NAT10/ac4C/FOXP1通過重編程宮頸癌的糖酵解代謝促進惡性進展并促進免疫抑制
在免疫檢查點抑制劑（ICIs）（如抗-PD-1/PD-L1抗體）取得的突破性臨床成果的推動下，免疫療法近來已成為宮頸癌（CCa）的主要治療方法。由NAT10催化的 N4-乙酰胞苷（ac4C）修飾是癌癥中mRNA的一種重要轉錄后修飾。然而，它對CCa中免疫失調和腫瘤免疫療法反應的影響仍然是個謎。在本研究中，初步觀察到NAT10在CCa組織中的表達明顯增加，這在臨床上與不良預后有關。隨后研究發(fā)現(xiàn)，HOXC8 通過與其啟動子結合激活了NAT10，從而刺激FOXP1 mRNA的ac4C 修飾并提高其翻譯效率，最終導致誘導GLUT4和KHK的表達。此外，NAT10/ac4C/FOXP1軸活性導致糖酵解增加，CCa 細胞的乳酸分泌持續(xù)增加。富含乳酸的腫瘤微環(huán)境（TME）進一步增強了腫瘤浸潤調節(jié)性T細胞（Tregs）的免疫抑制特性。令人印象深刻的是，NAT10敲除增強了PD-L1阻斷劑介導的體內腫瘤消退效果。綜上所述，研究結果揭示了NAT10在啟動癌細胞糖酵解和免疫抑制之間的串聯(lián)過程中的致癌作用，它可以成為CCa中PD-1/PD-L1阻斷協(xié)同免疫療法的靶點。本文于2023年10月發(fā)表于《Advanced Science》，IF=15.1。
技術路線
實驗結果
1. NAT10在CCa中發(fā)揮潛在的致癌作用
首先，作者根據(jù)病理診斷結果，分析了由17例宮頸上皮內瘤變患者樣本、95例CCa患者樣本和32例對照組樣本組成的TMA，從而驗證了計算機結果。重要的是，作者的研究結果證實了NAT10蛋白在CCa標本中的表達上調（圖1a），而且這種異常上調與CCa患者較差的臨床病理特征有關，如腫瘤分期高（P<0.05）（圖1b）和淋巴結轉移（P<0.05）（圖1c）。此外，NAT10表達的增加與Ki-67表達的增加呈正相關（P<0.05）（圖1d），Ki-67是癌細胞增殖和預后不良的標志物。
為了描述NAT10高表達的CCa患者的突變情況，根據(jù)NAT10表達的中位水平分層比較了NAT10高表達組和NAT10低表達組的突變情況（插入/缺失/單核苷酸變異）。為了進行這項分析，研究人員使用卡方檢驗分析了通過SangerBox從TCGA數(shù)據(jù)庫下載的CCa患者數(shù)據(jù)。結果顯示，在NAT10表達上調的CCa組織中，TP53、UBR4、KRAS和FBN1等關鍵基因的突變率明顯高于NAT10低表達的CCa組織（圖1e）。顯然，NAT10在CCa中的表達與關鍵的免疫檢查點通路密切相關。ESTIMATE分析進一步表明，NAT10上調與CCa較低的ESTIMATE評分和基質評分相關，這表明NAT10在調節(jié)CCa腫瘤免疫中起著關鍵作用（圖1f-h）。為了研究NAT10對無病生存期（DFS）和總生存期（OS）的影響，作者從TCGA數(shù)據(jù)庫中檢索了CCa患者的生存數(shù)據(jù)。Kaplan-Meier生存分析顯示，NAT10的高表達與CCa患者的OS呈弱相關（P = 0.03），并與DFS縮短有關（P = 0.02）（圖1i,j）。
2. 轉錄因子（TF）HOXC8激活CCa中NAT10的轉錄
