鼻咽癌細胞通過CD70-CD27相互作用促進調(diào)節(jié)性T細胞發(fā)育和抑制活性
盡管鼻咽癌腫瘤微環(huán)境中存在大量CD8+ T細胞浸潤，但在臨床試驗中，抗PD -1免疫治療的有效率并不理想，受到免疫抑制信號的阻礙。為了了解微環(huán)境特征如何改變免疫穩(wěn)態(tài)并限制鼻咽癌的免疫治療效果，作者在此建立了一個基于公開數(shù)據(jù)的多中心單細胞隊列，包含來自50例患者樣本的357206個細胞。作者揭示了鼻咽癌細胞通過CD70-CD27相互作用增強調(diào)節(jié)性T細胞的發(fā)育和抑制活性。CD70阻斷可逆轉Treg介導的抑制，從而重新激活CD8+T細胞免疫。抗CD70 +抗PD -1治療在異種移植類器官和人源化小鼠中進行了評估，顯示出更好的腫瘤殺傷效果。在機制上，CD70敲除抑制了CD4+ na?ve和涉及線粒體完整性、膽固醇穩(wěn)態(tài)和脂肪酸代謝的調(diào)節(jié)性T細胞中的集體脂質(zhì)信號網(wǎng)絡。此外，ATAC-Seq表明NFKB2通過Epstein-Barr病毒依賴性表觀遺傳修飾上調(diào)CD70的轉錄水平。作者的研究結果確定CD70+鼻咽癌細胞作為一個代謝開關，強制脂質(zhì)驅(qū)動的發(fā)展，功能特化和Tregs的穩(wěn)態(tài)，導致免疫逃避。本研究還表明，CD70阻斷可與抗PD -1治療協(xié)同作用，重新激活T細胞對鼻咽癌的免疫。本文于2023年4月發(fā)表在《Nature Communications》期刊上，IF=16.6。
技術路線
主要研究結果
1、腫瘤內(nèi)Treg豐度和激活通過鼻咽癌介導的相互作用進行調(diào)節(jié)
為了在單細胞分辨率下全面研究鼻咽癌細胞對腫瘤內(nèi)T細胞的發(fā)育和功能動力學的影響，作者建立了一個大規(guī)模的隊列，包含來自36個鼻咽癌組織并被分成41個亞型的189,750個T細胞，10個配對的鼻咽癌外周血樣本和4個來自3個鼻咽癌研究的INP組織（圖1a）。在T細胞亞群中，作者鑒定了三種FOXP3+ Treg亞型，即nTregs、rTregs和eTregs，它們具有不同的轉錄組特征。單細胞軌跡分析推斷出兩種CD4+ T細胞的發(fā)育譜系，其中na?ve T細胞在BATF和FOXP3的轉錄驅(qū)動下分化為輔助T細胞或eTregs（圖1b, 1c）。
為了了解CD4+ T細胞亞型是如何在TME中發(fā)生譜系轉移的，作者首先量化了患者中每種亞型的標準化豐度。炎癥組織和鼻咽癌外周血樣本中含有豐富的CD4+ na?ve T細胞和SELL+ nTregs部分，而在TME中，這些部分是有限的（圖1d）。在分化的CD4+T細胞亞型中，rTregs和eTregs表現(xiàn)出對TME的偏好，而濾泡輔助T（TFH）細胞和中央記憶T（Tcm）細胞在INP組織中更加豐富（圖1d）。然后，為了證實TME中Treg和樸素的CD4+T細胞之間的動態(tài)平衡受到損害，作者建立了兩個使用eTreg和na?ve T細胞特異性信號的多元線性回歸模型，以基于NPC Bulk RNA-Seq隊列計算Treg免疫抑制活性和T細胞na?veness。基于功能模塊，作者闡明了高Treg和低na?ve T細胞浸潤是NPC患者的惡性標志，并與預后不良相關（圖1e，f）?；趕cRNAseq信號的CIBERSORTx去卷積進一步證實，在NPC患者中，更高的腫瘤內(nèi)浸潤和Tregs的抑制活性共同導致更差的預后，但與其他臨床參數(shù)無關。作為TME中最發(fā)達的亞型，eTregs在STAT、TGF-β和干擾素信號共同誘導下，表達最高的免疫抑制信號，如CTLA4、LAYN和TNFRSF4，并具有最強的細胞因子通訊、代謝和T細胞抑制活性（圖1g，h）。相反，受規(guī)范的WNT信號調(diào)節(jié)的nTregs和rTregs對T細胞的激活、增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用最小（圖1h）?？紤]到鼻咽癌中eTreg極化的CD4+T細胞格局，作者假設腫瘤內(nèi)Treg豐度和抑制活性的共同增加可能是由腫瘤介導的CD4+ na?ve T細胞到Treg的發(fā)展和Treg的激活共同引起的。
