圖1J和K）。

圖1 α-KG含量及其對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2、α-KG對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞骨性關(guān)節(jié)炎表型的影響

       除軟骨細(xì)胞外，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是軟骨組織的另一個(gè)主要成分。因此，采用RT-qPCR方法檢測(cè)基質(zhì)合成相關(guān)基因（ACAN和COL2A1）和降解相關(guān)基因（MMP13和ADAMTS5）在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。結(jié)果表明，α-KG以濃度依賴的方式促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞ACAN和COL2A1 mRNA的表達(dá)，抑制MMP13和ADAMTS5的表達(dá)（P<0.05，P<0.01，圖2A-D）。IF染色和免疫印跡結(jié)果顯示，α-KG以濃度依賴的方式促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞COL2A1蛋白表達(dá)，抑制MMP13蛋白表達(dá)（P<0.01，圖2E-G）。進(jìn)一步檢測(cè)α-KG對(duì)炎癥介質(zhì)的影響。RT-qPCR法和Western印跡結(jié)果顯示，IL-1β可濃度依賴性地上調(diào)人軟骨細(xì)胞IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平，而α-KG則以濃度依賴的方式降低IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平（P<0.05，P<0.01，圖2G-I）。

圖2 α-KG對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成、降解及炎癥反應(yīng)的影響

3、α-KG對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞線粒體自噬和ROS生成的影響

       為了探討α-KG減輕骨性關(guān)節(jié)炎表型的機(jī)制，對(duì)其進(jìn)行了測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，IL-1β處理組降低了與基質(zhì)合成相關(guān)的基因（ACAN和COL2A1）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，上調(diào)了與基質(zhì)降解（如MMP3、MMP9、MMP10、MMP13、ADAMTS1、ADAMTSL1、ADAMTS5、ADAMTS7和ADAMTS8）和炎癥介質(zhì)相關(guān)基因（如IL-1α、IL-1R、IL-6、IL-6R、NFKBIA、TNFRSF9和TNFRSF15）的表達(dá)（圖3A）。然而，與單獨(dú)處理IL-1β相比，α-KG與IL-1β聯(lián)合作用上調(diào)了與基質(zhì)合成相關(guān)的基因（COL2A1），下調(diào)了與基質(zhì)降解（如MMP9、MMP13、ADAMTS1、ADAMTSL2、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS9和ADAMTS12）和炎癥介質(zhì)（IL-6ST、IL-6R、NFKBIA、TNFSF8和TNFSF15）相關(guān)基因的表達(dá)（圖3B）。有趣的是，與線粒體自噬相關(guān)的基因表達(dá)的變化與與基質(zhì)合成、降解和炎癥介質(zhì)相關(guān)的基因的表達(dá)一致。IL-1β降低PINK1、ATG4D和JUN的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而α-KG增加PINK1、PARKIN、ATG4D、JUN、TOMM7和DAPK2的表達(dá)（圖3A和B）。KEGG分析還顯示了與炎癥、增殖、凋亡、氧化磷酸化和有絲分裂相關(guān)的通路的變化（圖3C）。

       因此，進(jìn)一步用透射電子顯微鏡檢測(cè)有絲分裂吞噬作用。結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞線粒體形態(tài)正常、規(guī)則、完整，但腫脹、空泡化、密度降低、結(jié)構(gòu)不完整。α-KG的加入改善了線粒體結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了線粒體自噬，從而增加了IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中受損線粒體的清除（圖3D）。免疫熒光共定位顯示α-KG增加了IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞中線粒體和溶酶體的相互作用（P<0.05，P<0.01，圖3E）。Bafilomycin A1，可以通過(guò)抑制溶酶體酸化阻止晚期自噬通量，被進(jìn)一步測(cè)定自噬通量。結(jié)果顯示，α-KG顯著增加IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的自噬通量（P<0.01）。RT-qPCR和western blot也證實(shí)α-KG上調(diào)了線粒體自噬標(biāo)志物（PINK1和Parkin）相關(guān)基因的表達(dá)（P < 0.05, P < 0.01，圖4A, B）。最后，檢測(cè)線粒體功能。結(jié)果表明，α-KG處理顯著提高了IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞基礎(chǔ)呼吸、最大呼吸、ATP相關(guān)的線粒體呼吸和備用呼吸能力（P < 0.05, P < 0.01）。同時(shí)，α-KG也能降低IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞中ROS的生成（P < 0.05, P < 0.01，圖4C）。提示α-KG增加骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的線粒體自噬，改善線粒體功能，抑制ROS生成。

圖3 α-KG對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞線粒體自噬的影響

4、Mdivi-1對(duì)軟骨細(xì)胞α-KG活性的影響

       已經(jīng)證實(shí)Mdivi-1是一種線粒體自噬抑制劑。為了進(jìn)一步探討線粒體自噬在介導(dǎo)α-KG對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞骨關(guān)節(jié)炎表型的緩解作用中的作用，作者采用Mdivi-1聯(lián)合α-KG治療IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞。TEM和IF結(jié)果顯示，α-KG和Mdivi-1抑制了線粒體和溶酶體共定位，改善了線粒體形態(tài)，增加了ROS的產(chǎn)生（P < 0.05, P < 0.01，圖3D和E，4C）。α-KG與Mdivi-1聯(lián)用也降低了PINK1和Parkin的轉(zhuǎn)錄組和蛋白表達(dá)（P < 0.05, P < 0.01，圖4A，B），這些結(jié)果表明Mdivi-1逆轉(zhuǎn)了α-KG對(duì)線粒體自噬的影響。