為闡明CCa中NAT10上調的機制，作者通過整合ATAC-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)確定了相關的TF（圖2a）。由于90%以上的CCa病例都是由于感染了高危HPV類型所致，作者利用集成基因組學瀏覽器（IGV）識別了NAT10轉錄起始位點（TSS）周圍可訪問染色質的信號，并旨在確定HFF-1（非癌對照）、H8（感染HPV16 E6和E7的非癌細胞）和SiHa（感染HPV16 E6和E7的CCa細胞）細胞中可訪問染色質區(qū)域的候選TF（圖2b）。通過利用HOMER算法從頭發(fā)現(xiàn)基團，作者確定了32個 TF基團，并將重點縮小到SiHa細胞中富集的基團。從三個不同組中生成的RNA-seq 熱圖顯示了幾個可能調控NAT10表達的潛在TF（圖2c-e）。通過重疊四個對比組中差異表達的TFs，HOXC8成為SiHa細胞中僅有的高表達TFs（圖 2f,g）。此外，TCGA分析表明，HOXC8 mRNA在CCa中表達明顯上調（P<0.05）（圖2h），這與癌癥分期和淋巴結轉移呈正相關（P<0.05）（圖2i,j）。值得注意的是，基因表達譜交互分析（GEPIA）顯示，HOXC8 mRNA水平與CCa中NAT10的表達水平呈正相關（P<0.05）（圖2k），而高水平的HOXC8 mRNA表達也與較短的DFS時間顯著相關（P<0.05）（圖2l）。
為了澄清這一關鍵TF對NAT10轉錄的影響，進行了雙熒光素酶試驗。共轉染 HOXC8和NAT10啟動子質粒可顯著提高熒光素酶活性，螢火蟲熒光素酶/腎熒光素酶比率證明了這一點，而在轉染載體對照質?；騿为氜D染NAT10啟動子質粒后，兩種CCa細胞系的熒光素酶活性都有所下降（圖2m）。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，Western 印跡結果表明，引入靶向HOXC8的特異性siRNA后，NAT10在CCa細胞中的表達明顯受到抑制（圖2n）。總之，這些數(shù)據(jù)有力地表明，HOXC8可通過與NAT10 啟動子區(qū)域結合并促進其轉錄，從而增加NAT10在CCa細胞中的表達（圖2o）。
3. NAT10基因敲除抑制體外和體內CCa細胞增殖、侵襲和轉移
如圖3a,b所示，CCa細胞中的NAT10水平明顯高于HFF-1細胞。免疫熒光檢測進一步表明，NAT10主要定位于細胞核內，沒有核輸出。為了闡明NAT10在CCa中的功能作用，作者利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)成功建立了穩(wěn)定的NAT10雜合敲除細胞系（NAT10+/- SiHa），并采用sgRNA敲除了NAT10在CaSki和U14 CCa細胞中的表達（圖3c）。如CCK-8試驗所示，NAT10的耗竭或抑制會顯著抑制細胞增殖（圖3d），而集落形成試驗則表明，體外敲除NAT10會大大削弱集落形成能力（圖 3e）。此外，Transwell試驗表明，抑制或敲除NAT10能有效抑制CCa細胞的遷移和侵襲（圖3f）。
為了進一步確定體外NAT10誘導的CCa細胞增殖是否賦予了體內腫瘤生長能力，作者使用標記有螢火蟲熒光素酶（-luc）的穩(wěn)定沉默NAT10的SiHa細胞（NAT10+/- SiHa）建立了裸鼠皮下異種移植模型。在皮下注射SiHa或NAT10+/- SiHa細胞的小鼠中，下調NAT10能明顯抑制腫瘤生長（圖3g）。體內研究結束后，切除腫瘤，觀察到NAT10基因敲除CCa腫瘤的生長率下降（圖3h）。此外，通過活體動物成像檢測到的熒光素酶信號強度每周顯著增加也證明了腫瘤的持續(xù)生長（圖3i,j）。這些觀察結果證實，NAT10具有致癌作用，可促進CCa細胞增殖、侵襲和轉移。