因此，為了闡明Tregs在TME中發(fā)展和激活的腫瘤依賴機制，作者建立了CD4+ na?ve T細胞與鼻咽癌細胞系C666或正常鼻咽上皮細胞系NP460和NP69（圖1i）直接或間接共培養(yǎng)的體外共培養(yǎng)系統(tǒng)。與在無腫瘤細胞和Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導CD4+ na?ve T細胞產(chǎn)生Treg相比，直接共培養(yǎng)系統(tǒng)顯示C666細胞增強了從CD4+ na?ve T細胞到FOXP3+Treg的極化，并上調(diào)了重要的eTreg標志物CTLA4（圖1j-l）。通過選擇與Treg譜系測定和功能相關的基因面板的qRT-PCR（圖1m），以及共培養(yǎng)系統(tǒng)中分泌的免疫抑制因子，包括IL-10、TGF-β和腺苷的ELISA分析（圖1n），進一步驗證了C666細胞的treg極化和激活作用?？傊D錄組分析和功能分析初步表明，鼻咽癌中Tregs的發(fā)育和激活受細胞接觸而不是細胞因子通訊的調(diào)節(jié)。
圖1 極化CD4+ T na?ve-to-Treg的發(fā)展和激活是鼻咽癌的腫瘤特異性特征
2、腫瘤限制性CD70通過與CD27相互作用與Treg豐度和激活相關
為了進一步確定CD4+ na?ve T細胞、Tregs和NPC細胞之間的確切作用模式，作者使用了兩個成熟的程序，CellPhoneDB和CellChat，它們基于scRNA數(shù)據(jù)評估細胞-細胞相互作用的強度和方向。CD70-CD27信號是鼻咽癌細胞、原始CD4+T細胞和Treg亞型之間最主要的相互作用之一，并以CD70/CD27表達依賴的方式發(fā)生（圖2a，b）。盡管已發(fā)現(xiàn)與Treg發(fā)育和功能相關的其他相互作用，包括TIGIT、CD226、4-1BB和LGALS9，但它們似乎在CD4+ na?ve T細胞和Treg亞型中都沒有上調(diào)，在NPC微環(huán)境中的eTregs中也沒有明顯增強。因此，CD70-CD27信號被確定為在CD4+ na?ve T細胞、Treg細胞和NPC細胞之間發(fā)生的重要的接觸相互作用，從而具有調(diào)節(jié)TME中從頭Treg發(fā)展和抑制活性的潛力。
CD70-CD27信號是促進Treg增殖的共刺激途徑，但CD70-CD27信號在腫瘤浸潤性Treg的發(fā)生和激活中的確切作用和分子機制尚不清楚。因此，作者最初基于Visium數(shù)據(jù)分析了鼻咽癌細胞、Tregs和CD70表達之間的空間接近性，其中整合的鼻咽癌scRNA-seq數(shù)據(jù)作為參考，通過基于錨定的反卷積和細胞定位推斷腫瘤和Treg部分。在空間上，Tregs不僅與NPC細胞高度共定位，而且與CD70表達顯著相關（圖2c, 2d），表明CD70+ NPC細胞在調(diào)節(jié)近端Tregs中起積極作用。作者進一步通過流式細胞術檢測了從新鮮內(nèi)鏡活檢中分離的鼻咽癌細胞中的CD70表達，顯示大約60%的EPCAM+腫瘤細胞是CD70+，而在EPCAM-浸潤的免疫/基質(zhì)細胞中只有10%的CD70+細胞（圖2e）。此外，IHC和IF染色顯示原發(fā)性鼻咽癌組織中的CD70表達和FOXP3+/CTLA4+ eTreg浸潤明顯高于非惡性鼻咽淋巴樣組織（圖2f、g）。
盡管少數(shù)效應T細胞、B細胞和樹突狀細胞在激活后短暫表達CD70，但單細胞分析證實，CD70在TME中的表達高度局限于鼻咽癌細胞（圖2h）。作者根據(jù)中位CD70表達水平將整合scRNA-seq隊列中的患者分為CD70-高和CD70-低兩組，結果顯示CD70-高的患者含有豐富的rTregs和eTregs，但減少了nTregs和CD4+ na?ve T細胞的含量（圖2i）。這種現(xiàn)象在原發(fā)性鼻咽癌活檢qRT-PCR上得到了的證實，cd70-高的患者中Treg譜系和激活標志物FOXP3、IL2RA和CTLA4的表達更高（補充圖2h），并根據(jù)上述流式細胞術結果進行分層（圖2e）。同時，作者發(fā)現(xiàn)T細胞的細胞毒性/增殖與Treg分數(shù)之間的負相關僅在CD70高的患者中是明顯的（圖2j），這意味著CD70、Treg和T細胞免疫之間存在反饋回路。
在大量RNA-seq隊列中，CD70表達在NPC患者中持續(xù)上調(diào)，并與較差的生存率相關（圖2k, l）。作者進一步發(fā)現(xiàn)，C666細胞中CD70+的比例是NP460和NP69細胞的3倍（圖2m），從而誘導了CD70-CD27結合時從共培養(yǎng)的CD4+初始T細胞表面切割出更高的可溶性CD27（SCD27）（圖2n）。在誘導CD4 + na?ve T細胞向Treg分化的時間分辨轉錄組分析中，計算出的Treg抑制評分隨著FOXP3、CTLA4和CD27的表達成比例地增加，而na?ve評分在此過程中呈現(xiàn)相反的趨勢（圖2o）。在大量RNA-seq隊列中，作者確定CD70表達與抑制評分呈正相關，與na?ve評分負相關（圖2p）。這些結果提示CD70+鼻咽癌細胞具有treg極化和激活作用，但它可能雙重依賴于鼻咽癌細胞中的CD70+部分和CD4+ na?ve T細胞和treg中的CD27+部分。
