中性粒細胞通過烏頭脫羧酶1抵抗鐵死亡并促進乳腺癌轉移

       轉移是導致乳腺癌相關死亡的原因。腫瘤浸潤性中性粒細胞（TINs）造成免疫抑制并促進轉移。削弱TINs可能增強免疫療法，但是尋找在TINs中高表達且在腫瘤外中性粒細胞中被低表達的的治療靶點，仍然是一個挑戰(zhàn)。下圖是23年TINs中標項目的題目：

       作者的研究說明了研究結果揭示了TINs如何通過Acod1依賴的免疫代謝轉換逃脫鐵死亡，并將Acod1確定為一個用于抵消免疫抑制并改善免疫療法抗轉移療效的靶點。該研究于2023年9月發(fā)表在《Cell Metabolism》，IF：29。

技術路線

主要研究結果

1.中性粒細胞在乳腺TME表現(xiàn)出有效的免疫抑制和明顯的轉錄組特征

       流式細胞術分析乳腺癌模型小鼠中血液、乳腺腫瘤和肺轉移瘤中的中性粒細胞群，發(fā)現(xiàn)中性粒細胞在乳腺癌模型小鼠中顯著富集(圖1A)。從無瘤或E0771實體瘤小鼠中分離的aCD3/ acd28刺激的脾臟T細胞亞群并且與中性粒細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與無瘤小鼠或者荷瘤小鼠的血液中性粒細胞(BNs)相比，來自E0771小鼠的腫瘤浸潤性中性粒細胞能有效抑制CD4+和CD8+ T細胞的增殖(圖1B)。從py7160小鼠中對血液中性粒細胞（BNs）和腫瘤浸潤性中性粒細胞(TINs)進行分類，發(fā)現(xiàn)血液中性粒細胞和腫瘤浸潤性中性粒細胞顯示出不同的轉錄組活性并且它們屬于不同的細胞簇(圖1C)。IPA分析發(fā)現(xiàn)BNs和TINs之間的差異表達基因在TIN中富集，涉及到的信號途徑包括冠狀病毒發(fā)病機制、IL-6信號、p38 MAPK信號、MIF先天免疫調控和nrf2介導的氧化應激反應。在這些差異表達基因中，TINs細胞中的免疫趨化因子和免疫抑制基因明顯上調(圖1D和E)。分析代謝酶基因在BNs和TINs中的表達發(fā)現(xiàn)TINs上調了包括Ptgs2在內的一系列酶，Ptgs2介導前列腺素E2的產生，從而誘導免疫抑制，并且發(fā)現(xiàn)Acod1是上調最明顯的基因，后續(xù)研究也將圍繞Acod1展開(圖1F)。

圖1.中性粒細胞在乳腺TME表現(xiàn)出有效的免疫抑制和明顯的轉錄組特征

2. Acod1在小鼠和患者原發(fā)性和轉移性BC的TINs中高度表達

       檢測Acod1在血液和組織中的表達，發(fā)現(xiàn)與攜帶E0771的小鼠或無瘤小鼠的血液白細胞相比，Acod1在乳腺腫瘤和肺轉移中顯著升高(圖2A)。從荷瘤小鼠的不同身體部位純化中性粒細胞，并利用qRT-PCR檢測Acod1的表達。在三種模型(E0771、Py7160和MMTV-PyMT)中，來自轉移性肺腫瘤和原發(fā)腫瘤的中性粒細胞的Acod1表達高于骨髓、血液或脾臟中的中性粒細胞，表明荷瘤小鼠中性粒細胞中Acod1表達的升高是由于腫瘤的影響(圖2B)。使用免疫熒光(IF)和qRT-PCR，對E0771腫瘤的facs分類免疫亞群進行檢測，發(fā)現(xiàn)Acod1的表達僅限于髓系細胞并且TINs細胞中Acod1的表達量最高(圖2C-2E)。在E0771小鼠腫瘤定殖的肺中，超過80%的Ly6G+細胞表達Acod1,而無瘤肺中未檢測到Ly6G+細胞(圖2F和G)。使用人原代BC細胞，并將ACOD1與CD15或角蛋白共染色，結果顯示ACOD1在85%的CD15+細胞中表達明顯(圖2H和2I)。分析關于轉移性BC的scRNA-seq和轉錄組學數(shù)據(jù)庫。發(fā)現(xiàn)ACOD1主要在各種轉移部位的免疫細胞中由中性粒細胞和巨噬細胞表達(圖2J)。