4． FOXP1是NAT10修飾ac4C的靶點，NAT10以ac4C依賴的方式增強其翻譯效率
作者對野生型和NAT10+/- SiHa細胞進行了acRIP-seq、RNA-seq和Ribo-seq分析，以鑒定CCa細胞中ac4C修飾的轉錄本，并揭示ac4C修飾促進CCa進展的分子機制（圖4a）。通過acRIP-seq分析，作者確定了808個ac4C峰，并利用MEME算法發(fā)現(xiàn)CXXCXXCXX主題在SiHa細胞中高度富集（圖4b）。此外，與SiHa細胞相比，在NAT10低表達的細胞中，ac4C在編碼區(qū)的分布從34.9%降至31.9%，在3′UTR 的分布從37.4% 增至45.5%（圖4c）。此外，對因NAT10基因敲除而顯著改變的 ac4C峰的注釋和分析表明，在NAT10基因沉默的SiHa細胞中，mRNA的總體ac4C 水平顯著下降（圖4d,e）。此外，通過京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析來分析差異表達基因（DEGs），結果顯示差異表達基因在以下通路中顯著富集：細胞粘附通路、癌癥通路、PI3K-Akt 信號通路、mRNA 監(jiān)控通路和HPV感染通路（圖 4f）。這一發(fā)現(xiàn)表明，RNA的ac4C修飾可能參與了CCa發(fā)育的調控。
此外，作者使用Ribo-seq評估了核糖體保護讀數(shù)所代表的每種mRNA的核糖體負載量（圖4g）。Ribo-seq分析結果表明，由于翻譯效率降低，ac4C 修飾水平降低導致轉錄下調（圖4h）。耐人尋味的是，在68個mRNA中，F(xiàn)OXP1 mRNA在NAT10 下調后表現(xiàn)出最明顯的變化，通過acRIP-seq、Ribo-seq和RNA-seq測定的轉錄本豐度分別降低了6.39倍、5.12倍和2.78倍（圖4i）。因此，考慮到ac4C修飾在CCa中的作用，以及通過IGV軟件可視化識別RNA上的ac4C修飾峰（圖4j），作者推測FOXP1可能是NAT10在CCa細胞中的一個關鍵靶標。
為了驗證FOXP1 mRNA是否是CCa細胞中ac4C修飾的直接靶標，進行了acRIP-qPCR試驗。與對照細胞相比，去除了NAT10的CCa細胞中FOXP1 mRNA上的ac4C 水平顯著降低（約10倍）（圖4k）。此外，作者構建了含有野生型FLAG標記的NAT10（NAT10-wt）或N-乙酰轉移酶修飾位點（del 558-753aa）突變的NAT10（NAT10-mut）序列的質粒（圖4l）。引入NAT10-wt而非NAT10-mut會增加FOXP1的表達（圖4m）。因此，這些結果共同表明，NAT10介導的ac4C修飾在CCa細胞中FOXP1 的上調過程中起著至關重要的作用。
然而，NAT10沉默導致CCa細胞中FOXP1蛋白水平顯著下降，而不影響其mRNA水平（圖4n,o）。因此，作者評估了CCa細胞中單個mRNA的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)NAT10 基因敲除并沒有顯著影響FOXP1轉錄本的穩(wěn)定性（圖4p）。考慮到Ribo-seq的結果，這些數(shù)據(jù)共同表明，NAT10介導的ac4C修飾可能會調節(jié)FOXP1的翻譯效率，而不是其mRNA的穩(wěn)定性。
5. 過表達FOXP1可逆轉NAT10缺乏對CCa細胞惡性表型的影響
