β-HB治療通過(guò)改變糖酵解-乳酸代謝逆轉(zhuǎn)肝癌索拉非尼耐藥

       肝細(xì)胞癌（HCC）是最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。雖然索拉非尼和瑞戈非尼已分別被批準(zhǔn)用于晚期HCC患者的一線和二線治療，但長(zhǎng)期治療常導(dǎo)致獲得性耐藥。鑒于糖酵解介導(dǎo)的乳酸生成可導(dǎo)致耐藥并損害HCC治療效果，作者研究了酮體治療對(duì)索拉非尼耐藥HCC細(xì)胞代謝變化的影響。本研究發(fā)現(xiàn)3-羥甲基戊二酰基輔酶a合成酶2 （HMGCS2）和酮體D-β-HB在四個(gè)索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞株中差異表達(dá)。在索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞中，較低的HMGCS2和β-HB水平與較多的糖酵解改變和較高的乳酸生成相關(guān)。機(jī)制上，β-HB聯(lián)合索拉非尼或瑞戈非尼可通過(guò)抑制B-raf/絲裂原活化蛋白激酶通路和間質(zhì)n-鈣黏蛋白-波形蛋白軸促進(jìn)索拉非尼耐藥肝癌細(xì)胞的抗增殖和抗遷移能力。該研究于2023年9月發(fā)表在《Biomarker Research》，IF：11.1。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1. 4種HCC-SR細(xì)胞株中β-HB和HMGCS2基因表達(dá)的差異

       使用四種肝癌細(xì)胞系（Huh7，Sk-Hep-1，Hep3B和HepG2），首先評(píng)估了KB （β-HB和乙酰乙酸）水平在親代細(xì)胞和獲得性索拉非尼耐藥（SR）細(xì)胞之間的差異。與親代肝癌細(xì)胞相比，在Huh7-SR和Sk-Hep1-SR細(xì)胞中β-HB表達(dá)水平較低，而在Hep3B-SR和HepG2-SR細(xì)胞中β-HB表達(dá)水平較高（圖1A）。然而，在任何肝癌細(xì)胞系中，親本細(xì)胞和SR細(xì)胞之間的乙酰乙酸水平?jīng)]有顯著差異。此外，HMGCS2基因和蛋白水平在Huh7-SR和Sk-Hep1-SR細(xì)胞中下調(diào)，在Hep3B-SR和HepG2-SR細(xì)胞中上調(diào)（圖1B，C）。根據(jù)圖1A-C，將四種HCC-SR細(xì)胞系分為低HMGCS2/β-HB水平和高HMGCS2/β-HB水平兩組。然而，乙酰輔酶a主要通過(guò)兩條途徑形成:脂肪酸的β-氧化和糖酵解（圖1D）。為了確定脂肪酸合成是否與4種肝癌細(xì)胞系中β-HB的差異水平相關(guān)，分析了脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)。與親本細(xì)胞相比，四個(gè)HCC-SR細(xì)胞系的FAS表達(dá)沒有顯著差異，表明與乙酰輔酶a復(fù)氧化的弱相關(guān)性（圖1E）。與親本細(xì)胞相比，SCD1在四個(gè)HCC-SR細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，但DGAT1的表達(dá)沒有差異（圖1E）。此外，在四個(gè)親本細(xì)胞系和它們的SR細(xì)胞系之間，沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸水平的顯著差異（圖1F）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明HMGCS2和β-HB的差異水平不受脂肪酸氧化的調(diào)節(jié)。

       對(duì)1807個(gè)上調(diào)至少2倍的基因進(jìn)行的富集分子相互作用網(wǎng)絡(luò)分析表明，索拉非尼耐藥細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和傷口愈合網(wǎng)絡(luò)增加（圖2A）。為了進(jìn)一步了解肝癌細(xì)胞獲得性索拉非尼耐藥過(guò)程中可能受到影響的通路類型，KEGG通路富集分析顯示，傷口愈合信號(hào)通路、GDP -葡萄糖生物合成、葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸降解、p38 MAPK信號(hào)通路和ERK/MAPK信號(hào)通路在索拉非尼耐藥細(xì)胞中上調(diào)（圖2 B）。

圖1. 在4種HCC-SR細(xì)胞株中，不同水平的HMGCS2對(duì)β-HB的影響大于對(duì)乙酰乙酸的影響；此外，脂肪酸介導(dǎo)的通路與4種SR細(xì)胞株的β-HB水平無(wú)關(guān)

