中性粒細(xì)胞通過烏頭脫羧酶1抵抗鐵死亡并促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移

       轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌相關(guān)死亡的原因。腫瘤浸潤性中性粒細(xì)胞（TINs）造成免疫抑制并促進(jìn)轉(zhuǎn)移。削弱TINs可能增強(qiáng)免疫療法，但是尋找在TINs中高表達(dá)且在腫瘤外中性粒細(xì)胞中被低表達(dá)的的治療靶點(diǎn)，仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。下圖是23年TINs中標(biāo)項(xiàng)目的題目：

       作者的研究說明了研究結(jié)果揭示了TINs如何通過Acod1依賴的免疫代謝轉(zhuǎn)換逃脫鐵死亡，并將Acod1確定為一個(gè)用于抵消免疫抑制并改善免疫療法抗轉(zhuǎn)移療效的靶點(diǎn)。該研究于2023年9月發(fā)表在《Cell Metabolism》，IF：29。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1.中性粒細(xì)胞在乳腺TME表現(xiàn)出有效的免疫抑制和明顯的轉(zhuǎn)錄組特征

       流式細(xì)胞術(shù)分析乳腺癌模型小鼠中血液、乳腺腫瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤中的中性粒細(xì)胞群，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在乳腺癌模型小鼠中顯著富集(圖1A)。從無瘤或E0771實(shí)體瘤小鼠中分離的aCD3/ acd28刺激的脾臟T細(xì)胞亞群并且與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與無瘤小鼠或者荷瘤小鼠的血液中性粒細(xì)胞(BNs)相比，來自E0771小鼠的腫瘤浸潤性中性粒細(xì)胞能有效抑制CD4+和CD8+ T細(xì)胞的增殖(圖1B)。從py7160小鼠中對血液中性粒細(xì)胞（BNs）和腫瘤浸潤性中性粒細(xì)胞(TINs)進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)血液中性粒細(xì)胞和腫瘤浸潤性中性粒細(xì)胞顯示出不同的轉(zhuǎn)錄組活性并且它們屬于不同的細(xì)胞簇(圖1C)。IPA分析發(fā)現(xiàn)BNs和TINs之間的差異表達(dá)基因在TIN中富集，涉及到的信號途徑包括冠狀病毒發(fā)病機(jī)制、IL-6信號、p38 MAPK信號、MIF先天免疫調(diào)控和nrf2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。在這些差異表達(dá)基因中，TINs細(xì)胞中的免疫趨化因子和免疫抑制基因明顯上調(diào)(圖1D和E)。分析代謝酶基因在BNs和TINs中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)TINs上調(diào)了包括Ptgs2在內(nèi)的一系列酶，Ptgs2介導(dǎo)前列腺素E2的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)免疫抑制，并且發(fā)現(xiàn)Acod1是上調(diào)最明顯的基因，后續(xù)研究也將圍繞Acod1展開(圖1F)。