由于鼻咽癌是一種獨特的EBV+頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC），作者隨后探討了上述CD70+腫瘤細胞與Tregs之間的反饋回路是否存在于其他人類乳頭瘤病毒+ （HPV+） HNCs中。通過分析兩個獨立的HNSCC scRNA-seq隊列，作者發(fā)現(xiàn)與正常扁桃體微環(huán)境相比，rTregs和eTregs在HPV+ HNSCC微環(huán)境中沒有顯著浸潤。此外，CD70在HNSCC細胞中的表達極低，也與HNC患者的預后不良無關。這些結果支持CD70介導的Treg免疫抑制是npc特異性的特征，可能不會導致HPV+ HNSCC患者的腫瘤進展或免疫治療失敗這一觀點。
圖2 CD70 +鼻咽癌細胞通過與CD4+/CD27+ T細胞相互作用，促進豐富和抑制性Treg浸潤
3、在鼻咽癌細胞中敲除CD70可通過抑制Treg的發(fā)育和功能來減輕免疫抑制
為了闡明CD70對Treg發(fā)育和激活的直接影響，作者用活性重組CD70蛋白處理CD4+ na?ve T細胞。激動劑治療通過CD70-CD27相互作用上調(diào)CD4+ na?ve T細胞FOXP3和CTLA4的表達，并增加免疫抑制因子的分泌（圖3a-d）。隨后，作者在C666細胞中進行了CRISPR介導的CD70（CD70-KO）基因敲除，這不影響C666細胞中PD-L1的表達或細胞增殖。然而，CD70-KO通過阻斷CD27的相互作用（圖3E-G）顯著地減少了來自CD4+ na?ve T細胞的Treg的發(fā)展和激活，并抑制了sCD27、IL-10、TGF-β和腺苷的Treg分泌組（圖3g，h）。其他Treg激活標志物包括ICOS、TNFRSF4、4-1BB（由TNFRSF9編碼）、GITR（由TNFRSF18編碼）和TIGIT的流式細胞儀和qRT-PCR分析進一步證實了Treg抑制活性受損（圖3i）。TIGIT是小組中only不受CD70-KO影響的標記，但這一結果與先前的研究一致，即TIGIT在Treg上的表達不受CD70-CD27共同刺激的影響。Treg抑制實驗進一步證實了CD70-KO功能抑制了配對CD8+T細胞增殖的Treg抑制活性，這與上述結果相呼應。
考慮到受損Tregs的抑制活性可能會重振CD8+T細胞介導的抗腫瘤免疫，正如大量RNA-Seq數(shù)據(jù)GSEA分析所分析的那樣，作者建立了以CD4+為主的腫瘤-外周血單個核細胞（PBMC）共培養(yǎng)體系。作者發(fā)現(xiàn)C666細胞中的CD70-KO大大增強了細胞毒性依賴性腫瘤細胞的死亡（圖3j - 1），特別是在與鼻咽癌患者生理T細胞全局相似的共培養(yǎng)系統(tǒng)中，CD4+ T細胞上CD27的表達更高。較高的腫瘤細胞死亡率可能直接歸因于CD70- NC C666細胞誘導的共培養(yǎng)CD4+ na?ve T細胞和Tregs中CD70共刺激的缺失，而不是共培養(yǎng)系統(tǒng)中的CD4+和CD8+ T細胞。在CD70-KO系統(tǒng)中，CD8+/顆粒酶A+和CD8+/穿孔素+ T細胞組分、TNF-α和IFN-γ分泌以及CD8+ T細胞增殖均升高，PD-1和TIM-3表達降低（圖3m-q），這表明受損的Treg抑制活性可以重新激活抗腫瘤CD8+ T細胞。
為了更全面地證明CD70-CD27相互作用對NPC浸潤性T細胞的免疫抑制作用，作者設計了CD19+CD70-NC/ CD19+ CD70-KO C666細胞與抗CD19 CAR-T細胞的自體共培養(yǎng)系統(tǒng)。自體共培養(yǎng)系統(tǒng)可以激活CD4+和CD8+ T細胞中的抗原特異性T細胞，并對CD19+ CD70-NC和CD19+ CD70-KO C666細胞進行抗原特異性殺傷。與同種異體共培養(yǎng)系統(tǒng)的結果相比，CD70-KO在自體共培養(yǎng)系統(tǒng)中的C666細胞中持續(xù)抑制Treg極化、激活和抑制活性，從而增強抗原特異性T細胞殺傷和細胞毒性。此外，作者通過PBMC連續(xù)攻擊親代C666細胞來模擬鼻咽癌進展過程中的漸進性免疫逃逸，建立了免疫耐藥的C666細胞。作者發(fā)現(xiàn)CD70在免疫耐受細胞中的表達持續(xù)上調(diào)，驗證了CD70+NPC細胞在促進免疫逃避中的積極作用。
