PKM2調(diào)節(jié)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷的線粒體穩(wěn)態(tài)

       急性腎損傷(AKI)的一個(gè)重要病理生理過程是腎小管上皮細(xì)胞線粒體斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。丙酮酸激酶M2 (PKM2)是一種具有多種生物學(xué)功能的活性蛋白，參與調(diào)節(jié)糖酵解，在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活中起關(guān)鍵作用。然而，PKM2在AKI期間調(diào)節(jié)細(xì)胞存活的作用和機(jī)制尚不清楚。在這里，我們發(fā)現(xiàn)PKM2的磷酸化有助于星孢菌素或順鉑治療后PKM2二聚體的形成和PKM2轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體。線粒體PKM2結(jié)合MYH9促進(jìn)DRP1介導(dǎo)的線粒體斷裂。在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，PKM2特異性缺失或調(diào)節(jié)PKM2活性部分限制線粒體斷裂，減輕腎小管損傷和細(xì)胞死亡，包括細(xì)胞凋亡、壞死和鐵死亡。此外，通過抑制MYH9活性，星孢菌素或順鉑誘導(dǎo)的線粒體斷裂和細(xì)胞死亡在培養(yǎng)細(xì)胞中得到逆轉(zhuǎn)。綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，調(diào)節(jié)PKM2豐度和活性以抑制線粒體易位可能維持線粒體完整性，并為治療AKI提供新的治療策略。本文于2023年10月發(fā)表于“Cell Death and Disease”（IF=9）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）順鉑誘導(dǎo)AKI期間小管上皮細(xì)胞的線粒體PKM2增加

       我們首先檢測(cè)了AKI期間小管上皮細(xì)胞中PKM2的表達(dá)。采用順鉑或星孢菌素刺激正常大鼠腎上皮細(xì)胞(NRK-52E)誘導(dǎo)急性損傷。如圖1A、1E所示，星孢菌素或順鉑刺激后，PKM2磷酸化(p-PKM2)顯著增加。在星孢菌素或順鉑刺激后，PKM2在NRK-52E細(xì)胞中從四聚體轉(zhuǎn)化為二聚體(圖1B、1F)。為了明確PKM2的亞細(xì)胞定位，我們從NRK-52E細(xì)胞中分離出細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和線粒體。核內(nèi)PKM2的表達(dá)在星孢菌素或順鉑刺激下沒有增加，而似乎略有下降。然而，PKM2在線粒體中的表達(dá)顯著增加(圖1C、1D、1G、1H)。此外，我們分析了PKM2在體內(nèi)的表達(dá)。在注射順鉑后第1天和第2天，腎臟組織中p-PKM2的表達(dá)增加(圖1I)。與體外研究一致，在順鉑損傷后第1天，腎臟中發(fā)現(xiàn)PKM2二聚體(圖1J)。線粒體中PKM2和二聚體PKM2的豐度也增加(圖1K)。這些數(shù)據(jù)表明，在順鉑誘導(dǎo)AKI的進(jìn)展過程中，PKM2被轉(zhuǎn)移到線粒體。

2）在急性損傷反應(yīng)中，線粒體PKM2結(jié)合MYH9促進(jìn)DRP1介導(dǎo)的線粒體斷裂

       為了探討PKM2在線粒體中的作用，我們對(duì)星孢菌素處理的NRK-52E細(xì)胞中PKM2結(jié)合蛋白進(jìn)行了co-IP實(shí)驗(yàn)。利用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC-MS/MS)進(jìn)行的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，MYH9是與PKM2結(jié)合最豐富的蛋白(圖2A, 2B)。同時(shí)，在星孢菌素處理的NRK-52E細(xì)胞中，通過共聚焦免疫熒光觀察到PKM2和MYH9的共定位(圖2C)。co-IP的western blotting結(jié)果顯示，經(jīng)星孢菌素處理后，PKM2與MYH9結(jié)合(圖2D)。先前的研究發(fā)現(xiàn)，MYH9可能通過DRP1介導(dǎo)線粒體裂變。我們的研究結(jié)果表明，在星孢菌素刺激下，線粒體中的MYH9和DRP1都增加了(圖2E)。此外，通過co-IP在NRK-52E細(xì)胞中檢測(cè)到MYH9與DRP1的相互作用，星孢菌素顯著增強(qiáng)了這種相互作用(圖2F)。接下來，我們研究了PKM2在調(diào)節(jié)MYH9和線粒體動(dòng)態(tài)變化中的作用。首先，我們用慢病毒介導(dǎo)的Pkm2 shRNA (LV-shRNA Pkm2)轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞，以下調(diào)PKM2的表達(dá)(圖2G)。在星孢菌素或順鉑治療下，轉(zhuǎn)染Pkm2 shRNA的NRK52E細(xì)胞中pDRP1、線粒體MYH9和DRP1的表達(dá)降低(圖2H、2K)。PKM2表達(dá)下調(diào)抑制了星孢菌素或順鉑誘導(dǎo)的線粒體斷裂(圖2I,J, L, M)。