由于FOXP1在CCa中的功能尚不明確，作者初步比較了20個CCa組織和20個正常宮頸上皮組織中的FOXP1蛋白水平，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，CCa組織中的FOXP1蛋白水平顯著升高（P<0.01）（圖5a）。通過GEPIA進行的Kaplan-Meier分析顯示，F(xiàn)OXP1 mRNA表達增加的CCa患者的DFS預后較差（P = 0.039）（圖5b）。最重要的是，F(xiàn)OXP1 的表達水平與CCa組織中NAT10的水平呈正相關（圖5c）。此外，與HFF-1細胞相比，F(xiàn)OXP1在SiHa和CaSki細胞中表達過高，而在U14細胞中FOXP1表達較低（圖3b）。敲除FOXP1顯著抑制了CCa細胞的增殖（圖5d）、遷移和侵襲（圖5e-g）。
為了進一步驗證FOXP1在NAT10介導的促進CCa進展中的作用，作者在敲除NAT10的SiHa和CaSki細胞上進行了過表達實驗（圖5h）。重要的是，遷移和侵襲實驗結果表明，過表達FOXP1能有效恢復NAT10敲除的CCa細胞的遷移和侵襲能力（圖5i-k）。此外，利用shFOXP1和NAT10+/- FOXP1 SiHa細胞建立了皮下腫瘤發(fā)生模型。與體內結果一致，該模型的結果證實，過表達FOXP1能減弱NAT10敲除對體內腫瘤生長的抑制作用（圖3g-j），進一步強調了NAT10催化的ac4C修飾在 CCa腫瘤發(fā)生中的關鍵作用?？傊@些數(shù)據(jù)強調了FOXP1上調在CCa惡性進展中的致癌功能；因此，F(xiàn)OXP1上調可改善NAT10敲除在CCa細胞中的抑瘤效應。
6. NAT10/ac4C/FOXP1軸通過靶向GLUT4和KHK促進糖酵解
CUT&Tag可生成高效的高分辨率測序文庫，用于分析各種染色質成分，作者利用CUT&Tag確定了在SiHa細胞中觀察到的幾乎所有峰的覆蓋范圍都小于1000bp（圖 6a），并且在整組位點，尤其是在TSS處顯示出中等強度的信號（圖6b）。此外，對所有峰的信號值進行了細致的計算，并生成了熱圖，表明信號強烈集中在富集位點附近（圖6c），其中基因啟動子區(qū)域（啟動子≤1000 bp）的富集程度最高（圖6d）。通過GO和KEGG分析鑒定FOXP1結合基因的細胞代謝過程（圖6e），作者推測 FOXP1可能在葡萄糖代謝中起著關鍵的調控作用，這促使作者研究參與糖酵解代謝的關鍵酶。
有趣的是，CUT&Tag測序數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)OXP1在參與糖酵解的GLUT4和KHK啟動子中具有強大的富集作用（圖6f），這在許多文獻中都有廣泛記載。此外，根據(jù) GEPIA對TCGA數(shù)據(jù)集的分析，CCa中GLUT4的表達與FOXP1和NAT10的表達呈正相關，而KHK的表達與NAT10的表達呈正相關（圖 6h，i）。此外，經(jīng)qRT-PCR（圖6j-m）和Western印跡（圖6n）證實，刪除NAT10或FOXP1會導致GLUT4和KHK在轉錄和翻譯水平上的表達受抑制，這表明FOXP1會調節(jié)GLUT4和KHK的表達。