此外，缺乏小鼠鼻咽癌細胞系、自發(fā)的小鼠模型以及小鼠無法感染EBV一直阻礙著鼻咽癌免疫學和免疫治療的轉化研究。因此，作者建立了移植PBMC的人源化NSG小鼠模型，以研究CD70-KO C666細胞對浸潤性Tregs發(fā)育和抑制活性的體內(nèi)影響。與體外結果一致，CD70-KO在免疫缺陷的NSG小鼠中沒有改變NPC的體內(nèi)致瘤性（圖3r），但在人源化的NSG小鼠中導致顯著的腫瘤縮?。▓D3s），進一步證實了CD70在抗腫瘤免疫中的抑制作用。但是H&E染色在CD70-NC和CD70-KO腫瘤中的總免疫浸潤之間沒有顯著差異，但CD70-KO腫瘤中FOXP3+Tregs的比例減少且活性受損，從而降低了TME中IL-10和TGF -β的濃度（圖3t-v）。因此，CD70-KO腫瘤通過促進細胞毒性細胞因子的釋放和防止T細胞耗盡來重振CD8+T細胞的效應譜（圖3t，u）。這些結果提示，鼻咽癌患者中治療性的CD70抑制可能是克服Treg免疫抑制進而激活T細胞免疫的有效策略。
圖3 鼻咽癌細胞中CD70基因缺失可恢復Treg抑制活性，增強TME中CD8+ T細胞功能
4、Cusatuzumab在患者衍生模型中增強抗腫瘤免疫并與抗PD-1治療協(xié)同作用
考慮到CD27在T細胞、NK細胞和B細胞上的高表達，在使用CD27阻斷時可能導致脫靶效應，CD70已成為一個更有效和安全的靶標，因為它在穩(wěn)態(tài)期間不會在正常組織和造血細胞系上表達。Cusatuzumab是一種人αCD70單克隆抗體，可有效阻斷CD70-CD27相互作用及其下游信號通路。到目前為止，cusatuzumab正在多個臨床試驗（NCT04023526和NCT04150887）中對急性髓系白血?。ˋML）患者進行評估，并顯示出對CD70 +白血病干細胞的有效殺傷效果及可控的不良事件。然而，還沒有在臨床前的實體瘤中全面描述cusatuzumab的療效。通過用5 μg/mL cusatuzumab處理C666細胞，作者發(fā)現(xiàn)在CD4+ na?ve T細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，Treg發(fā)育、活化、分泌免疫抑制因子以及抑制CD8+ T細胞增殖的能力被抑制到與CD70-KO相當?shù)某潭龋▓D4a-d）。因此，在PBMC共培養(yǎng)系統(tǒng)中，通過促進CD8+ T細胞的增殖和細胞毒性，cusatuzumab治療誘導了更高的腫瘤細胞死亡（圖4e-i）。作者還評估了在PBMC共培養(yǎng)系統(tǒng)中，CD70封閉性抗體對免疫抑制的抑制作用。C666細胞中的CD70阻斷顯示了與cusatuzumab治療相當?shù)哪[瘤殺傷和細胞毒性增強效果，進一步證實了CD70抑制在誘導更強的抗腫瘤免疫中是有效的。接下來，在患者來源的原代NPC細胞和自體PBMCs之間的共培養(yǎng)系統(tǒng)中，進一步驗證了cusatuzumab的免疫激活作用。與IgG治療相比，cusatuzumab治療抑制了Tregs的抑制活性，這反過來激活了CD8+ T細胞的效應子功能，最終導致增強的腫瘤殺傷功效。
在這項研究中，cuatuzumab被證明通過緩解鼻咽癌中Treg的發(fā)展和抑制活性來增強T細胞免疫?；蛘?，抗PD-1治療通過防止T細胞耗盡直接釋放CD8+/PD-1+ T細胞的增殖和激活。因此，聯(lián)合抗CD70和抗PD-1治療可達到增強抗腫瘤免疫的協(xié)同作用。為了研究這種潛在的協(xié)同效應，作者首先使用TIDE方法預測CD70高和CD70低的鼻咽癌患者的ICB反應性和T細胞特征。CD70高的鼻咽癌患者預計對ICB阻斷更有抵抗力，表現(xiàn)出更低的T細胞毒性和炎癥，但T細胞排斥率更高。除NPC外，CD70在其他實體腫瘤如黑色素瘤中也優(yōu)先表達。一些黑色素瘤研究已經(jīng)從接受ICB的應答者和無應答者中生成了TME轉錄組圖譜，這些圖譜的計算分析表明CD70表達與T細胞功能障礙和較差的ICB結果相關。為了驗證CD70在黑色素瘤中的促腫瘤作用，作者在小鼠黑色素瘤細胞系中進行了CD70-KO：B16-F10，以及在C57BL/6J小鼠中原位注射CD70-NC和CD70-KO B16-F10細胞。CD70-KO導致黑色素瘤顯著縮小，但作者也觀察到CD70-KO對腫瘤的特異性反應，可能是由于小鼠特異性的TME。
