NAT10/ac4C/FOXP1通過(guò)重編程宮頸癌的糖酵解代謝促進(jìn)惡性進(jìn)展并促進(jìn)免疫抑制

       在免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）（如抗-PD-1/PD-L1抗體）取得的突破性臨床成果的推動(dòng)下，免疫療法近來(lái)已成為宮頸癌（CCa）的主要治療方法。由NAT10催化的 N4-乙酰胞苷（ac4C）修飾是癌癥中mRNA的一種重要轉(zhuǎn)錄后修飾。然而，它對(duì)CCa中免疫失調(diào)和腫瘤免疫療法反應(yīng)的影響仍然是個(gè)謎。在本研究中，初步觀察到NAT10在CCa組織中的表達(dá)明顯增加，這在臨床上與不良預(yù)后有關(guān)。隨后研究發(fā)現(xiàn)，HOXC8 通過(guò)與其啟動(dòng)子結(jié)合激活了NAT10，從而刺激FOXP1 mRNA的ac4C 修飾并提高其翻譯效率，最終導(dǎo)致誘導(dǎo)GLUT4和KHK的表達(dá)。此外，NAT10/ac4C/FOXP1軸活性導(dǎo)致糖酵解增加，CCa 細(xì)胞的乳酸分泌持續(xù)增加。富含乳酸的腫瘤微環(huán)境（TME）進(jìn)一步增強(qiáng)了腫瘤浸潤(rùn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）的免疫抑制特性。令人印象深刻的是，NAT10敲除增強(qiáng)了PD-L1阻斷劑介導(dǎo)的體內(nèi)腫瘤消退效果。綜上所述，研究結(jié)果揭示了NAT10在啟動(dòng)癌細(xì)胞糖酵解和免疫抑制之間的串聯(lián)過(guò)程中的致癌作用，它可以成為CCa中PD-1/PD-L1阻斷協(xié)同免疫療法的靶點(diǎn)。本文于2023年10月發(fā)表于《Advanced Science》，IF=15.1。

技術(shù)路線

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.  NAT10在CCa中發(fā)揮潛在的致癌作用

       首先，作者根據(jù)病理診斷結(jié)果，分析了由17例宮頸上皮內(nèi)瘤變患者樣本、95例CCa患者樣本和32例對(duì)照組樣本組成的TMA，從而驗(yàn)證了計(jì)算機(jī)結(jié)果。重要的是，作者的研究結(jié)果證實(shí)了NAT10蛋白在CCa標(biāo)本中的表達(dá)上調(diào)（圖1a），而且這種異常上調(diào)與CCa患者較差的臨床病理特征有關(guān)，如腫瘤分期高（P<0.05）（圖1b）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P<0.05）（圖1c）。此外，NAT10表達(dá)的增加與Ki-67表達(dá)的增加呈正相關(guān)（P<0.05）（圖1d），Ki-67是癌細(xì)胞增殖和預(yù)后不良的標(biāo)志物。

       為了描述NAT10高表達(dá)的CCa患者的突變情況，根據(jù)NAT10表達(dá)的中位水平分層比較了NAT10高表達(dá)組和NAT10低表達(dá)組的突變情況（插入/缺失/單核苷酸變異）。為了進(jìn)行這項(xiàng)分析，研究人員使用卡方檢驗(yàn)分析了通過(guò)SangerBox從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載的CCa患者數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，在NAT10表達(dá)上調(diào)的CCa組織中，TP53、UBR4、KRAS和FBN1等關(guān)鍵基因的突變率明顯高于NAT10低表達(dá)的CCa組織（圖1e）。顯然，NAT10在CCa中的表達(dá)與關(guān)鍵的免疫檢查點(diǎn)通路密切相關(guān)。ESTIMATE分析進(jìn)一步表明，NAT10上調(diào)與CCa較低的ESTIMATE評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分相關(guān)，這表明NAT10在調(diào)節(jié)CCa腫瘤免疫中起著關(guān)鍵作用（圖1f-h）。為了研究NAT10對(duì)無(wú)病生存期（DFS）和總生存期（OS）的影響，作者從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索了CCa患者的生存數(shù)據(jù)。Kaplan-Meier生存分析顯示，NAT10的高表達(dá)與CCa患者的OS呈弱相關(guān)（P = 0.03），并與DFS縮短有關(guān)（P = 0.02）（圖1i,j）。