圖1.中性粒細(xì)胞在乳腺TME表現(xiàn)出有效的免疫抑制和明顯的轉(zhuǎn)錄組特征

2. Acod1在小鼠和患者原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性BC的TINs中高度表達(dá)

       檢測Acod1在血液和組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與攜帶E0771的小鼠或無瘤小鼠的血液白細(xì)胞相比，Acod1在乳腺腫瘤和肺轉(zhuǎn)移中顯著升高(圖2A)。從荷瘤小鼠的不同身體部位純化中性粒細(xì)胞，并利用qRT-PCR檢測Acod1的表達(dá)。在三種模型(E0771、Py7160和MMTV-PyMT)中，來自轉(zhuǎn)移性肺腫瘤和原發(fā)腫瘤的中性粒細(xì)胞的Acod1表達(dá)高于骨髓、血液或脾臟中的中性粒細(xì)胞，表明荷瘤小鼠中性粒細(xì)胞中Acod1表達(dá)的升高是由于腫瘤的影響(圖2B)。使用免疫熒光(IF)和qRT-PCR，對E0771腫瘤的facs分類免疫亞群進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Acod1的表達(dá)僅限于髓系細(xì)胞并且TINs細(xì)胞中Acod1的表達(dá)量最高(圖2C-2E)。在E0771小鼠腫瘤定殖的肺中，超過80%的Ly6G+細(xì)胞表達(dá)Acod1,而無瘤肺中未檢測到Ly6G+細(xì)胞(圖2F和G)。使用人原代BC細(xì)胞，并將ACOD1與CD15或角蛋白共染色，結(jié)果顯示ACOD1在85%的CD15+細(xì)胞中表達(dá)明顯(圖2H和2I)。分析關(guān)于轉(zhuǎn)移性BC的scRNA-seq和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)庫。發(fā)現(xiàn)ACOD1主要在各種轉(zhuǎn)移部位的免疫細(xì)胞中由中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)(圖2J)。

圖2. Acod1在小鼠和患者原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性BC的TINs中高度表達(dá)

3.中性粒細(xì)胞Acod1促進(jìn)小鼠BC模型的肺轉(zhuǎn)移

       使用標(biāo)記紅色熒光蛋白或TR（tk-GFP-luciferase三重報(bào)告基因）的E0771小鼠，評估野生型（WT）和Acod1-/-小鼠的原發(fā)腫瘤和肺轉(zhuǎn)移（圖3A）。發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤的生長速度相似，但Acod1-/- 小鼠的肺轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)顯著低于WT小鼠（圖3B和C），對應(yīng)著Acod1 -/- 小鼠的生存期延長（圖3D）。對靜脈注射E0771-TR的WT小鼠進(jìn)行二甲基已酸鹽（DMI）治療（圖3E），DMI促進(jìn)了肺轉(zhuǎn)移并縮短了生存期（圖3F-3H）。接下來，使用中性粒細(xì)胞的移植（ACT）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將來自WT小鼠和Acod1 -/- 小鼠的骨髓細(xì)胞在E0771細(xì)胞培養(yǎng)液（CM）中培養(yǎng)3天，然后使用αLy6G純化骨髓源性中性粒細(xì)胞（BMDNs）（圖3I）。來自WT小鼠的BMDNs顯示出CM誘導(dǎo)的Acod1表達(dá)，而Acod1 -/- 小鼠的BMDNs則沒有（圖3J）。接受CM誘導(dǎo)的Acod1 -/- BMDNs的小鼠發(fā)展出較少的肺轉(zhuǎn)移（圖3K和圖3L），并且比接受CM誘導(dǎo)的WT BMDNs的小鼠除存活時(shí)間較長（圖3M）。相比之下，接受PBS注射的小鼠的肺轉(zhuǎn)移最少，存活時(shí)間比兩個(gè)接受BMDN注射的組都長。使用MMTV-PyMT Acod1 +/+ 和MMTV-PyMT Acod1 -/- 小鼠。與E0771模型小鼠的結(jié)果一致，Acod1去除并不影響原發(fā)腫瘤的發(fā)生，但顯著減少了肺轉(zhuǎn)移的數(shù)量（圖3N和圖3O）。為了特異性地去除中性粒細(xì)胞中的Acod1表達(dá)，將實(shí)驗(yàn)分為3組：LysM-Cre + Acod1 f/f、Mrp8-Cre + Acod1 f/f 和Ly6G-Cre + Acod1 f/f。通過分析Ly6G-Cre + tdTomato LSL小鼠的外周血液確認(rèn)了Ly6G-Cre受限于中性粒細(xì)胞。與不同的Acod1敲除效率相一致，LyzM-Cre + Acod1 f/f和Mrp8-Cre + Acod1 f/f 小鼠在靜脈注射E0771細(xì)胞后發(fā)展出較少的肺轉(zhuǎn)移（圖3P），并且相比于Acod1 f/f 對照小鼠存活時(shí)間更長（圖3Q），而Ly6G-Cre + Acod1 f/f小鼠則沒有顯示出差異。

