Lin28b/Wnt5a軸通過癌相關(guān)成纖維細胞和腫瘤上皮細胞之間的串擾驅(qū)動胰腺癌

       腫瘤上皮細胞與腫瘤微環(huán)境（TME）之間的雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。本研究表明，Lin28b/let-7通路是調(diào)節(jié)腫瘤上皮中Wnt5a表達不可或缺的途徑，Wnt5a可以在癌相關(guān)成纖維細胞（CAFs）中分泌并上調(diào)Lin28b。此外，作者證明CAFs中的Lin28b通過誘導(dǎo)細胞因子PCSK9的產(chǎn)生來促進PDAC的生長。使用PDAC原位小鼠模型，作者發(fā)現(xiàn)CAFs中Lin28b的缺失降低了腫瘤重量，突出Lin28b在PDAC基質(zhì)中的重要性。因此，作者研究表明，Lin28b-Wnt5a軸在胰腺腫瘤上皮細胞和TME之間的雙向串擾中起關(guān)鍵作用，并導(dǎo)致促腫瘤發(fā)生的環(huán)境。本文于2023年10月發(fā)表于《Nature Communication》，IF:16.6，Q1。

技術(shù)路線

主要實驗結(jié)果

1、Lin28b可在PDAC的CAFs中高表達

       既往研究表明，LIN28B可促進PDAC細胞的生長，且LIN28B水平升高與PDAC患者預(yù)后不良相關(guān)。為進一步探討LIN28B在PDAC中的功能，作者對人PDAC組織微陣列（TMAs）進行免疫組化染色。作者發(fā)現(xiàn)80個PDAC樣本中有23個（28.75%）在腫瘤上皮細胞中表達高水平的LIN28B。值得注意的是，LIN28B的表達與晚期腫瘤分級和不良預(yù)后相關(guān)（圖1a-c）。同時，作者觀察到一個有趣的現(xiàn)象，即大多數(shù)LIN28B^high樣本（23個樣本中的22個）在基質(zhì)中也表現(xiàn)出了LIN28B的高表達（圖1d），這促使作者進一步探索LIN28B在PDAC基質(zhì)中的表達譜。以α-SMA表達為特征的癌相關(guān)成纖維細胞（CAFs）被認為是PDAC的主要基質(zhì)成分。因此，作者在TMAs上對α-SMA進行免疫熒光染色，觀察到LIN28B和α-SMA在LIN28B^high樣品中的共定位（圖1e），表明LIN28B在CAFs中的表達與其在腫瘤中的表達狀態(tài)高度相關(guān)。接下來，作者試圖在PDAC小鼠模型中驗證作者的發(fā)現(xiàn)。原代小鼠PDAC系14837T、14838T和15376T分別從基因工程C57BL/6小鼠（p48-Cre;tetO_LSL Kras^G12D;ROSA_rtTA;p53^L/+）中分離得到。作者發(fā)現(xiàn)Lin28b在15376T中高表達，而在14837T和14838T中不表達（圖1f, g）。接下來，作者將14837T、14838T和15376T植入小鼠胰腺，發(fā)現(xiàn)15376T的原位模型在腫瘤和間質(zhì)中都表達了高水平的Lin28b，而14837T和14838T腫瘤僅顯示背景水平的Lin28b染色（圖1h, j）。這些結(jié)果表明，Lin28b可以在CAFs中表達，盡管Lin28b通常被認為在胚胎組織或癌癥組織中高度表達。