在實驗上，作者評估了CD70+PD-1在模擬鼻咽癌原發(fā)腫瘤生理狀態(tài)的鼻咽癌器官中的阻斷效果。作者從2018年建立的EBV+NPC患者來源的異種移植（Xeno76）中建立了NPC有機化合物，并相應地評估了CD70和PD-L1在Xeno76中的表達水平（圖4j）。在有機物-PBMC共培養(yǎng)體系中，抗CD70單藥和抗PD-1單藥均顯著增加腫瘤細胞死亡率，但聯(lián)合治療在有機物數(shù)量、大小和存活率方面顯示出更好的殺瘤效果（圖4k-n）。作者進一步比較了聯(lián)合療法和單一療法在移植了Xeno76的PBMC和移植了人源化NSG的NSG小鼠中的體內(nèi)療效。一直以來，抗CD70+抗PD1聯(lián)合治療在抑制患者來源的異種移植（PDX）生長方面顯示出最高的療效（圖4o，p）。同時，腫瘤浸潤性Tregs和CD8+細胞毒性T細胞的比例在接受聯(lián)合治療后分別顯著減少和增加（圖4Q），這表明聯(lián)合抗CD70和抗PD-1治療獲得了通過克服Treg介導的免疫抑制來刺激T細胞免疫的協(xié)同效應。
圖4 治療抑制CD70促進抗腫瘤免疫和抗PD-1療效
5、CD70-CD27信號參與Tregs的脂代謝重編程
Treg是一種有彈性的T細胞亞型，具有很強的組織適應性和分子靈活性，有助于它們在不同的生態(tài)系統(tǒng)中存活、穩(wěn)態(tài)和代謝，包括外周、淋巴結、胸腺和腫瘤。由于作者證明了CD70-KO和鼻咽癌細胞中的抑制通過限制Treg的活性來增強抗腫瘤免疫，作者進一步研究了CD70-CD27信號如何影響Treg下游的動態(tài)平衡，特別是在NPC的TME中。因此，作者在與CD70-NC和CD70-KO C666細胞共培養(yǎng)的PBMC中應用了額外的3‘scRNA-seq（圖5a）。與作者的體外和體內(nèi)結果一致，CD70-KO降低了nTregs、rTregs和eTregs的豐度，擴大了促炎亞型，包括CD8+細胞毒性T細胞、CD4+TFH細胞和CD4+ na?veT細胞（圖5B）。
此外，與CD70-KO C666細胞共培養(yǎng)的PBMCs中的Tregs （KO-Tregs）表現(xiàn)出譜系特異性（FOXP3, IL2RA和SOX4），活化（CTLA4和LAYN）和共刺激（TNFRSF4和TNFRSF9）標記的表達較低，但na?ve （SELL）特征標記的表達較高（圖5c）。特別是，一些共培養(yǎng)的eTreg轉變?yōu)榇嗳鯛顟B(tài)，其先前的特征是FOXP3表達保留，但IFN-γ產(chǎn)生異常。然而，在與CD70共同培養(yǎng)的Treg中，PD-1的上調(diào)保護了這些細胞免受干擾素誘導的脆弱性，同時保持了功能穩(wěn)態(tài)（圖5c）。因此，在抗CD70治療中加入PD-1阻斷后觀察到的協(xié)同作用也可能通過誘導Treg脆弱性來部分減少免疫抑制。CD70-KO組CD8+細胞毒性T細胞的增殖（MKI67）、細胞毒性（GZMA和LTB）和活化（TNFRSF1B和CD28）標志物的表達增加，而na?ve （Tcf7和CCR7）和衰竭（LAYN、LAG3和HAVCR2）標志物的表達降低，進一步證實阻斷Tregs的抑制活性促進了CD8+T細胞的增殖、激活和緩解衰竭（圖5d）。CD70介導的Treg免疫抑制也阻礙了CD8+細胞毒性T細胞的炎癥反應，從而降低了它們的抗腫瘤效果。
為了進一步闡明CD70-CD27信號在Tregs中的下游機制，作者對CD70誘導的Tregs和KO-Tregs進行了GSEA。CD70+C666細胞通過增強由復雜的脂質(zhì)信號網(wǎng)絡驅(qū)動的氧化磷酸化（OXPHOS），有效地重新編程共培養(yǎng)的Treg的代謝譜（圖5e）。Treg經(jīng)常需要強健的新陳代謝來維持它們在TME中的發(fā)育和抑制活動。特別是，Treg具有高能量驅(qū)動的可塑性，因此可以利用不同的代謝資源，包括乳酸、葡萄糖和脂肪酸（FAs），在代謝物缺乏的環(huán)境中維持功能平衡。通路分析表明，脂肪酸代謝、膽固醇穩(wěn)態(tài)和線粒體功能是CD70誘導的Tregs中最豐富的信號，最近報道這些信號有助于Treg譜系確定、功能適應和免疫抑制（圖5e）。例如，由脂肪酸氧化驅(qū)動的OXPHOS增加是TME中Treg發(fā)展和抑制活性的標志。同時，上調(diào)的解毒和氧化還原穩(wěn)態(tài)保護CD70誘導的Tregs免受OXPHOS和ATP產(chǎn)生的高水平活性氧物種的影響，同時保持線粒體的完整性（圖5f）。相反，KO-Tregs由于脂質(zhì)外流和清除增加以及線粒體完整性喪失而表現(xiàn)出功能動態(tài)平衡受損（圖5f）。
圖5 單細胞分析顯示CD70-CD27信號增強Tregs中脂質(zhì)驅(qū)動的OXPHOS