       用EdU和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡情況，發(fā)現(xiàn)Mdivi-1可以抵消α-KG促進(jìn)增殖和抑制細(xì)胞凋亡的作用（且有增強(qiáng)的趨勢(shì)）（P = 0.0564, P < 0.01，圖1H-K）。補(bǔ)充α-KG后，藏紅花O染色增強(qiáng)，但可被MDVI-1抑制（P<0.01，圖4D）。RT-qPCR結(jié)果顯示，Mdivi-1逆轉(zhuǎn)了α-KG誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成相關(guān)基因（ACAN和COL2A1）轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加（P<0.05，P<0.01，圖4E和F），基質(zhì)降解相關(guān)基因（MMP13和ADAMTS5） （P<0.05，P<0.01，圖4G），以及炎性介質(zhì)（IL-6和TNF-β）表達(dá)降低（P<0.01，圖4H和I）。Western印跡和進(jìn)一步證實(shí)Mdivi-1可抑制COL2A1蛋白表達(dá)的增加和MMP13、IL-6和TNF-α的表達(dá)降低（P=0.0559，P<0.05，P<0.01，圖4J）。

圖4 Mdvi-1對(duì)人軟骨細(xì)胞α-KG活性的影響

5、補(bǔ)充α-KG對(duì)大鼠骨性關(guān)節(jié)炎表型的影響

       為進(jìn)一步評(píng)價(jià)α-KG的作用，采用ACLT建立大鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型。番紅O-固色綠染色顯示，α-KG修復(fù)后，ACLT可引起軟骨脫落、潮標(biāo)中斷或消失、軟骨纖顫、軟骨裂隙和侵蝕、軟骨變薄和OARSI評(píng)分增加（P<0.01），這些可由α-KG恢復(fù)（P < 0.01，圖5A和B）。RT-qPCR顯示，與對(duì)照組相比，ACLT可下調(diào)軟骨基質(zhì)合成相關(guān)基因（ACAN和COL2A1）的表達(dá)水平，上調(diào)與基質(zhì)降解相關(guān)的基因（MMP13和ADAMTS5）和炎癥介質(zhì)（IL-6和TNF-α）的基因表達(dá)水平，而ACLT+α-KG組則相反（P<0.05，P<0.01，圖5C-H）。免疫組化進(jìn)一步證明，α-KG逆轉(zhuǎn)了ACLT誘導(dǎo)的COL2A1蛋白表達(dá)下降和MMP13水平升高（P<0.01，圖5I，J）。

圖5 補(bǔ)充α-KG對(duì)大鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型的影響

6、補(bǔ)充α-KG對(duì)軟骨組織線粒體自噬的影響

       最后，對(duì)軟骨組織進(jìn)行線粒體自噬實(shí)驗(yàn)。透射電子顯微鏡顯示，ACLT+α-KG組線粒體腫脹、空泡化、結(jié)構(gòu)不完整，線粒體形態(tài)正常、規(guī)則、完整（圖6A）。RT-qPCR和IHC證實(shí)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中PINK1和Parkin的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和Parkin的蛋白水平降低（P<0.05，P<0.01，圖6B，C）。在ACLT誘導(dǎo)的大鼠骨性關(guān)節(jié)炎軟骨組織中，PINK1和Parkin的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)也持續(xù)下降（P<0.05，P<0.01，圖6D-G）。然而，α-KG可逆轉(zhuǎn)上述作用（P<0.05，P<0.01，圖6D-G）。上述結(jié)果表明，α-KG可降低骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨組織的線粒體自噬水平，并促進(jìn)其軟骨組織的線粒體自噬作用。

圖6 補(bǔ)充或不補(bǔ)充α-KG的人OA軟骨和ACLT誘導(dǎo)的大鼠OA模型中線粒體自噬的變化

       總體而言，這項(xiàng)研究證實(shí)，在人OA軟骨和IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中，α-KG（線粒體TCA循環(huán)的一種生理代謝產(chǎn)物）的含量降低。此外，補(bǔ)充α-KG可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡抑制，逆轉(zhuǎn)體內(nèi)外細(xì)胞外基質(zhì)合成減少和降解增加以及炎癥反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激。這是由α-KG促進(jìn)軟骨細(xì)胞和軟骨組織線粒體自噬的能力介導(dǎo)的。此外，線粒體自噬抑制劑Mdivi-1可以抑制α-KG的作用。簡(jiǎn)而言之，作者的研究結(jié)果提供了迄今為止未記錄的α-KG在維持軟骨穩(wěn)態(tài)中的作用證據(jù)，表明它可以成為OA的潛在治療靶點(diǎn)和藥物。

實(shí)驗(yàn)方法

CCK-8、EdU檢測(cè)、流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)印跡、RT-qPCR、免疫組化、RNA測(cè)序、大鼠實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)

L. Liu, W. Zhang, T. Liu, Y. Tan, C. Chen, J. Zhao, H. Geng, C. Ma, The physiological metabolite α-ketoglutarate ameliorates osteoarthritis by regulating mitophagy and oxidative stress, Redox Biology 62 （2023）.