圖3.中性粒細(xì)胞Acod1促進(jìn)小鼠BC模型的肺轉(zhuǎn)移

4.腫瘤分泌的GM-CSF通過STAT5-C/EBPβ 軸在中性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)Acod1的表達(dá)

       使用CM誘導(dǎo)的骨髓來源的中性粒細(xì)胞（BMDNs）和雌激素調(diào)控的Hoxb8衍生的中性粒細(xì)胞（ER-Hoxb8-DNs）。通過將腫瘤細(xì)胞CM添加到ER-Hoxb8-DNs中生成類似TIN的細(xì)胞（圖4A）。來自4株小鼠乳腺癌細(xì)胞系（E0771，Py7160，168FARN和4T1）的CM均能誘導(dǎo)ER-Hoxb8-DNs（圖4B）和BMDNs中的Acod1表達(dá)。發(fā)現(xiàn)了8種細(xì)胞因子，包括GM-CSF、G-CSF和TIMP-1以及CCL2、CCL5、CXCL1、CXCL2和CXCL10趨化因子來自這兩個(gè)細(xì)胞系。這些細(xì)胞因子經(jīng)過篩選，只有GM-CSF顯著上調(diào)了ER-Hoxb8-DNs中的Acod1表達(dá)（圖4C）。GM-CSF的下游轉(zhuǎn)錄因子之一，CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-β (C/EBPβ)，被GM-CSF和腫瘤CM強(qiáng)烈誘導(dǎo)（圖4C）。C/EBPβ在緊急粒細(xì)胞生成和骨髓來源的MDSC生成中起著重要作用。在Drop-seq中，Acod1和Cebpb都由TINs而非BNs表達(dá)（圖4D）。在ER-Hoxb8-DNs中使用shRNA敲除Cebpb消除了GM-CSF對Acod1的誘導(dǎo)作用（圖4E）?？笹M-CSF治療降低了E0771-CM誘導(dǎo)的BMDNs中C/EBPβ和Acod1的表達(dá)（圖4F）。從Csf2敲除的4T1和E0771細(xì)胞中誘導(dǎo)的BMDNs中，Acod1的表達(dá)減少，表明GM-CSF在誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞中的Acod1表達(dá)中起關(guān)鍵作用。在基于CM的體外實(shí)驗(yàn)中，GM-CSF是由腫瘤細(xì)胞分泌的，但在腫瘤微環(huán)境中，GM-CSF可能由多種細(xì)胞類型產(chǎn)生。此外，注射外源重組GM-CSF可顯著提高骨髓、肺和脾臟中分離的中性粒細(xì)胞中C/EBPβ和Acod1的表達(dá)。GM-CSF結(jié)合GM-CSF受體并激活中性粒細(xì)胞中的JAK-STAT途徑，特別是JAK2和STAT3/5。GM-CSF處理引起ER-Hoxb8-DNs中STAT3和STAT5的迅速磷酸化。STAT5抑制劑（STAT5-IN-1），而不是STAT3抑制劑（BP-1-102、WP1066和LLL12），減弱了C/EBPβ和Acod1的表達(dá)（圖4G）。沒有GM-CSF的情況下，無論是哪種抑制劑，ER-Hoxb8-DNs均不表達(dá)C/EBPb和Acod1。這些結(jié)果揭示了腫瘤分泌的GM-CSF通過STAT5-C/EBPb途徑在TINs中誘導(dǎo)Acod1的機(jī)制（圖4H）。

圖4.腫瘤分泌的GM-CSF通過STAT5-C/EBPβ 軸在中性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)Acod1的表達(dá)