圖2. Acod1在小鼠和患者原發(fā)性和轉移性BC的TINs中高度表達

3.中性粒細胞Acod1促進小鼠BC模型的肺轉移

       使用標記紅色熒光蛋白或TR（tk-GFP-luciferase三重報告基因）的E0771小鼠，評估野生型（WT）和Acod1-/-小鼠的原發(fā)腫瘤和肺轉移（圖3A）。發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤的生長速度相似，但Acod1-/- 小鼠的肺轉移負擔顯著低于WT小鼠（圖3B和C），對應著Acod1 -/- 小鼠的生存期延長（圖3D）。對靜脈注射E0771-TR的WT小鼠進行二甲基已酸鹽（DMI）治療（圖3E），DMI促進了肺轉移并縮短了生存期（圖3F-3H）。接下來，使用中性粒細胞的移植（ACT）進行實驗。將來自WT小鼠和Acod1 -/- 小鼠的骨髓細胞在E0771細胞培養(yǎng)液（CM）中培養(yǎng)3天，然后使用αLy6G純化骨髓源性中性粒細胞（BMDNs）（圖3I）。來自WT小鼠的BMDNs顯示出CM誘導的Acod1表達，而Acod1 -/- 小鼠的BMDNs則沒有（圖3J）。接受CM誘導的Acod1 -/- BMDNs的小鼠發(fā)展出較少的肺轉移（圖3K和圖3L），并且比接受CM誘導的WT BMDNs的小鼠除存活時間較長（圖3M）。相比之下，接受PBS注射的小鼠的肺轉移最少，存活時間比兩個接受BMDN注射的組都長。使用MMTV-PyMT Acod1 +/+ 和MMTV-PyMT Acod1 -/- 小鼠。與E0771模型小鼠的結果一致，Acod1去除并不影響原發(fā)腫瘤的發(fā)生，但顯著減少了肺轉移的數(shù)量（圖3N和圖3O）。為了特異性地去除中性粒細胞中的Acod1表達，將實驗分為3組：LysM-Cre + Acod1 f/f、Mrp8-Cre + Acod1 f/f 和Ly6G-Cre + Acod1 f/f。通過分析Ly6G-Cre + tdTomato LSL小鼠的外周血液確認了Ly6G-Cre受限于中性粒細胞。與不同的Acod1敲除效率相一致，LyzM-Cre + Acod1 f/f和Mrp8-Cre + Acod1 f/f 小鼠在靜脈注射E0771細胞后發(fā)展出較少的肺轉移（圖3P），并且相比于Acod1 f/f 對照小鼠存活時間更長（圖3Q），而Ly6G-Cre + Acod1 f/f小鼠則沒有顯示出差異。