圖1 Lin28b可在PDAC的CAFs中高表達

2、在條件培養(yǎng)基中誘導(dǎo)Lin28b在腫瘤細胞中的表達

       接下來，作者從原位腫瘤中分離出小鼠CAF細胞系（mCAFs，分別命名為14837CAFs、14838CAFs和15376CAFs）。然而，作者發(fā)現(xiàn)在這些體外培養(yǎng)的細胞系中幾乎檢測不到Lin28b，這與免疫熒光數(shù)據(jù)不一致（圖2a，b）。作者懷疑PDAC細胞可能在維持基質(zhì)Lin28b表達方面發(fā)揮作用。因此，mCAFs與小鼠PDAC系共培養(yǎng)以模擬體內(nèi)環(huán)境。有趣的是，Lin28b可以在與15376T共培養(yǎng)的CAFs中被誘導(dǎo)，而非與14837T或14838T，這表明Lin28b在CAFs中的表達與其在腫瘤中的表達狀態(tài)有關(guān)（圖2a, b）。為了進一步證實作者的假設(shè)，作者將14837CAFs直接與15376T或14837T共培養(yǎng)6天，然后通過流式細胞術(shù)（FACS）進行分類（圖2c）。作者發(fā)現(xiàn)，當14837CAFs與15376T共培養(yǎng)時，Lin28b的表達增加，而與14837T共培養(yǎng)時，Lin28b的表達沒有增加（圖2d）。此外，作者從15376T開始用條件培養(yǎng)基（CM）處理CAFs 6天，也發(fā)現(xiàn)15376T-CM逐漸上調(diào)了Lin28b的表達（圖2e-j）。此外，15376T-CM在15376T中去除Lin28b后，其增加CAFs中Lin28b表達的能力被取消（圖2k, l）。接下來，作者試圖在人類PDAC中驗證作者的發(fā)現(xiàn)。作者測量了LIN28B在人PDAC細胞系中的表達，發(fā)現(xiàn)LIN28B在PANC-1和PANC03.27中高表達，而在ASPC-1、Mia Paca-2、PaTu8988T和PaTu8988S中不表達（圖2m, n）。此外，作者從2例患者中分離出人PDAC細胞系，發(fā)現(xiàn)LIN28B在hPDAC1^#中高表達，而在hPDAC2^#中不表達（圖2m, n）。在人PDAC中也發(fā)現(xiàn)了類似的數(shù)據(jù)，如PANC-1，PANC03.27和hPDAC1^#中的CM以LIN28B依賴的方式誘導(dǎo)人CAFs （hCAFs）中LIN28B的表達（圖2p - r），證實腫瘤上皮中LIN28B的缺失導(dǎo)致人和小鼠PDAC中CAFs中LIN28B的失活。為了在體內(nèi)驗證這一現(xiàn)象，作者將15376T或Lin28b-KO 15376T注射到小鼠胰腺中。免疫熒光染色顯示，在原位模型中，在腫瘤中沉默Lin28b可降低間質(zhì)Lin28b的表達（圖2s）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明具有高水平Lin28b （Lin28bhigh）的腫瘤細胞可以上調(diào)間質(zhì)Lin28b的表達。

圖2 在條件培養(yǎng)基中誘導(dǎo)Lin28b在腫瘤細胞中的表達

3、Lin28b^high的PDAC細胞分泌Wnt5a誘導(dǎo)CAFs中Lin28b的表達

       然后，作者利用15376T、Lin28b- KO、15376T和14837T的RNA測序（RNA-seq）進一步了解腫瘤細胞上調(diào)基質(zhì)Lin28b表達的機制。與Lin28b-KO 15376T和14837T相比，15376T中發(fā)現(xiàn)了66個上調(diào)基因（圖3a）。在這些基因中,作者注意到兩個可溶性Wnts （Wnt配體）,包括Wnt5a和Wnt10a，在15376T（圖3 b, c）和PANC-1（圖3 d, e）中上調(diào)。此外,Wnt5a和Wnt10a被酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）在Lin28b^high腫瘤但不是Lin28blow腫瘤的CM檢測到（圖3 f, g）。然后，作者試圖確認Wnt5a或Wnt10a在驅(qū)動CAFs中Lin28b表達中的作用。如圖3h - 1所示，在腫瘤中敲除Wnt5a而不敲除Wnt10a可抑制腫瘤細胞誘導(dǎo)CAFs中Lin28b表達的能力，突出了Wnt5a在誘導(dǎo)Lin28b中的作用。此外，作者發(fā)現(xiàn)重組-Wnt5a上調(diào)了CAFs中Lin28b的表達（圖3m-q），而用中和抗體阻斷Wnt5a信號通路會減弱15376T- CM上調(diào)CAFs中Lin28b表達的能力（圖3r, s）。接下來，作者通過將15376T和Wnt5a- KO 15376T注射到小鼠胰腺來檢測Wnt5a在體內(nèi)的作用。免疫熒光染色顯示，在原位模型中，敲除腫瘤中的Wnt5a可降低間質(zhì)Lin28b的表達（圖3t）。

圖3 Lin28b^high的PDAC細胞分泌Wnt5a誘導(dǎo)CAFs中Lin28b的表達

4、Wnt5a-Fzd4-β-catenin通路在Lin28b誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用