圖2. IPA分析索拉非尼耐藥Huh7細(xì)胞中上調(diào)的通路

2. 四種HCC-SR細(xì)胞系中不同的糖酵解移位和乳酸的產(chǎn)生

       糖酵解依賴的乙酰輔酶a形成是合成β-HB的另一個(gè)途徑（圖1D）。研究了四種HCC-SR細(xì)胞系中糖酵解調(diào)節(jié)分子之間的潛在關(guān)聯(lián)。與各自親本肝癌細(xì)胞株相比，四個(gè)肝癌-SR細(xì)胞株的己糖激酶I和II的蛋白水平較高，表明肝癌-SR細(xì)胞具有較高的糖酵解活性（圖3A，B）。磷酸果糖激酶在Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞中表達(dá)降低，而在Hep3B-SR和HepG2-SR細(xì)胞中表達(dá)升高（圖3A，B）。

       與各自的親本Huh7和Sk-Hep-1細(xì)胞相比，Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞的PDH蛋白水平降低（圖3A，B），而Hep3B-SR和HepG2-SR細(xì)胞的PDH蛋白水平升高。Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞的PDH mRNA水平始終低于其親本細(xì)胞（圖3C）。LDHA是一種乳酸合酶基因，在Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞中上調(diào)，但在Hep3B-SR和HepG2-SR細(xì)胞中下調(diào)（圖3A-C）。PDH和LDHA在4種HCC-SR細(xì)胞株中均有不同程度的表達(dá)。如圖2A所示，丙酮酸被LDHA轉(zhuǎn)化為乳酸。雖然與其親本HCC細(xì)胞相比，所有四個(gè)HCC-SR細(xì)胞系中的乳酸水平均增強(qiáng)，但Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞中的乳酸水平高3.5倍，而Hep3B-SR和HepG2-SR細(xì)胞中的乳酸水平僅高1.5倍（圖3D）。結(jié)合圖1和圖3的結(jié)果，可以將四株HCC-SR細(xì)胞分為兩組：Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞，其β-HB水平和PDH表達(dá)低于另一組，乳酸生成和LDHA表達(dá)高于另一組，即Hep3B-SR和HepG2-SR細(xì)胞。

圖3. PDH，LDHA和乳酸在四種HCC-SR細(xì)胞系中的差異表達(dá)

3. β-HB逆轉(zhuǎn)Huh7和Sk-Hep-1細(xì)胞糖酵解相關(guān)的索拉非尼耐藥

       在低水平的HMGCS2和β-HB HCC-SR細(xì)胞中觀察到高糖酵解和乳酸產(chǎn)生（圖1A-C）。因此研究β-HB處理是否改變Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞的糖酵解能力。β-HB處理增加Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞中PDH蛋白的表達(dá)水平，而LDHA水平?jīng)]有變化（圖4A，B）。在1%胎牛血清（FBS）培養(yǎng)基中培養(yǎng)Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞，β-HB處理顯著增強(qiáng)PDH和異檸檬酸脫氫酶（IDH）的表達(dá)，其中IDH是TCA循環(huán)中的限速酶，并降低LDHA的表達(dá)（圖4C，D）。檢測(cè)SR誘導(dǎo)的乳酸生成是否被β-HB處理逆轉(zhuǎn)。如圖4E所示，在β-HB處理的Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞中，觀察到乳酸水平的劑量依賴性降低。這些結(jié)果提示β-HB可能通過(guò)減弱糖酵解蛋白和乳酸生成改變肝癌-SR細(xì)胞的能量代謝。

圖4. β-HB處理改變Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞中PDH、LDHA和乳酸的表達(dá)水平

4. β-HB可逆轉(zhuǎn)HCC-SR細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥并增強(qiáng)其對(duì)瑞戈非尼的敏感性

       將不同劑量的β-HB與10 μM索拉非尼聯(lián)合處理Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞。如圖5 A所示，β-HB處理后細(xì)胞活力明顯降低，且呈劑量依賴性。進(jìn)一步用5 μM的瑞戈非尼聯(lián)合β-HB處理HCC-SR細(xì)胞。β-HB顯著增強(qiáng)了瑞戈非尼對(duì)HCC-SR細(xì)胞的細(xì)胞毒性（圖5B）。為進(jìn)一步闡明與β-HB和瑞戈非尼共同處理的SR細(xì)胞活性抑制相關(guān)的機(jī)制，分析MAPK介導(dǎo)的增殖和凋亡狀態(tài)的抑制。瑞戈非尼處理后，B-raf、MEK和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）的磷酸化水平下降，而β-HB-regorafenib聯(lián)合處理顯著降低B-raf、MEK和ERK的活化（圖5C、D）。Annexin V/PI染色顯示，β-HB處理不影響Huh7-SR和Sk-Hep-1- SR細(xì)胞的早期和晚期凋亡率（圖5E）。此外，在β-HB和瑞戈非尼共處理的SR細(xì)胞中，凋亡率并沒有增加（圖5F）。這些結(jié)果表明，β-HB處理通過(guò)抑制B-raf/MAPK通路而不是促進(jìn)凋亡來(lái)增強(qiáng)HCC-SR細(xì)胞的藥物敏感性。