2. 轉(zhuǎn)錄因子（TF）HOXC8激活CCa中NAT10的轉(zhuǎn)錄

       為闡明CCa中NAT10上調(diào)的機(jī)制，作者通過(guò)整合ATAC-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)確定了相關(guān)的TF（圖2a）。由于90%以上的CCa病例都是由于感染了高危HPV類型所致，作者利用集成基因組學(xué)瀏覽器（IGV）識(shí)別了NAT10轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）周圍可訪問(wèn)染色質(zhì)的信號(hào)，并旨在確定HFF-1（非癌對(duì)照）、H8（感染HPV16 E6和E7的非癌細(xì)胞）和SiHa（感染HPV16 E6和E7的CCa細(xì)胞）細(xì)胞中可訪問(wèn)染色質(zhì)區(qū)域的候選TF（圖2b）。通過(guò)利用HOMER算法從頭發(fā)現(xiàn)基團(tuán)，作者確定了32個(gè) TF基團(tuán)，并將重點(diǎn)縮小到SiHa細(xì)胞中富集的基團(tuán)。從三個(gè)不同組中生成的RNA-seq 熱圖顯示了幾個(gè)可能調(diào)控NAT10表達(dá)的潛在TF（圖2c-e）。通過(guò)重疊四個(gè)對(duì)比組中差異表達(dá)的TFs，HOXC8成為SiHa細(xì)胞中僅有的高表達(dá)TFs（圖 2f,g）。此外，TCGA分析表明，HOXC8 mRNA在CCa中表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）（圖2h），這與癌癥分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P<0.05）（圖2i,j）。值得注意的是，基因表達(dá)譜交互分析（GEPIA）顯示，HOXC8 mRNA水平與CCa中NAT10的表達(dá)水平呈正相關(guān)（P<0.05）（圖2k），而高水平的HOXC8 mRNA表達(dá)也與較短的DFS時(shí)間顯著相關(guān)（P<0.05）（圖2l）。

       為了澄清這一關(guān)鍵TF對(duì)NAT10轉(zhuǎn)錄的影響，進(jìn)行了雙熒光素酶試驗(yàn)。共轉(zhuǎn)染 HOXC8和NAT10啟動(dòng)子質(zhì)?？娠@著提高熒光素酶活性，螢火蟲熒光素酶/腎熒光素酶比率證明了這一點(diǎn)，而在轉(zhuǎn)染載體對(duì)照質(zhì)?；騿为?dú)轉(zhuǎn)染NAT10啟動(dòng)子質(zhì)粒后，兩種CCa細(xì)胞系的熒光素酶活性都有所下降（圖2m）。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，Western 印跡結(jié)果表明，引入靶向HOXC8的特異性siRNA后，NAT10在CCa細(xì)胞中的表達(dá)明顯受到抑制（圖2n）?？傊?，這些數(shù)據(jù)有力地表明，HOXC8可通過(guò)與NAT10 啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而增加NAT10在CCa細(xì)胞中的表達(dá)（圖2o）。

3. NAT10基因敲除抑制體外和體內(nèi)CCa細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移

       如圖3a,b所示，CCa細(xì)胞中的NAT10水平明顯高于HFF-1細(xì)胞。免疫熒光檢測(cè)進(jìn)一步表明，NAT10主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，沒(méi)有核輸出。為了闡明NAT10在CCa中的功能作用，作者利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)成功建立了穩(wěn)定的NAT10雜合敲除細(xì)胞系（NAT10+/- SiHa），并采用sgRNA敲除了NAT10在CaSki和U14 CCa細(xì)胞中的表達(dá)（圖3c）。如CCK-8試驗(yàn)所示，NAT10的耗竭或抑制會(huì)顯著抑制細(xì)胞增殖（圖3d），而集落形成試驗(yàn)則表明，體外敲除NAT10會(huì)大大削弱集落形成能力（圖 3e）。此外，Transwell試驗(yàn)表明，抑制或敲除NAT10能有效抑制CCa細(xì)胞的遷移和侵襲（圖3f）。