       由于作者提供Wnt5a導(dǎo)致PDAC基質(zhì)中Lin28b活化的證據(jù)，作者接下來研究Wnt5a誘導(dǎo)Lin28b表達的機制。眾所周知，Wnt信號通路通常分為兩大類，β-catenin依賴的典型通路和β-catenin獨立的非典型通路。Wnt5a傳統(tǒng)上被認為是非標準WNT。然而，除了激活非典型信號通路外，據(jù)報道Wnt5a在Fzd4受體的存在下也能激活典型信號通路。因此，作者檢測了Fzd4的水平，發(fā)現(xiàn)Lin28b只能在Wnt5a和Fzd4高表達的腫瘤細胞系中檢測到（圖4a, b），這表明完整的Wnt5a-Fzd4通路是激活PDAC中Lin28b的必要條件。接下來，作者在CAFs中敲除Fzd4，發(fā)現(xiàn)15376T-CM和recombin- wnt5a都不能誘導(dǎo)Fzd4- KO CAFs中Lin28b的表達（圖4c, d）。為了進一步證實Fzd4的重要性，并考慮到CAF的異質(zhì)性，作者使用FACS從KPC （Kras^LSL-G12D+;Trp53^R172H/+;Pdx1-Cre）小鼠中分離出CAFs，然后使用Fzd4抗體將CAFs分離為Fzd4陽性和Fzd4陰性群體（圖4e）。同樣，Lin28b也只能在fzd4陽性的CAFs中被誘導(dǎo)表達（圖4f）。作者還發(fā)現(xiàn)，當誘導(dǎo)Lin28b表達時，β-catenin （Wnt通路中的細胞內(nèi)信號換能器）的水平在CAFs中上調(diào)（圖4g - i）。此外，Lin28b^high腫瘤CM和r-Wnt5a均可誘導(dǎo)CAFs中Lin28b啟動子中β-catenin的富集（圖j - l）。為了進一步檢測Wnt/β-catenin信號通路的激活情況，作者將T細胞因子/淋巴細胞增強因子結(jié)合因子（TCF/LEF）熒光素酶報告因子轉(zhuǎn)染到CAFs中，發(fā)現(xiàn)Lin28b^high腫瘤- CM和r-Wnt5a均能促進熒光素酶活性（圖4m），提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路被激活。此外，在CAFs中抑制β-catenin可減弱來自Lin28b^high腫瘤的CM誘導(dǎo)的Lin28b的表達（圖4n-s）。這些數(shù)據(jù)提示W(wǎng)nt5a-Fzd4-β-catenin通路在CAFs中刺激Lin28b表達起關(guān)鍵作用。

圖4 Wnt5a-Fzd4-β-catenin通路在Lin28b誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用

5、Lin28b陽性的CAFs促進胰腺癌的生長

       接下來，作者試圖探索Lin28b在CAFs中的作用。眾所周知，腫瘤對葡萄糖的快速消耗會導(dǎo)致葡萄糖缺乏的微環(huán)境。同時，在營養(yǎng)不良的TME中，CAFs可以分泌各種生長因子和代謝物，維持癌細胞的增殖。毫不奇怪，作者發(fā)現(xiàn)在葡萄糖限制條件下（2 mM葡萄糖），CAFs對PDAC增殖有積極作用，這再現(xiàn)了體內(nèi)嚴峻的腫瘤微環(huán)境（圖5a）。相比之下，在低糖處理下，Lin28b-KO CAFs不能挽救PDAC的增殖（圖5b）。然后，作者發(fā)現(xiàn)表達Lin28b的CAFs的CM能夠在葡萄糖限制條件下挽救腫瘤生長（圖5c, d）。接下來，將腫瘤細胞與不同類型的CAFs共同注射到小鼠胰腺中。15376T與Lin28b-KO 15376CAFs共注射，而不是與WT 15376CAFs共注射，可以減緩腫瘤在體內(nèi)的生長（圖5e-g）。此外，當與表達WT -Lin28b的CAFs共注射時，腫瘤（14837T）的生長顯著增加，而當PDAC細胞與14837CAFs或15376CAFs共注射時，腫瘤（14837T）的生長明顯減弱（圖5h, i）。這些發(fā)現(xiàn)表明，間質(zhì)Lin28b表達可能在PDAC生長中起關(guān)鍵作用。此外，由于作者的數(shù)據(jù)表明Wnt5a-Fzd4通路對于Lin28b的激活至關(guān)重要（圖4c, d, f），作者也測試了Fzd4在腫瘤生長中的作用。如圖5j-n所示，fzd4陽性的CAFs在體外和體內(nèi)均能挽救腫瘤的生長，說明fzd4介導(dǎo)的CAFs中Lin28b的表達促進了PDAC的生長。