6、線粒體的完整性、膽固醇的穩(wěn)態(tài)和脂肪酸的氧化共同促成了Treg的功能特化
為了從機制上了解CD70誘導的復雜脂質(zhì)網(wǎng)絡如何在鼻咽癌微環(huán)境中增強Tregs的功能特化和動態(tài)平衡，作者評估了CD70-NC和CD70KO C666細胞共同培養(yǎng)的CD4+T細胞內(nèi)總脂和關鍵脂成分（如膽固醇和脂肪酸）的變化。首先，鼻咽癌細胞中CD70的基因缺失和治療抑制顯著降低了共培養(yǎng)的Treg細胞的細胞內(nèi)總脂質(zhì)和膽固醇（圖6a，b）。其次，從FOXP3-非Tregs、FOXP3+/CTLA4-rTregs到FOXP3+/CTLA4+eTregs，細胞內(nèi)膽固醇增加，這表明細胞內(nèi)膽固醇積累與Treg的發(fā)展和抑制活性有關（圖6c）。在整合的NPC scrna-seq隊列中，作者證實eTregs具有更強勁的膽固醇代謝和生物合成，但膽固醇輸出較低。
考慮到脂質(zhì)信號是一個高度復雜的網(wǎng)絡，涉及各種代謝物的細微變化，作者進行了基于質(zhì)譜的代謝組學，以量化共培養(yǎng)CD4+ T細胞中極性分子和脂肪酸的細胞內(nèi)代謝變化（圖6c）。質(zhì)譜分析顯示，CD70-KO組細胞內(nèi)膽固醇和腺苷持續(xù)下降，CD39表達降低（圖6d）。同時，增加甘油可以保護Tregs免受脂質(zhì)累積毒性，后者損害FOXP3的穩(wěn)定性（圖6d）。OXPHOS衍生的代謝物被積極代謝，包括琥珀酸鹽、2-羥基戊二酸鹽（2-HG）和蘋果酸鹽，被積極代謝（圖6d），這些代謝物之前被報道與Treg發(fā)育受損和通過PD-1的表觀遺傳抑制活性相關。而CD70-NC組、CD70-KO組和CD4+ T組細胞中的檸檬酸鹽、天冬氨酸和谷氨酰胺保持不變。脂肪酸組，CD70-KO組總脂肪酸含量明顯降低（圖6d）。幾乎所有細胞內(nèi)脂肪酸衍生物C4到C26的濃度都降低了，這表明阻斷Tregs中CD70-CD27信號通路可能會破壞新生脂肪酸的攝取、合成和氧化。
基于觀察到的Tregs在CD70/CD27介導的脂質(zhì)信號傳導中的代謝適應，作者提出線粒體完整性、膽固醇穩(wěn)態(tài)和脂肪酸代謝共同促成了Tregs在NPC微環(huán)境中通過CD70-CD27信號傳導的代謝優(yōu)勢和功能特化。作者推測CD70作為一個主代謝開關，重新編程CD4+ na?ve T細胞和Treg的脂質(zhì)代謝，以滿足這些細胞在惡劣環(huán)境中Treg發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和激活的代謝需求。為了驗證作者的假設，作者首先在電鏡下發(fā)現(xiàn)KO-Tregs的線粒體較少且不健康（圖6e），導致海馬實驗和JC-1染色顯示的ATP生成、OXPHOS和線粒體電位減少（圖6f-h）。此外，作者評估了Tregs中46個參與脂質(zhì)合成、運輸和氧化的代表性基因的變化，其中超過70%的選定特征受到CD70-CD27信號傳導的顯著影響（圖6i）。
鑒于CD70誘導的Tregs細胞內(nèi)膽固醇升高，作者首先檢查了參與調(diào)節(jié)膽固醇攝取的LDLR的變化。有趣的是，在CD70誘導的Tregs中，LDLR的表達并未增加，而膽固醇外排相關基因（如SCARB1和SDC1）被發(fā)現(xiàn)下調(diào)，這表明膽固醇積累是由抑制膽固醇輸出引起的。此外，通過甲羥戊酸途徑參與膽固醇代謝和Treg穩(wěn)態(tài)的關鍵調(diào)節(jié)因子和酶，包括SREBF1、SREBF2、HMGCS1、SOAT1、SOAT2、FNTB、PGGT1B、GGPS1、RAC2和PD-1，促進Treg的發(fā)育和維持，也被CD70-CD27信號增強（圖6i）。
脂肪酸攝取和重新合成引起的Tregs細胞內(nèi)脂肪酸積累積極參與IL-2依賴性增殖和TCR依賴性活化。通過BODIPY C12示蹤和FAO通路中的三種酶（ACADVL、ACADM和HADHA）水平確定，CD70-KO在共培養(yǎng)的CD4+ T細胞中損害了脂肪酸攝取和氧化。在CD70共培養(yǎng)的CD4+ na?ve T細胞中，增加的ACACA而不是FASN，也可能通過重新合成FA促進細胞內(nèi)脂肪酸積累，從而上調(diào)TCR依賴的Treg激活和成熟標記TNFRSF18和CD44（圖6i）。如上所述的代謝實驗表明，CD70誘導的Treg中積累的脂肪酸庫通過線粒體OXPHOS為FAO提供了足夠的資源，這些資源持續(xù)產(chǎn)生ATP，足以滿足Treg功能化和TME中生存的高能量需求。