5.Acod1通過減弱鐵死亡，維持TIN的存活

       與正常中性粒細(xì)胞相比，肺轉(zhuǎn)移中的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生更多的活性氧（ROS）。使用WT或Acod1-/-小鼠的E0771肺轉(zhuǎn)移中的TINs進(jìn)行了細(xì)胞ROS、脂質(zhì)ROS和線粒體ROS的定量分析。Acod1缺乏的TIN顯示出所有三種ROS類型的升高水平（圖5A-C）。TINs中Acod1喪失導(dǎo)致了更高水平的ROS，可能會(huì)導(dǎo)致更明顯的細(xì)胞死亡。Acod1的喪失導(dǎo)致轉(zhuǎn)移性瘤內(nèi)中性粒細(xì)胞的頻率和存活率顯著下降，但不影響B(tài)Ns和脾臟中的中性粒細(xì)胞的存活率（圖5D-F）。給攜帶E0771-TR肺轉(zhuǎn)移的WT小鼠和Acod1-/-小鼠分別注射安慰劑或鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1）。結(jié)果顯示，F(xiàn)er-1顯著恢復(fù)了Acod1-/-小鼠的轉(zhuǎn)移負(fù)荷（圖5G）和TINs數(shù)量（圖5H），使其恢復(fù)到與WT小鼠相當(dāng)?shù)乃?。為了重現(xiàn)Acod1在體外抵抗TME誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞鐵死亡的現(xiàn)象，研究者在存在或缺乏Fer-1和4OI的條件下，用WT或Acod1-/-小鼠的GM-CSF培養(yǎng)的BM細(xì)胞，在E0771乳腺腫瘤外植體上清液（TES）中處理（圖5I）。與WT BMDNs相比，TES導(dǎo)致Acod1-/- BMDNs的更明顯脂質(zhì)過氧化和存活率下降（圖5J-L）。當(dāng)細(xì)胞接受4OI或Fer-1處理時(shí)，這種差異消失（圖5J-L）。

圖5.Acod1通過減弱鐵死亡，維持TIN的存活

6.Acod1通過激活Nrf2介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)答來減輕TIN的鐵死亡

       證據(jù)表明，Acod1可以通過激活依賴于Nrf2的抗氧化應(yīng)答，拯救TIN免受鐵死亡的影響。檢測從WT和Acod1-/-小鼠的E0771肺轉(zhuǎn)移瘤中分離的TINs中Nrf2的表達(dá)情況，并觀察到Acod1損失顯著降低了Nrf2蛋白的表達(dá)（圖6A），盡管Nrf2的mRNA水平?jīng)]有改變（圖6B）。與Nrf2的功能一致，Acod1-/- TINs顯著下調(diào)了抗氧化基因的表達(dá)，如Gpx4、Gclc和Nqo1，這些基因都參與鐵死亡的抵抗（圖C6）。使用Nrf2抑制劑ML385處理轉(zhuǎn)移瘤攜帶的小鼠消除了WT和Acod1-/- TINs之間這些基因的差異表達(dá)（圖6C）。用依康酸或其衍生物4OI和DMI處理的BMDNs顯示出更高的Nrf2蛋白和其轉(zhuǎn)錄靶基因Gpx4、Gclc和Nqo1的表達(dá)。在用E0771 TES激活的BMDNs中，ML385增強(qiáng)了脂質(zhì)過氧化，而Nrf2活化劑NK252呈劑量依賴性地減少了脂質(zhì)過氧化。此外，ML385增加了WT TES激活的BMDNs的脂質(zhì)過氧化，并降低了細(xì)胞存活率，使其與經(jīng)ML385處理的Acod1-/- TES激活的BMDNs相當(dāng)（圖6D-F）。NK252降低了Acod1-/- BMDNs經(jīng)TES處理后的脂質(zhì)過氧化，并增加了細(xì)胞存活率，在100 uM濃度下減少了WT和Acod1-/- BMDNs之間的差異（圖6G-I）。與Acod1-/- BMDNs相比，WT BMDNs含有更多的谷胱甘肽，而外源的4OI或DMI顯著增加了兩種類型的BMDNs中的谷胱甘肽水平（圖6J和圖6K）。

6.Acod1通過激活Nrf2介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)答來減輕TIN的鐵死亡