       為了進(jìn)一步確定體外NAT10誘導(dǎo)的CCa細(xì)胞增殖是否賦予了體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)能力，作者使用標(biāo)記有螢火蟲熒光素酶（-luc）的穩(wěn)定沉默NAT10的SiHa細(xì)胞（NAT10+/- SiHa）建立了裸鼠皮下異種移植模型。在皮下注射SiHa或NAT10+/- SiHa細(xì)胞的小鼠中，下調(diào)NAT10能明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)（圖3g）。體內(nèi)研究結(jié)束后，切除腫瘤，觀察到NAT10基因敲除CCa腫瘤的生長(zhǎng)率下降（圖3h）。此外，通過(guò)活體動(dòng)物成像檢測(cè)到的熒光素酶信號(hào)強(qiáng)度每周顯著增加也證明了腫瘤的持續(xù)生長(zhǎng)（圖3i,j）。這些觀察結(jié)果證實(shí)，NAT10具有致癌作用，可促進(jìn)CCa細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

4． FOXP1是NAT10修飾ac4C的靶點(diǎn)，NAT10以ac4C依賴的方式增強(qiáng)其翻譯效率

       作者對(duì)野生型和NAT10+/- SiHa細(xì)胞進(jìn)行了acRIP-seq、RNA-seq和Ribo-seq分析，以鑒定CCa細(xì)胞中ac4C修飾的轉(zhuǎn)錄本，并揭示ac4C修飾促進(jìn)CCa進(jìn)展的分子機(jī)制（圖4a）。通過(guò)acRIP-seq分析，作者確定了808個(gè)ac4C峰，并利用MEME算法發(fā)現(xiàn)CXXCXXCXX主題在SiHa細(xì)胞中高度富集（圖4b）。此外，與SiHa細(xì)胞相比，在NAT10低表達(dá)的細(xì)胞中，ac4C在編碼區(qū)的分布從34.9%降至31.9%，在3′UTR 的分布從37.4% 增至45.5%（圖4c）。此外，對(duì)因NAT10基因敲除而顯著改變的 ac4C峰的注釋和分析表明，在NAT10基因沉默的SiHa細(xì)胞中，mRNA的總體ac4C 水平顯著下降（圖4d,e）。此外，通過(guò)京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析來(lái)分析差異表達(dá)基因（DEGs），結(jié)果顯示差異表達(dá)基因在以下通路中顯著富集：細(xì)胞粘附通路、癌癥通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、mRNA 監(jiān)控通路和HPV感染通路（圖 4f）。這一發(fā)現(xiàn)表明，RNA的ac4C修飾可能參與了CCa發(fā)育的調(diào)控。

       此外，作者使用Ribo-seq評(píng)估了核糖體保護(hù)讀數(shù)所代表的每種mRNA的核糖體負(fù)載量（圖4g）。Ribo-seq分析結(jié)果表明，由于翻譯效率降低，ac4C 修飾水平降低導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄下調(diào)（圖4h）。耐人尋味的是，在68個(gè)mRNA中，F(xiàn)OXP1 mRNA在NAT10 下調(diào)后表現(xiàn)出最明顯的變化，通過(guò)acRIP-seq、Ribo-seq和RNA-seq測(cè)定的轉(zhuǎn)錄本豐度分別降低了6.39倍、5.12倍和2.78倍（圖4i）。因此，考慮到ac4C修飾在CCa中的作用，以及通過(guò)IGV軟件可視化識(shí)別RNA上的ac4C修飾峰（圖4j），作者推測(cè)FOXP1可能是NAT10在CCa細(xì)胞中的一個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)。