為了研究NAT10在調節(jié)糖酵解以促進CCa細胞惡性行為中的作用，作者通過測量細胞外酸化率（ECAR）、葡萄糖消耗、乳酸鹽產(chǎn)生和ATP水平來評估糖酵解通量。如圖7a所示，NAT10 缺失的CCa細胞表現(xiàn)出明顯的葡萄糖消耗減少以及乳酸鹽和 ATP 生成減少。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，沉默F(xiàn)OXP1也導致葡萄糖消耗、乳酸鹽和ATP 生成減少（圖7b-d），而在NAT10敲除背景下過表達FOXP1時，糖酵解能力得到恢復（圖7e-h）。此外，ECAR 測量結果不僅驗證了NAT10或FOXP1基因敲除后CCa 細胞中糖酵解能力的下降（圖 7i-l），而且還表明過表達FOXP1可逆轉這種效應（圖 7m,n）然而，在轉染NAT10突變體的CCa細胞中觀察到的糖酵解代謝水平一直較低（圖7o,p），這表明NAT10催化的ac4C修飾對促進CCa中的糖酵解有重要作用。此外，由缺乏NAT10的細胞建立的SiHa腫瘤異種移植顯示NAT10、FOXP1、GLUT4 和KHK的染色顯著降低（圖7q）?？傊髡叩难芯拷Y果表明，ac4C修飾誘導的FOXP1上調可激活CCa細胞中GLUT4和KHK的轉錄，從而增強糖酵解活性。
7. NAT10/ac4C/FOXP1軸活性增加高度糖酵解腫瘤中的Treg浸潤
如上所述，作者的研究發(fā)現(xiàn)，NAT10和FOXP1的上調促進了CCa細胞的增殖、侵襲、遷移和糖酵解能力，這表明NAT10介導的FOXP1乙?；赡苁敲庖咛颖艿年P鍵（圖8a），生物信息學分析也表明了這一點（圖1g,h）。為了明確NAT10/ac4C/FOXP1軸與CCa中免疫抑制之間的關系（圖8a），對TMA核進行了PD-L1免疫組化染色和統(tǒng)計分析，結果顯示CCa患者中NAT10和PD-L1的表達呈正相關（圖8b,c）。此外，作者還通過 Western 印跡進一步驗證了CCa細胞中NAT10、FOXP1和PD-L1 之間的正相關性（圖8d）。為了評估靶向 NAT10/ac4C/FOXP1 軸對體內腫瘤進展的影響，作者用U14-kdNAT10和U14-oeFOXP1細胞在C57BL/6小鼠體內建立了皮下腫瘤模型，然后在植入后第10天和第13天用抗PD-L1抗體（每天2.5 mg kg-1）治療這些小鼠。有趣的是，在用IgG作為對照的小鼠中，NAT10的下調大大抑制了CCa的進展，而對照組和U14-oeFOXP1組之間的腫瘤生長沒有明顯差異（圖8e,f）。此外，為了研究與 NAT10 基因敲除聯(lián)合治療對抗 PD-L1 療效的潛在協(xié)同增效作用，作者還監(jiān)測了模型中不同組別抗PD-L1抗體治療后的腫瘤生長情況。值得注意的是，U14-kdNAT10組的腫瘤生長速度明顯慢于單藥治療組（圖8f,g）。因此，與NAT10/ac4C/FOXP1軸在促進免疫檢查點基因上調和隨后的免疫逃避中的作用一致，抑制該軸可導致PD-L1阻斷誘導的腫瘤消退，從而相應地抑制CCa的進展。聯(lián)合療法的療效遠遠優(yōu)于單一療法。
為了評估NAT10/ac4C/FOXP1軸在CCa的TME中誘導的免疫浸潤，作者通過對U14-Ctrl和U14-oeFOXP1模型樣本的RNA-seq分析，分析了免疫功能正常條件下NAT10誘導的FOXP1過表達的綜合分子譜。根據(jù)RNA-seq分析結果，作者對與TME相關的DEGs進行了GO富集分析，旨在評估TME的變化。如圖8h所示，DEGs主要富集在代謝過程、生物調控和免疫相關的GO項中，這與本研究之前的結果一致。此外，與對照組相比，U14-oeFOXP1組小鼠的組織中觀察到PD-L1上調，如火山圖所示（圖8i）；此外，包括 CTLA4、CXCL9、ARG1和FOXP3在內的幾個關鍵基因在U14-oeFOXP1 組小鼠的組織中上調，表明FOXP1的過度表達可能在檢查點基因表達中發(fā)揮了重要作用。