以前已經(jīng)證明線粒體復合物III對于Treg抑制活性和增強FAO驅(qū)動的OXPHOS是必需的。與線粒體復合體III的完整性和功能相關的UQCRFS1，UQCRQ和CYC1，在由CD70-CD27信號激活的Tregs中上調(diào)，與電子顯微鏡圖像協(xié)調(diào)一致（圖6e，i）。作者還發(fā)現(xiàn)TCA循環(huán)和電子傳遞鏈（ETC）中關鍵調(diào)節(jié)因子和酶的上調(diào)，包括NR4A1、NR4A2、MDH1、MDH2、ECHS1和ECH1（圖6i）。其他轉錄因子，包括STAT5A和cAMP誘導因子，如CREB1和CEBPB，與Tregs的代謝適應性相關，可能確保Tregs在NPC微環(huán)境中的功能特化（圖6i）。然而，其他幾個重要的脂質(zhì)代謝相關基因，包括SQLE，SCAP，HMGCR，ATF4，CCDC5B，LAGLS3，CTNB1和EGR1，沒有差異表達（圖6i），表明在腫瘤特異性的神經(jīng)干細胞內(nèi)，Tregs中存在一種可替代的和獨立于CD70之外的脂質(zhì)信號。
作者進一步構建了脂質(zhì)信號模塊，其包含基于多元線性回歸從qPCR組中選擇的15個代表性簽名基因，以定量評估單細胞和大量轉錄組數(shù)據(jù)集中Tregs和其他CD4+ T細胞中的脂質(zhì)信號活性。
首先，NPC細胞中CD70的基因去除顯著損害了共培養(yǎng)Tregs中的脂質(zhì)信號傳導（圖6j）。同時，在整合的NPC單細胞群組中，eTregs具有最高的脂質(zhì)信號傳導活性，超過rTregs、nTregs和其他CD4+亞型，包括TFH細胞、TCM細胞和na?ve細胞（圖6k）。在時間分辨的Treg分化模型中，脂質(zhì)信號活性與na?ve T細胞至Treg分化期間的Treg抑制評分和CD25表達正相關，與幼稚評分和IL7R表達負相關（圖6l）。在大量RNA-seq群組中，脂質(zhì)信號傳導活性與Tregs的抑制活性和NPC患者的不良預后高度相關（圖6m，n）。此外，在GTEx的337份全血樣本的轉錄組數(shù)據(jù)中，15個代表性特征基因與CD70、CD27、FOXP3、CTLA4和CD25之間的相關性得到了獨立驗證（圖6o），表明脂質(zhì)模塊與Treg活性在個體中一致相關?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明脂質(zhì)代謝重編程和CD70-CD27信號在譜系確定、穩(wěn)態(tài)和NPC浸潤Tregs抑制活性中的密切合作。
為了驗證脂質(zhì)代謝在CD70誘導的鼻咽癌微環(huán)境中Treg的發(fā)展和激活中的重要性，作者評估了CD70-NC和CD70-KO與去脂微環(huán)境共培養(yǎng)時的功能和代謝變化。在去脂共培養(yǎng)系統(tǒng)中，CD70+ NPC細胞不再誘導CD4+ na?ve T細胞分化出更高比例的總活化treg，也不再誘導更強的CD8+ T細胞增殖抑制（圖6p, q）。在脂質(zhì)耗盡系統(tǒng)中，CD4+ T細胞與CD70-NC和CD70-KO C666細胞共培養(yǎng)的免疫抑制分泌組譜也沒有差異（圖6r）。因此，脂質(zhì)缺失也導致CD70-CD27相互作用不能調(diào)節(jié)NPC-PBMC共培養(yǎng)系統(tǒng)中的Treg免疫抑制，導致CD70-NC組和CD70-KO組的抗腫瘤免疫增強（圖6s）。此外，由于缺乏可被吸收和合成的游離脂，NC-Tregs和KO-Tregs的細胞內(nèi)總脂質(zhì)含量保持不變（圖6T）。代謝分析進一步表明，即使在CD70-CD27信號活躍的情況下，脂肪缺失時，Tregs的ATP生成、OXPHOS、線粒體完整性和脂肪酸氧化也顯著受損（圖6u-x）。這些結果成功地證明了CD70CD27相互作用對于促進鼻咽癌浸潤性樹突狀細胞的發(fā)育、動態(tài)平衡和抑制活性是必不可少的脂代謝。
圖6 脂質(zhì)信號促進Treg發(fā)育、動態(tài)平衡和抑制活性