       為了驗(yàn)證FOXP1 mRNA是否是CCa細(xì)胞中ac4C修飾的直接靶標(biāo)，進(jìn)行了acRIP-qPCR試驗(yàn)。與對(duì)照細(xì)胞相比，去除了NAT10的CCa細(xì)胞中FOXP1 mRNA上的ac4C 水平顯著降低（約10倍）（圖4k）。此外，作者構(gòu)建了含有野生型FLAG標(biāo)記的NAT10（NAT10-wt）或N-乙酰轉(zhuǎn)移酶修飾位點(diǎn)（del 558-753aa）突變的NAT10（NAT10-mut）序列的質(zhì)粒（圖4l）。引入NAT10-wt而非NAT10-mut會(huì)增加FOXP1的表達(dá)（圖4m）。因此，這些結(jié)果共同表明，NAT10介導(dǎo)的ac4C修飾在CCa細(xì)胞中FOXP1 的上調(diào)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。

       然而，NAT10沉默導(dǎo)致CCa細(xì)胞中FOXP1蛋白水平顯著下降，而不影響其mRNA水平（圖4n,o）。因此，作者評(píng)估了CCa細(xì)胞中單個(gè)mRNA的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)NAT10 基因敲除并沒(méi)有顯著影響FOXP1轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性（圖4p）。考慮到Ribo-seq的結(jié)果，這些數(shù)據(jù)共同表明，NAT10介導(dǎo)的ac4C修飾可能會(huì)調(diào)節(jié)FOXP1的翻譯效率，而不是其mRNA的穩(wěn)定性。

5. 過(guò)表達(dá)FOXP1可逆轉(zhuǎn)NAT10缺乏對(duì)CCa細(xì)胞惡性表型的影響

       由于FOXP1在CCa中的功能尚不明確，作者初步比較了20個(gè)CCa組織和20個(gè)正常宮頸上皮組織中的FOXP1蛋白水平，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，CCa組織中的FOXP1蛋白水平顯著升高（P<0.01）（圖5a）。通過(guò)GEPIA進(jìn)行的Kaplan-Meier分析顯示，F(xiàn)OXP1 mRNA表達(dá)增加的CCa患者的DFS預(yù)后較差（P = 0.039）（圖5b）。最重要的是，F(xiàn)OXP1 的表達(dá)水平與CCa組織中NAT10的水平呈正相關(guān)（圖5c）。此外，與HFF-1細(xì)胞相比，F(xiàn)OXP1在SiHa和CaSki細(xì)胞中表達(dá)過(guò)高，而在U14細(xì)胞中FOXP1表達(dá)較低（圖3b）。敲除FOXP1顯著抑制了CCa細(xì)胞的增殖（圖5d）、遷移和侵襲（圖5e-g）。

       為了進(jìn)一步驗(yàn)證FOXP1在NAT10介導(dǎo)的促進(jìn)CCa進(jìn)展中的作用，作者在敲除NAT10的SiHa和CaSki細(xì)胞上進(jìn)行了過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)（圖5h）。重要的是，遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)FOXP1能有效恢復(fù)NAT10敲除的CCa細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖5i-k）。此外，利用shFOXP1和NAT10+/- FOXP1 SiHa細(xì)胞建立了皮下腫瘤發(fā)生模型。與體內(nèi)結(jié)果一致，該模型的結(jié)果證實(shí)，過(guò)表達(dá)FOXP1能減弱NAT10敲除對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用（圖3g-j），進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了NAT10催化的ac4C修飾在 CCa腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵作用?？傊?，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了FOXP1上調(diào)在CCa惡性進(jìn)展中的致癌功能；因此，F(xiàn)OXP1上調(diào)可改善NAT10敲除在CCa細(xì)胞中的抑瘤效應(yīng)。