圖3.中性粒細胞Acod1促進小鼠BC模型的肺轉移

4.腫瘤分泌的GM-CSF通過STAT5-C/EBPβ 軸在中性粒細胞中誘導Acod1的表達

       使用CM誘導的骨髓來源的中性粒細胞（BMDNs）和雌激素調控的Hoxb8衍生的中性粒細胞（ER-Hoxb8-DNs）。通過將腫瘤細胞CM添加到ER-Hoxb8-DNs中生成類似TIN的細胞（圖4A）。來自4株小鼠乳腺癌細胞系（E0771，Py7160，168FARN和4T1）的CM均能誘導ER-Hoxb8-DNs（圖4B）和BMDNs中的Acod1表達。發(fā)現(xiàn)了8種細胞因子，包括GM-CSF、G-CSF和TIMP-1以及CCL2、CCL5、CXCL1、CXCL2和CXCL10趨化因子來自這兩個細胞系。這些細胞因子經(jīng)過篩選，只有GM-CSF顯著上調了ER-Hoxb8-DNs中的Acod1表達（圖4C）。GM-CSF的下游轉錄因子之一，CCAAT/增強子結合蛋白-β (C/EBPβ)，被GM-CSF和腫瘤CM強烈誘導（圖4C）。C/EBPβ在緊急粒細胞生成和骨髓來源的MDSC生成中起著重要作用。在Drop-seq中，Acod1和Cebpb都由TINs而非BNs表達（圖4D）。在ER-Hoxb8-DNs中使用shRNA敲除Cebpb消除了GM-CSF對Acod1的誘導作用（圖4E）?？笹M-CSF治療降低了E0771-CM誘導的BMDNs中C/EBPβ和Acod1的表達（圖4F）。從Csf2敲除的4T1和E0771細胞中誘導的BMDNs中，Acod1的表達減少，表明GM-CSF在誘導中性粒細胞中的Acod1表達中起關鍵作用。在基于CM的體外實驗中，GM-CSF是由腫瘤細胞分泌的，但在腫瘤微環(huán)境中，GM-CSF可能由多種細胞類型產生。此外，注射外源重組GM-CSF可顯著提高骨髓、肺和脾臟中分離的中性粒細胞中C/EBPβ和Acod1的表達。GM-CSF結合GM-CSF受體并激活中性粒細胞中的JAK-STAT途徑，特別是JAK2和STAT3/5。GM-CSF處理引起ER-Hoxb8-DNs中STAT3和STAT5的迅速磷酸化。STAT5抑制劑（STAT5-IN-1），而不是STAT3抑制劑（BP-1-102、WP1066和LLL12），減弱了C/EBPβ和Acod1的表達（圖4G）。沒有GM-CSF的情況下，無論是哪種抑制劑，ER-Hoxb8-DNs均不表達C/EBPb和Acod1。這些結果揭示了腫瘤分泌的GM-CSF通過STAT5-C/EBPb途徑在TINs中誘導Acod1的機制（圖4H）。

圖4.腫瘤分泌的GM-CSF通過STAT5-C/EBPβ 軸在中性粒細胞中誘導Acod1的表達

5.Acod1通過減弱鐵死亡，維持TIN的存活

       與正常中性粒細胞相比，肺轉移中的中性粒細胞產生更多的活性氧（ROS）。使用WT或Acod1-/-小鼠的E0771肺轉移中的TINs進行了細胞ROS、脂質ROS和線粒體ROS的定量分析。Acod1缺乏的TIN顯示出所有三種ROS類型的升高水平（圖5A-C）。TINs中Acod1喪失導致了更高水平的ROS，可能會導致更明顯的細胞死亡。Acod1的喪失導致轉移性瘤內中性粒細胞的頻率和存活率顯著下降，但不影響B(tài)Ns和脾臟中的中性粒細胞的存活率（圖5D-F）。給攜帶E0771-TR肺轉移的WT小鼠和Acod1-/-小鼠分別注射安慰劑或鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1）。結果顯示，F(xiàn)er-1顯著恢復了Acod1-/-小鼠的轉移負荷（圖5G）和TINs數(shù)量（圖5H），使其恢復到與WT小鼠相當?shù)乃?。為了重現(xiàn)Acod1在體外抵抗TME誘導的中性粒細胞鐵死亡的現(xiàn)象，研究者在存在或缺乏Fer-1和4OI的條件下，用WT或Acod1-/-小鼠的GM-CSF培養(yǎng)的BM細胞，在E0771乳腺腫瘤外植體上清液（TES）中處理（圖5I）。與WT BMDNs相比，TES導致Acod1-/- BMDNs的更明顯脂質過氧化和存活率下降（圖5J-L）。當細胞接受4OI或Fer-1處理時，這種差異消失（圖5J-L）。

圖5.Acod1通過減弱鐵死亡，維持TIN的存活

6.Acod1通過激活Nrf2介導的抗氧化應答來減輕TIN的鐵死亡

       證據(jù)表明，Acod1可以通過激活依賴于Nrf2的抗氧化應答，拯救TIN免受鐵死亡的影響。檢測從WT和Acod1-/-小鼠的E0771肺轉移瘤中分離的TINs中Nrf2的表達情況，并觀察到Acod1損失顯著降低了Nrf2蛋白的表達（圖6A），盡管Nrf2的mRNA水平?jīng)]有改變（圖6B）。與Nrf2的功能一致，Acod1-/- TINs顯著下調了抗氧化基因的表達，如Gpx4、Gclc和Nqo1，這些基因都參與鐵死亡的抵抗（圖C6）。使用Nrf2抑制劑ML385處理轉移瘤攜帶的小鼠消除了WT和Acod1-/- TINs之間這些基因的差異表達（圖6C）。用依康酸或其衍生物4OI和DMI處理的BMDNs顯示出更高的Nrf2蛋白和其轉錄靶基因Gpx4、Gclc和Nqo1的表達。在用E0771 TES激活的BMDNs中，ML385增強了脂質過氧化，而Nrf2活化劑NK252呈劑量依賴性地減少了脂質過氧化。此外，ML385增加了WT TES激活的BMDNs的脂質過氧化，并降低了細胞存活率，使其與經(jīng)ML385處理的Acod1-/- TES激活的BMDNs相當（圖6D-F）。NK252降低了Acod1-/- BMDNs經(jīng)TES處理后的脂質過氧化，并增加了細胞存活率，在100 uM濃度下減少了WT和Acod1-/- BMDNs之間的差異（圖6G-I）。與Acod1-/- BMDNs相比，WT BMDNs含有更多的谷胱甘肽，而外源的4OI或DMI顯著增加了兩種類型的BMDNs中的谷胱甘肽水平（圖6J和圖6K）。