       為了進一步證實Lin28b在CAFs中的作用，作者通過將Lin28b^fl/fl小鼠與FSP1-Cre小鼠雜交，建立了成纖維細胞特異性條件Lin28b敲除模型。然后將15376T植入野生型（WT）小鼠和FSP-Cre;Lin28b^fl/fl小鼠胰腺，對原位腫瘤進行免疫熒光染色。如圖5o所示，與WT小鼠相比，FSP-Cre;Lin28b^fl/fl小鼠中基質(zhì)Lin28b顯著下調(diào)。在PDAC原位模型中，與WT小鼠相比，FSP-Cre;Lin28b^fl/fl小鼠中生長的腫瘤明顯更?。▓D5p）。此外，在FSP-Cre;Lin28b^fl/fl小鼠中，Ki67-陽性細胞群顯著減少（圖5q, r），表明lin28b陽性CAFs促進了體內(nèi)PDAC的生長。

圖5 Lin28b陽性的CAFs促進胰腺癌的生長

6、CAFs分泌Pcsk9促進PDAC生長

       為了進一步研究Lin28b陽性CAFs促進PDAC生長的機制，作者將CAFs- CM進行了三次凍解凍循環(huán)（- 80°C, 60°C）或加熱（100°C, 15分鐘），發(fā)現(xiàn)增加PDAC增殖的能力被取消（圖6a）。此外，通過3-kDa切斷柱過濾CAFs-CM，在CAFs-CM的>3-kDa部分保留促瘤活性（圖6b）。因此，作者認為由CAFs分泌的細胞因子，而不是代謝物，在腫瘤生長中起作用。接下來，作者使用來自15376CAFs或Lin28b- KO 15376CAFs的CM進行了定量分泌組學(xué)分析，以鑒定Lin28b陽性CAFs分泌的細胞因子（圖6c）。在Lin28b- KO 15376CAFs中下調(diào)的分泌蛋白中，TargetScan （https://www.targetscan.org）預(yù)測了五個基因（Clu, Cxcl5, FN, PGRN和Pcsk9）作為Lin28b/let-7的直接靶點（圖6c）。為了進一步驗證這些基因是否受到Lin28b/let-7通路的調(diào)控，作者構(gòu)建了一個不能抑制let-7的小鼠Lin28b突變質(zhì)粒（圖6d、e）。突變體Lin28b包含5個突變（W34A、F43A、F61A、H159A和H181A），分布在冷休克結(jié)構(gòu)域（CSD）和CysCysHisCys （CCHC）鋅指RNA結(jié)合基元（人W36、F45、F63、H137和H159）。接下來，CRISPR/ Cas9抗性野生型Lin28b （flag-Lin28b- WT （r））和突變型Lin28b （flag-Lin28b- MU （r））在Lin28b缺失的細胞中過表達，作者發(fā)現(xiàn)flag-Lin28b- WT（r），而不是flag-Lin28b- MU（r），增加了Clu、Cxcl5、PGRN和Pcsk9的水平（圖6f-j）。此外，CAFs- CM中的PGRN和Pcsk9水平遠高于腫瘤- CM，因此作者重點研究了PGRN和Pcsk9在CAFs中的功能（圖6i, j）。用重組蛋白或中和抗體處理PDAC細胞發(fā)現(xiàn)，在限糖條件下，Pcsk9而不是PGRN增加了PDAC的增殖，這表明Pcsk9在調(diào)節(jié)腫瘤生長方面的作用（圖6k, l）。為了進一步驗證Pcsk9的功能，作者敲除了CAFs中的Pcsk9（圖6m）。值得注意的是，Pcsk9-KO CAFs不能在葡萄糖限制的培養(yǎng)基中挽救腫瘤生長（圖6n）。與體外實驗數(shù)據(jù)一致，PDAC細胞與Pcsk9-KO CAFs共注射時，原位腫瘤明顯小于野生型CAFs（圖6o - s）。作者還檢測了Pcsk9抑制劑alirocumab在原位模型中的療效，發(fā)現(xiàn)alirocumab可顯著抑制腫瘤生長（圖6t）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明lin28b陽性CAFs分泌的Pcsk9促進PDAC的生長。