6. NAT10/ac4C/FOXP1軸通過(guò)靶向GLUT4和KHK促進(jìn)糖酵解

       CUT&Tag可生成高效的高分辨率測(cè)序文庫(kù)，用于分析各種染色質(zhì)成分，作者利用CUT&Tag確定了在SiHa細(xì)胞中觀察到的幾乎所有峰的覆蓋范圍都小于1000bp（圖 6a），并且在整組位點(diǎn)，尤其是在TSS處顯示出中等強(qiáng)度的信號(hào)（圖6b）。此外，對(duì)所有峰的信號(hào)值進(jìn)行了細(xì)致的計(jì)算，并生成了熱圖，表明信號(hào)強(qiáng)烈集中在富集位點(diǎn)附近（圖6c），其中基因啟動(dòng)子區(qū)域（啟動(dòng)子≤1000 bp）的富集程度最高（圖6d）。通過(guò)GO和KEGG分析鑒定FOXP1結(jié)合基因的細(xì)胞代謝過(guò)程（圖6e），作者推測(cè) FOXP1可能在葡萄糖代謝中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，這促使作者研究參與糖酵解代謝的關(guān)鍵酶。

       有趣的是，CUT&Tag測(cè)序數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)OXP1在參與糖酵解的GLUT4和KHK啟動(dòng)子中具有強(qiáng)大的富集作用（圖6f），這在許多文獻(xiàn)中都有廣泛記載。此外，根據(jù) GEPIA對(duì)TCGA數(shù)據(jù)集的分析，CCa中GLUT4的表達(dá)與FOXP1和NAT10的表達(dá)呈正相關(guān)，而KHK的表達(dá)與NAT10的表達(dá)呈正相關(guān)（圖 6h，i）。此外，經(jīng)qRT-PCR（圖6j-m）和Western印跡（圖6n）證實(shí)，刪除NAT10或FOXP1會(huì)導(dǎo)致GLUT4和KHK在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的表達(dá)受抑制，這表明FOXP1會(huì)調(diào)節(jié)GLUT4和KHK的表達(dá)。

       為了研究NAT10在調(diào)節(jié)糖酵解以促進(jìn)CCa細(xì)胞惡性行為中的作用，作者通過(guò)測(cè)量細(xì)胞外酸化率（ECAR）、葡萄糖消耗、乳酸鹽產(chǎn)生和ATP水平來(lái)評(píng)估糖酵解通量。如圖7a所示，NAT10 缺失的CCa細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的葡萄糖消耗減少以及乳酸鹽和 ATP 生成減少。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，沉默F(xiàn)OXP1也導(dǎo)致葡萄糖消耗、乳酸鹽和ATP 生成減少（圖7b-d），而在NAT10敲除背景下過(guò)表達(dá)FOXP1時(shí)，糖酵解能力得到恢復(fù)（圖7e-h）。此外，ECAR 測(cè)量結(jié)果不僅驗(yàn)證了NAT10或FOXP1基因敲除后CCa 細(xì)胞中糖酵解能力的下降（圖 7i-l），而且還表明過(guò)表達(dá)FOXP1可逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)（圖 7m,n）然而，在轉(zhuǎn)染NAT10突變體的CCa細(xì)胞中觀察到的糖酵解代謝水平一直較低（圖7o,p），這表明NAT10催化的ac4C修飾對(duì)促進(jìn)CCa中的糖酵解有重要作用。此外，由缺乏NAT10的細(xì)胞建立的SiHa腫瘤異種移植顯示NAT10、FOXP1、GLUT4 和KHK的染色顯著降低（圖7q）?？傊?，作者的研究結(jié)果表明，ac4C修飾誘導(dǎo)的FOXP1上調(diào)可激活CCa細(xì)胞中GLUT4和KHK的轉(zhuǎn)錄，從而增強(qiáng)糖酵解活性。