6.Acod1通過激活Nrf2介導的抗氧化應答來減輕TIN的鐵死亡

7.Acod1的去除可增強適應性免疫，增強免疫治療的效果

       Acod1去除對轉移的抑制效果依賴于適應性免疫，因為Rag1-/- Acod1+/+和Rag1-/- Acod1-/-小鼠顯示出相似的E0771-TR肺轉移負荷和存活時間（圖A-C）。由于Acod1缺乏削弱了TINs的功能，檢測Acod1去除對腫瘤浸潤T細胞和免疫檢查點阻斷（ICB）對肺轉移的療效的影響。使用E0771-TR肺轉移模型，觀察到雖然Acod1去除和ICB（αPD1加αCTLA4）各自延長了小鼠的存活時間，但經(jīng)過ICB治療的Acod1-/-宿主顯示出顯著延長的存活時間（圖D）。在靜脈注射后的第15天進行的免疫表型分析顯示，肺部的TIN密度在Acod1去除和ICB聯(lián)合治療中降低最顯著（圖E）。經(jīng)過ICB治療的Acod1-/-小鼠群體在轉移性腫瘤微環(huán)境中顯示出最有利的抗腫瘤T細胞免疫狀態(tài)，其特征是總CD8 + T細胞、IFNγ + CD8 + T細胞、Gzmb + CD8 + T細胞和總CD4 + T細胞的百分比最高，T regs的百分比最低（圖F）。經(jīng)過ICB治療的Mrp8-cre + Acod1 f/f小鼠的存活時間顯著長于經(jīng)ICB治療的Acod1 f/f小鼠的存活時間（圖G）。當ICB治療的Mrp8-cre + Acod1 f/f小鼠接受Fer-1或安慰劑處理時，F(xiàn)er-1加速了攜帶轉移病變小鼠的死亡（圖H），這表明中性粒細胞中的Acod1去除通過上調中性粒細胞的鐵死亡來增強ICB的作用。Acod1的去除沒有改變PD-L1和Arg1的表達。來自肺轉移灶的WT和Acod1-/- TINs對CD4 +和CD8 + T細胞的抑制作用相似。來自攜帶轉移病變的WT和Acod1-/-小鼠的脾臟中性粒細胞對T細胞的抑制作用要弱得多，并且兩種基因型之間沒有差異。數(shù)據(jù)表明，Acod1的上調使TINs在轉移病灶中存活和持久存在，以通過TINs的其他機制持續(xù)執(zhí)行免疫抑制。

圖7.Acod1的去除可增強適應性免疫，增強免疫治療的效果

結論

       作者發(fā)現(xiàn)免疫抑制性TIN通過上調Acod1和產生衣康酸酯在轉移性TME中存活，衣康酸酯激活Nrf2依賴性抗氧化反應以逃避鐵死亡并在轉移中維持TIN 豐度。

實驗方法

IPA分析，scRNA-seq，轉錄組學，免疫熒光，qRT-PCR，ROS定量分析，免疫表型分析，蛋白質印跡分析，細胞培養(yǎng)，流式細胞術，小鼠腫瘤移植實驗

參考文獻

Zhao Y, Liu Z, Liu G, Zhang Y, Liu S, Gan D, et al. Neutrophils resist ferroptosis and promote breast cancer metastasis through aconitate decarboxylase 1. Cell Metab. 2023 Oct 3;35(10):1688-1703.e10. doi: 10.1016/j.cmet.2023.09.004.