7.Acod1的去除可增強(qiáng)適應(yīng)性免疫，增強(qiáng)免疫治療的效果

       Acod1去除對轉(zhuǎn)移的抑制效果依賴于適應(yīng)性免疫，因?yàn)镽ag1-/- Acod1+/+和Rag1-/- Acod1-/-小鼠顯示出相似的E0771-TR肺轉(zhuǎn)移負(fù)荷和存活時(shí)間（圖A-C）。由于Acod1缺乏削弱了TINs的功能，檢測Acod1去除對腫瘤浸潤T細(xì)胞和免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）對肺轉(zhuǎn)移的療效的影響。使用E0771-TR肺轉(zhuǎn)移模型，觀察到雖然Acod1去除和ICB（αPD1加αCTLA4）各自延長了小鼠的存活時(shí)間，但經(jīng)過ICB治療的Acod1-/-宿主顯示出顯著延長的存活時(shí)間（圖D）。在靜脈注射后的第15天進(jìn)行的免疫表型分析顯示，肺部的TIN密度在Acod1去除和ICB聯(lián)合治療中降低最顯著（圖E）。經(jīng)過ICB治療的Acod1-/-小鼠群體在轉(zhuǎn)移性腫瘤微環(huán)境中顯示出最有利的抗腫瘤T細(xì)胞免疫狀態(tài)，其特征是總CD8 + T細(xì)胞、IFNγ + CD8 + T細(xì)胞、Gzmb + CD8 + T細(xì)胞和總CD4 + T細(xì)胞的百分比最高，T regs的百分比最低（圖F）。經(jīng)過ICB治療的Mrp8-cre + Acod1 f/f小鼠的存活時(shí)間顯著長于經(jīng)ICB治療的Acod1 f/f小鼠的存活時(shí)間（圖G）。當(dāng)ICB治療的Mrp8-cre + Acod1 f/f小鼠接受Fer-1或安慰劑處理時(shí)，F(xiàn)er-1加速了攜帶轉(zhuǎn)移病變小鼠的死亡（圖H），這表明中性粒細(xì)胞中的Acod1去除通過上調(diào)中性粒細(xì)胞的鐵死亡來增強(qiáng)ICB的作用。Acod1的去除沒有改變PD-L1和Arg1的表達(dá)。來自肺轉(zhuǎn)移灶的WT和Acod1-/- TINs對CD4 +和CD8 + T細(xì)胞的抑制作用相似。來自攜帶轉(zhuǎn)移病變的WT和Acod1-/-小鼠的脾臟中性粒細(xì)胞對T細(xì)胞的抑制作用要弱得多，并且兩種基因型之間沒有差異。數(shù)據(jù)表明，Acod1的上調(diào)使TINs在轉(zhuǎn)移病灶中存活和持久存在，以通過TINs的其他機(jī)制持續(xù)執(zhí)行免疫抑制。

圖7.Acod1的去除可增強(qiáng)適應(yīng)性免疫，增強(qiáng)免疫治療的效果

結(jié)論

       作者發(fā)現(xiàn)免疫抑制性TIN通過上調(diào)Acod1和產(chǎn)生衣康酸酯在轉(zhuǎn)移性TME中存活，衣康酸酯激活Nrf2依賴性抗氧化反應(yīng)以逃避鐵死亡并在轉(zhuǎn)移中維持TIN 豐度。

實(shí)驗(yàn)方法

IPA分析，scRNA-seq，轉(zhuǎn)錄組學(xué)，免疫熒光，qRT-PCR，ROS定量分析，免疫表型分析，蛋白質(zhì)印跡分析，細(xì)胞培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)，小鼠腫瘤移植實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)

Zhao Y, Liu Z, Liu G, Zhang Y, Liu S, Gan D, et al. Neutrophils resist ferroptosis and promote breast cancer metastasis through aconitate decarboxylase 1. Cell Metab. 2023 Oct 3;35(10):1688-1703.e10. doi: 10.1016/j.cmet.2023.09.004.