7. NAT10/ac4C/FOXP1軸活性增加高度糖酵解腫瘤中的Treg浸潤(rùn)

       如上所述，作者的研究發(fā)現(xiàn)，NAT10和FOXP1的上調(diào)促進(jìn)了CCa細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和糖酵解能力，這表明NAT10介導(dǎo)的FOXP1乙?；赡苁敲庖咛颖艿年P(guān)鍵（圖8a），生物信息學(xué)分析也表明了這一點(diǎn)（圖1g,h）。為了明確NAT10/ac4C/FOXP1軸與CCa中免疫抑制之間的關(guān)系（圖8a），對(duì)TMA核進(jìn)行了PD-L1免疫組化染色和統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示CCa患者中NAT10和PD-L1的表達(dá)呈正相關(guān)（圖8b,c）。此外，作者還通過(guò) Western 印跡進(jìn)一步驗(yàn)證了CCa細(xì)胞中NAT10、FOXP1和PD-L1 之間的正相關(guān)性（圖8d）。為了評(píng)估靶向 NAT10/ac4C/FOXP1 軸對(duì)體內(nèi)腫瘤進(jìn)展的影響，作者用U14-kdNAT10和U14-oeFOXP1細(xì)胞在C57BL/6小鼠體內(nèi)建立了皮下腫瘤模型，然后在植入后第10天和第13天用抗PD-L1抗體（每天2.5 mg kg^-1）治療這些小鼠。有趣的是，在用IgG作為對(duì)照的小鼠中，NAT10的下調(diào)大大抑制了CCa的進(jìn)展，而對(duì)照組和U14-oeFOXP1組之間的腫瘤生長(zhǎng)沒(méi)有明顯差異（圖8e,f）。此外，為了研究與 NAT10 基因敲除聯(lián)合治療對(duì)抗 PD-L1 療效的潛在協(xié)同增效作用，作者還監(jiān)測(cè)了模型中不同組別抗PD-L1抗體治療后的腫瘤生長(zhǎng)情況。值得注意的是，U14-kdNAT10組的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯慢于單藥治療組（圖8f,g）。因此，與NAT10/ac4C/FOXP1軸在促進(jìn)免疫檢查點(diǎn)基因上調(diào)和隨后的免疫逃避中的作用一致，抑制該軸可導(dǎo)致PD-L1阻斷誘導(dǎo)的腫瘤消退，從而相應(yīng)地抑制CCa的進(jìn)展。聯(lián)合療法的療效遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于單一療法。

       為了評(píng)估NAT10/ac4C/FOXP1軸在CCa的TME中誘導(dǎo)的免疫浸潤(rùn)，作者通過(guò)對(duì)U14-Ctrl和U14-oeFOXP1模型樣本的RNA-seq分析，分析了免疫功能正常條件下NAT10誘導(dǎo)的FOXP1過(guò)表達(dá)的綜合分子譜。根據(jù)RNA-seq分析結(jié)果，作者對(duì)與TME相關(guān)的DEGs進(jìn)行了GO富集分析，旨在評(píng)估TME的變化。如圖8h所示，DEGs主要富集在代謝過(guò)程、生物調(diào)控和免疫相關(guān)的GO項(xiàng)中，這與本研究之前的結(jié)果一致。此外，與對(duì)照組相比，U14-oeFOXP1組小鼠的組織中觀察到PD-L1上調(diào)，如火山圖所示（圖8i）；此外，包括 CTLA4、CXCL9、ARG1和FOXP3在內(nèi)的幾個(gè)關(guān)鍵基因在U14-oeFOXP1 組小鼠的組織中上調(diào)，表明FOXP1的過(guò)度表達(dá)可能在檢查點(diǎn)基因表達(dá)中發(fā)揮了重要作用。