圖6 CAFs分泌Pcsk9促進PDAC生長

7、Pcsk9是Lin28b/let-7的直接靶點

       接下來，作者試圖確定Pcsk9是否是Lin28b/let-7的直接靶點。表達Lin28b的CAFs-CM或Fzd4陽性的CAFs-CM中的Pcsk9水平遠高于不表達Lin28b或Fzd4陰性的CAFs的CM（圖7a-h）。作者發(fā)現(xiàn)flag-Lin28b-WT（r），而不是flag-Lin28b-MU（r），增加了被Lin28b敲除抑制的Pcsk9蛋白水平（圖7i）。此外，let-7a agomir降低Pcsk9, let-7 sponge增加Pcsk9，表明Pcsk9能夠受到Lin28b/let-7通路的調(diào)控（圖7j）。然后，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，let-7a agomir抑制了Pcsk9 mRNA野生型3’-UTR驅(qū)動的熒光素酶，但不影響突變型3’-UTR驅(qū)動的熒光素酶（圖7k, 1），表明Pcsk9是let-7a miRNAs的直接靶點。miRNAs主要通過促進mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯來調(diào)節(jié)基因表達。為了進一步探討Lin28b/let-7是否影響Pcsk9 mRNA的穩(wěn)定性，作者使用Actinomycin D阻斷轉(zhuǎn)錄，然后檢測mRNA水平。Lin28b敲除不影響Pcsk9 mRNA的降解，這表明Lin28b/let-7不調(diào)節(jié)Pcsk9 mRNA的降解（圖7m, n）。因此，作者研究Lin28b/let-7是否通過調(diào)節(jié)翻譯影響Pcsk9 蛋白水平。值得注意的是，Lin28b缺失減少了Pcsk9 mRNA在多體部分的存在，但在非翻譯核糖體部分增加了Pcsk9 mRNA的存在（圖7o）。此外，flag-Lin28b-WT（r）而不是flag-Lin28b-MU（r）誘導(dǎo)Pcsk9 mRNA向更重的多聚體部分轉(zhuǎn)移（圖7p）。這些結(jié)果表明，Lin28b/let-7調(diào)控的是Pcsk9的翻譯，而不是mRNA的穩(wěn)定性。此外，IHC染色顯示，與野生型小鼠相比，FSP-Cre;Lin28b^fl/fl小鼠的Pcsk9表達顯著降低，表明體內(nèi)Lin28b調(diào)節(jié)了CAFs中Pcsk9的表達（圖7q, r）。綜上所述，作者研究結(jié)果證實Pcsk9是CAFs中Lin28b/let-7的直接靶點。

圖7 Pcsk9是Lin28b/let-7的直接靶點

結(jié)論

       在這項研究中，作者發(fā)現(xiàn)胰腺癌細胞中Wnt5a和Lin28b之間存在正反饋回路（圖8）。研究表明Wnt5a可以作為腫瘤上皮細胞和CAFs之間的信號轉(zhuǎn)換器，Lin28b-Wnt5a軸在胰腺腫瘤上皮細胞和TME之間的雙向串擾中起關(guān)鍵作用，并導(dǎo)致促腫瘤發(fā)生的環(huán)境。

圖8 PDAC中Wnt5a和Lin28b之間的正反饋回路

實驗方法

轉(zhuǎn)基因小鼠細胞系；小鼠模型；細胞培養(yǎng)；直接接觸共培養(yǎng)和FACS；KPC CAFs 的流式細胞術(shù)及分選；間接共培養(yǎng)實驗（Transwell）；條件培養(yǎng)基（CM）；異種移植；抗體和試劑；實時熒光定量PCR（qPCR）基因表達分析；基因組DNA分離及基因型鑒定；Western Blotting；ELISA；CRISPR/Cas9 KO細胞系的生成；lentiviral-shRNA干擾；超表達質(zhì)粒；定量分泌組樣品制備及LC-MS/MS分析；分泌數(shù)據(jù)分析；RNA-seq分析；全外顯子組測序（WES）分析；miRNA靶基因的預(yù)測；染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）；質(zhì)粒構(gòu)建及熒光素酶測定；mRNA穩(wěn)定性分析；核糖體的蔗糖梯度分析；免疫組化染色；免疫熒光分析；馬森三色染色法。

參考文獻：

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