圖5. β-HB通過(guò)抑制B-raf/MAPK通路逆轉(zhuǎn)Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥并增強(qiáng)瑞戈非尼的敏感性

5. β-HB通過(guò)抑制HCC-SR細(xì)胞的遷移能力和EMT，提高瑞戈非尼的細(xì)胞毒性作用

       單獨(dú)使用瑞戈非尼僅輕微抑制HCC-SR細(xì)胞的遷移，而聯(lián)合使用β-HB顯著抑制Huh7-SR和SkHep-1-SR細(xì)胞的遷移（圖6A-D）。EMT相關(guān)分子分析顯示，上皮相關(guān)標(biāo)志物β-catenin和zona occludens（ZO）-1的表達(dá)在β-HB和瑞戈非尼聯(lián)合處理的HCC-SR細(xì)胞和瑞戈非尼單獨(dú)處理的HCC-SR細(xì)胞之間沒有差異（圖6E，F(xiàn)）。然而，間質(zhì)標(biāo)志物vimentin和N-cadherin的表達(dá)在β-HB和瑞戈非尼聯(lián)合處理的細(xì)胞中降低（圖6E，F(xiàn)）。這些結(jié)果表明，β-HB處理通過(guò)調(diào)節(jié)EMT介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞-SR的遷移能力來(lái)增強(qiáng)瑞戈非尼的敏感性。

圖6. β-HB通過(guò)抑制Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞的N-cadherin/vimentin軸而增強(qiáng)瑞戈非尼的抗遷移作用

6. β-HB治療可下調(diào)體內(nèi)HCC-SR的增殖和代謝蛋白表達(dá)

       裸鼠移植瘤模型檢測(cè)β-HB是否抑制索拉非尼耐藥腫瘤的生長(zhǎng)。將皮下種植Sk-Hep-1-SR細(xì)胞的NOD/SCID小鼠分為3組：溶劑對(duì)照組、β-HB（300 mg/kg）處理組和β-HB（600 mg/kg）處理組。研究期間雖然β-HB治療對(duì)腫瘤的大小和重量沒有負(fù)面影響（圖7B，C），但增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的蛋白水平在β-HB治療的SR腫瘤中顯著降低（圖7D，E），這意味著β-HB具有抗增殖作用。此外，β-HB處理降低LDHA蛋白水平，增加PDH水平（圖7D，E）。相反，F(xiàn)AS蛋白表達(dá)模式在三組中相似（圖7D，E）。這些數(shù)據(jù)表明，β-HB處理通過(guò)改變糖酵解和乳酸信號(hào)通路損害HCC-SR細(xì)胞的增殖。

圖7. β-HB降低荷瘤小鼠PCNA和LDHA的表達(dá)，增加PDH的表達(dá)

結(jié)論

       綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)外源性β-HB可通過(guò)誘導(dǎo)糖酵解轉(zhuǎn)移減少乳酸生成，逆轉(zhuǎn)索拉非尼耐藥；它還與瑞戈非尼協(xié)同治療索拉非尼耐藥的HCC。

實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)，索拉非尼耐藥細(xì)胞的產(chǎn)生，細(xì)胞活力測(cè)定，WB，傷口愈合遷移試驗(yàn)，β-HB量化，乙酰乙酸鹽量化，乳酸量化，游離脂肪酸定量，RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)，免疫組化，IPA，細(xì)胞凋亡檢測(cè)

參考文獻(xiàn)

Suk FM, Wu CY, Fang CC, Chen TL, Liao YJ. β-HB treatment reverses sorafenib resistance by shifting glycolysis-lactate metabolism in HCC. Biomed Pharmacother. 2023 Oct;166:115293. doi: 10.1016/j.biopha.2023.115293. Epub 2023 Aug 9. PMID: 37567069.