       此外，作者還利用CIBERSORT算法對(duì)22種腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞（TIICs）進(jìn)行了相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)CCa具有獨(dú)特的免疫表型特征。FOXP1和TIICs的差異表達(dá)和相關(guān)性分析結(jié)果表明，F(xiàn)OXP1過(guò)表達(dá)與Tregs和活化CD4+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)呈正相關(guān)，但與M1巨噬細(xì)胞、靜息NK細(xì)胞和靜息CD4+記憶T細(xì)胞的浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)（圖8j）。隨后，作者進(jìn)行了流式細(xì)胞分析，發(fā)現(xiàn)FOXP1的上調(diào)能有效促進(jìn)Treg在TME內(nèi)的浸潤(rùn)，而NAT10的敲除則顯示出相反的趨勢(shì)（圖8k,l）。綜合來(lái)看，差異表達(dá)和相關(guān)性分析進(jìn)一步證實(shí)了FOXP1和NAT10與CCa組織中免疫抑制性TME密切相關(guān)的假設(shè)。隨后，在腫瘤切除一個(gè)月后，測(cè)量了TME內(nèi)的乳酸水平，發(fā)現(xiàn)U14-oeFOXP1組明顯高于U14-Ctrl組，而U14-kdNAT10組則較低（圖8m）。考慮到代謝失調(diào)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相互影響，作者通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)并驗(yàn)證了不同組中PD-L1的表達(dá)，結(jié)果顯示U14-oeFOXP1組TME中PD-L1的表達(dá)呈上升趨勢(shì)（圖8n）。綜上所述，作者的研究結(jié)果表明了CCa中癌癥代謝與免疫反應(yīng)之間的相互影響。具體來(lái)說(shuō)，在CCa腫瘤中靶向NAT10-FOXP1軸不僅能阻礙腫瘤細(xì)胞的糖酵解，還能減少Treg群體向TME的浸潤(rùn)，從而協(xié)同增強(qiáng)PD-L1阻斷劑的療效，最終阻止腫瘤進(jìn)展。綜上所述，作者的研究結(jié)果表明了CCa中癌癥代謝與免疫反應(yīng)之間的相互影響。具體來(lái)說(shuō)，在CCa腫瘤中靶向NAT10-FOXP1軸不僅能阻礙腫瘤細(xì)胞的糖酵解，還能減少Treg群體向TME的浸潤(rùn)，從而協(xié)同增強(qiáng)PD-L1阻斷劑的療效，最終阻止腫瘤進(jìn)展。

結(jié)論

       總之，作者提供了令人信服的體外和體內(nèi)證據(jù)，揭示了NAT10在CCa進(jìn)展過(guò)程中的致癌作用，并確定了作為一種重要的表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，NAT10介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞ac4C修飾可上調(diào)TF FOXP1，從而增加Treg浸潤(rùn)，并通過(guò)重編程糖酵解代謝促進(jìn)CCa免疫抑制。此外，NAT10 基因敲除可通過(guò)損害腫瘤細(xì)胞糖酵解、減少乳酸生成和增強(qiáng)腫瘤組織間質(zhì)內(nèi)的免疫監(jiān)視來(lái)顯著提高PD-L1阻斷療法的療效，最終導(dǎo)致腫瘤消退。對(duì)NAT10介導(dǎo)的ac4C修飾的闡明有望極大地促進(jìn)對(duì)CCa的進(jìn)一步研究，并有助于開發(fā)前景廣闊的治療策略。

生信實(shí)驗(yàn)

組織微陣列（TMA）構(gòu)建、免疫細(xì)胞譜分析、

常規(guī)分子實(shí)驗(yàn)

免疫組化和肝性染色、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、免疫熒光檢測(cè)、糖酵解測(cè)定、ac4C乙?；疪NA免疫沉淀、acRIP-qPCR、蛋白質(zhì)印跡分析、定量逆轉(zhuǎn)錄PCR、mRNA穩(wěn)定性檢測(cè)、CHIP-qPCR

組學(xué)實(shí)驗(yàn)

acRIP-seq、Ribo-seq、ATAC-seq 、CUT&Tag

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒構(gòu)建、慢病毒生產(chǎn)和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖檢測(cè)、transwell檢測(cè)、流式細(xì)胞術(shù)

動(dòng)物模型及病理實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物研究 

參考文獻(xiàn)

Chen, X., Hao, Y., Liu, Y., Zhong, S., You, Y., Ao, K., Chong, T., Luo, X., Yin, M., Ye, M., He, H., Lu, A., Chen, J., Li, X., Zhang, J., Guo, X., NAT10/ac4C/FOXP1 Promotes Malignant Progression and Facilitates Immunosuppression by Reprogramming Glycolytic Metabolism in Cervical Cancer. Adv. Sci. 2023, 2302705.