此外，作者還利用CIBERSORT算法對22種腫瘤浸潤免疫細胞（TIICs）進行了相關分析，發(fā)現(xiàn)CCa具有獨特的免疫表型特征。FOXP1和TIICs的差異表達和相關性分析結果表明，F(xiàn)OXP1過表達與Tregs和活化CD4+ T細胞的浸潤呈正相關，但與M1巨噬細胞、靜息NK細胞和靜息CD4+記憶T細胞的浸潤呈負相關（圖8j）。隨后，作者進行了流式細胞分析，發(fā)現(xiàn)FOXP1的上調能有效促進Treg在TME內的浸潤，而NAT10的敲除則顯示出相反的趨勢（圖8k,l）。綜合來看，差異表達和相關性分析進一步證實了FOXP1和NAT10與CCa組織中免疫抑制性TME密切相關的假設。隨后，在腫瘤切除一個月后，測量了TME內的乳酸水平，發(fā)現(xiàn)U14-oeFOXP1組明顯高于U14-Ctrl組，而U14-kdNAT10組則較低（圖8m）?？紤]到代謝失調與免疫細胞浸潤之間的相互影響，作者通過免疫組化方法檢測并驗證了不同組中PD-L1的表達，結果顯示U14-oeFOXP1組TME中PD-L1的表達呈上升趨勢（圖8n）。綜上所述，作者的研究結果表明了CCa中癌癥代謝與免疫反應之間的相互影響。具體來說，在CCa腫瘤中靶向NAT10-FOXP1軸不僅能阻礙腫瘤細胞的糖酵解，還能減少Treg群體向TME的浸潤，從而協(xié)同增強PD-L1阻斷劑的療效，最終阻止腫瘤進展。綜上所述，作者的研究結果表明了CCa中癌癥代謝與免疫反應之間的相互影響。具體來說，在CCa腫瘤中靶向NAT10-FOXP1軸不僅能阻礙腫瘤細胞的糖酵解，還能減少Treg群體向TME的浸潤，從而協(xié)同增強PD-L1阻斷劑的療效，最終阻止腫瘤進展。
結論
總之，作者提供了令人信服的體外和體內證據(jù)，揭示了NAT10在CCa進展過程中的致癌作用，并確定了作為一種重要的表觀轉錄調節(jié)因子，NAT10介導的腫瘤細胞ac4C修飾可上調TF FOXP1，從而增加Treg浸潤，并通過重編程糖酵解代謝促進CCa免疫抑制。此外，NAT10 基因敲除可通過損害腫瘤細胞糖酵解、減少乳酸生成和增強腫瘤組織間質內的免疫監(jiān)視來顯著提高PD-L1阻斷療法的療效，最終導致腫瘤消退。對NAT10介導的ac4C修飾的闡明有望極大地促進對CCa的進一步研究，并有助于開發(fā)前景廣闊的治療策略。
生信實驗
組織微陣列（TMA）構建、免疫細胞譜分析、
常規(guī)分子實驗
免疫組化和肝性染色、雙熒光素酶報告基因檢測、免疫熒光檢測、糖酵解測定、ac4C乙?；疪NA免疫沉淀、acRIP-qPCR、蛋白質印跡分析、定量逆轉錄PCR、mRNA穩(wěn)定性檢測、CHIP-qPCR
組學實驗
acRIP-seq、Ribo-seq、ATAC-seq 、CUT&Tag
細胞實驗
細胞培養(yǎng)、質粒構建、慢病毒生產(chǎn)和細胞轉導、細胞增殖檢測、transwell檢測、流式細胞術
動物模型及病理實驗
動物研究
參考文獻
Chen, X., Hao, Y., Liu, Y., Zhong, S., You, Y., Ao, K., Chong, T., Luo, X., Yin, M., Ye, M., He, H., Lu, A., Chen, J., Li, X., Zhang, J., Guo, X., NAT10/ac4C/FOXP1 Promotes Malignant Progression and Facilitates Immunosuppression by Reprogramming Glycolytic Metabolism in Cervical Cancer. Adv. Sci. 2023, 2302705.