由于CD70在鼻咽癌組織中的過度表達在臨床上經(jīng)常被觀察到，作者想要探討CD70介導的免疫逃避的上游機制。單細胞分析發(fā)現(xiàn)，CD70的轉錄組水平在EBV+NPC細胞中顯著過表達（圖7a）。作者證實，與EBV-對應物相比，EBV+ NPC43細胞中的CD70+ 分數(shù)更高（圖7a）。NPC的EBV感染導致基因組不穩(wěn)定，因此表觀遺傳學刺激癌基因的轉錄以促進腫瘤進展和免疫逃逸。據(jù)報道，染色體19上的CD70基因的染色體位點在NPC經(jīng)常被擴增。因此，為了描述CD70在NPC的過度表達是否是由EBV介導的染色質(zhì)可及性改變引起的，作者對EBV+ NPC細胞、EBV- NPC細胞和NPE細胞進行了ATAC序列分析。與EBV-和正常對應物相比，EBV+ NPC細胞中CD70啟動子區(qū)域的染色質(zhì)可及性增強，使得轉錄因子結合更有效，從而促進CD70 mRNA轉錄（圖7b）?；贏TAC分析，作者鑒定了在EBV+ NPC細胞中具有最高轉錄活性的前15個轉錄因子，其可能以更高的可及性與CD70啟動子區(qū)域結合（圖7c）。在15個轉錄因子中，作者表征了NFKB2是在兩個NPC RNA-seq隊列和Visium空間數(shù)據(jù)中驗證的與CD70表達最相關的一個，并且具有與JASPER預測的CD70啟動子區(qū)域的最高結合分數(shù)圖（7d，e）。在EBV-感染的淋巴細胞中，還發(fā)現(xiàn)NFKB2與CD70高度相關，表明在免疫和上皮細胞中一致的EBV調(diào)節(jié)的表觀遺傳學（圖7f）。
NFKB2是NF-κB通路的主要調(diào)節(jié)因子，NF-κB通路被廣泛認為是NPC啟動和進展的同質(zhì)驅(qū)動因子。NFKB2經(jīng)常在EBV+ NPC細胞中過表達，而不是在TME中的EBV-腫瘤細胞、NPE細胞、基質(zhì)細胞和免疫細胞中過表達（圖7g），并且先前已經(jīng)顯示促進腫瘤生長和存活。然而，其對NPC免疫逃避的調(diào)節(jié)作用以及與CD70上調(diào)的分子連鎖尚未被全面闡明。因此，為了描述NFKB2對CD70轉錄的調(diào)節(jié)作用，作者在CD70啟動子區(qū)域確定了NFKB2獨特的結合基序，該基序因EBV感染而增強了可及性（圖7b）。因此，作者設計了一個點突變的CD70與熒光素酶結合的基序，并證明了NFKB2可以特異性地和有效地結合到這個位點上，以增強CD70的轉錄（圖7h）。為了進一步驗證NFKB2作為CD70轉錄增強子的作用，作者在C666細胞中進行了NFKB2基因敲除和抑制，顯示CD70 mRNA和CD70蛋白持續(xù)下降（圖7i至7k）。C666細胞中NFKB2的丟失使它們在PBMC共培養(yǎng)系統(tǒng)中對免疫攻擊敏感（圖7l，m）。這些數(shù)據(jù)揭示了EBV-NFKB2-CD70軸是鼻咽癌細胞通過上調(diào)Treg免疫抑制來逃避免疫監(jiān)視的重要機制，Treg免疫抑制降低了T細胞免疫。
圖7 EBV感染增加CD70啟動子染色質(zhì)可及性并通過NFKB2促進CD70轉錄
總之，作者的多組學驅(qū)動的功能研究為在鼻咽癌微環(huán)境中如何發(fā)展、激活和維持Tregs提供了臨床前的見解，并表明CD70抑制是一種治療上可行的方法，可以克服免疫抑制的TME，協(xié)同提高抗PD-1治療的療效?？笴D70+抗PD-1聯(lián)合治療可能對晚期或耐藥鼻咽癌患者產(chǎn)生特殊的益處，優(yōu)化了這些患者的常規(guī)治療。作者還認為，多組學NPC T細胞隊列以及已建立的功能模塊，如Treg抑制、T細胞幼稚和Treg脂信號模塊，可以應用于其他惡性腫瘤腫瘤浸潤性T細胞的免疫抑制和代謝重編程的未來研究，或用于定量評估免疫治療反應的常規(guī)臨床應用。最后，這種由CD70-CD27信號誘導的脂質(zhì)驅(qū)動的免疫抑制機制為鼻咽癌患者開辟了CD70靶向精確治療的新途徑，并可能對黑色素瘤患者有效，這取決于他們特定的TME環(huán)境。
實驗方法
單細胞測序、偽時間發(fā)育軌跡、單細胞基因集變異分析（GSVA）、細胞培養(yǎng)、流式細胞術、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、qRT-PCR、細胞間通訊分析、空間轉錄組測序和分析、免疫組化（IHC）、免疫熒光（IF）、Treg抑制試驗、細胞增殖和存活分析、細胞凋亡分析、CFSE染色和分析、慢病毒包裝、小鼠模型的建立及異種移植、GSEA分析、油O紅染色和定量、代謝組學、雙熒光素酶報告基因測定
參考文獻
L. Gong, J. Luo, Y. Zhang, et al. Nasopharyngeal carcinoma cells promote regulatory T cell development and suppressive activity via CD70-CD27 interaction, Nature Communications 14(1) (2023).