       為了探討PKM2活性在AKI中的可能作用，我們利用紫草素和TEPP46調(diào)節(jié)PKM2活性。如圖2N-2Q所示，紫草素和TEPP46均能抑制順鉑或星孢菌素誘導(dǎo)的p-DRP1、線粒體MYH9和DRP1表達(dá)的增加(圖2N-2Q)。上述結(jié)果表明，在急性損傷期間，線粒體PKM2與MYH9結(jié)合，促進(jìn)DRP1介導(dǎo)的線粒體碎片化。

3）下調(diào)PKM2表達(dá)可減輕體外腎小管細(xì)胞死亡

       腎小管損傷和細(xì)胞死亡是誘發(fā)因素；然而，它們也是AKI的結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)，在星孢菌素處理下，Pkm2敲低組與scramble shRNA組相比，cleaved-caspase3的表達(dá)較低，這表明Pkm2的敲低可以抑制星孢菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖3A)。除了細(xì)胞凋亡，我們還發(fā)現(xiàn)在星孢菌素處理下NRK-52E細(xì)胞中，磷酸化RIP3和MLKL等壞死相關(guān)蛋白均上調(diào)。Pkm2敲低還可以阻斷星孢菌素誘導(dǎo)的磷酸化RIP3和MLKL的上調(diào)(圖3A)。TUNEL染色分析顯示，星孢菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡可以通過PKM2調(diào)控(圖3B, 3C)。PKM2的促凋亡作用也在順鉑處理的NRK-52E細(xì)胞中得到證實(shí)，顯示PKM2敲低后，裂解的caspase3、p-RIP3和MLKL的表達(dá)較低，TUNEL陽性細(xì)胞較少(圖3D-3F)。令人驚訝的是，我們發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)鐵死亡的GPX4的豐度在順鉑刺激后降低，而PKM2敲低恢復(fù)了其表達(dá)(圖3D)。

4）調(diào)控PKM2活性可減輕星孢菌素或順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞死亡

       我們分析了調(diào)控PKM2活性是否有利于星孢菌素或順鉑治療后小管上皮細(xì)胞的存活。紫草素和TEPP46均能使NRK-52E細(xì)胞抵抗星孢菌素誘導(dǎo)的凋亡和壞死(圖4A-4H)。此外，順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、壞死和鐵死亡也可以被紫草素或TEPP46阻礙(圖4I-4P)。綜上所述，降低PKM2表達(dá)或抑制PKM2磷酸化或二聚化可促進(jìn)星孢菌素或順鉑刺激下的細(xì)胞存活。

5）PKM2在體內(nèi)順鉑誘導(dǎo)AKI中的作用

       為了進(jìn)一步確定PKM2對(duì)AKI的影響，我們使用Cre-Loxp重組酶技術(shù)產(chǎn)生了小管上皮細(xì)胞特異性PKM2敲除小鼠。PTCs中PKM2缺失抑制了p-DRP1、線粒體MYH9和DRP1的表達(dá)，減輕了順鉑注射誘導(dǎo)的線粒體斷裂(圖5A)。KO小鼠的PTCs中線粒體面積也得到改善(圖5B, 5C)。與WT小鼠相比，KO小鼠的血尿素氮(BUN)和尿腎損傷分子1 (KIM-1)表達(dá)水平降低(圖5D, 5E)。正如預(yù)期的那樣，PTCs中Pkm2敲除顯著逆轉(zhuǎn)了順鉑誘導(dǎo)的腎小管脫離、刷狀邊界丟失和管狀晶體形成等形態(tài)學(xué)異常(圖5F, 5G)。順鉑注射后，KO小鼠腎組織中KIM-1、cleaved-caspase3、RIP1、pRIP3、RIP3、p-MLKL表達(dá)降低，Na/K-ATPase、aquaporin 1 (AQP1)、GPX4表達(dá)升高(圖5H)。免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)，KO小鼠PTCs中KIM-1陽性細(xì)胞和TUNEL陽性細(xì)胞較WT小鼠少(圖5I-5K)。紫草素和TEPP46可以抑制PKM2易位到線粒體，降低線粒體MHY9和DRP1的表達(dá)，抑制順鉑誘導(dǎo)的線粒體斷裂、腎小管損傷和細(xì)胞死亡(圖6)。

結(jié)論

       本研究不僅確定了PKM2在腎小管上皮細(xì)胞存活中的生理功能，而且為保護(hù)腎功能和預(yù)防AKI提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法

動(dòng)物模型構(gòu)建、CCK-8、TUNEL染色、免疫共沉淀、LC-MS/MS、Western blotting、組織學(xué)分析、TEM、線粒體免疫熒光染色。

參考文獻(xiàn)

Xie W, He Q, Zhang Y, Xu X, Wen P, Cao H, Zhou Y, Luo J, Yang J, Jiang L. Pyruvate kinase M2 regulates mitochondrial homeostasis in cisplatin-induced acute kidney injury. Cell Death Dis. 2023 Oct 10;14(10):663. doi: 10.1038/s41419-023-06195-z.