肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。雖然索拉非尼和瑞戈非尼已分別被批準(zhǔn)用于晚期HCC患者的一線和二線治療,但長(zhǎng)期治療常導(dǎo)致獲得性耐藥。鑒于糖酵解介導(dǎo)的乳酸生成可導(dǎo)致耐藥并損害HCC治療效果,作者研究了酮體治療對(duì)索拉非尼耐藥HCC細(xì)胞代謝變化的影響。本研究發(fā)現(xiàn)3-羥甲基戊二?;o酶a合成酶2 (HMGCS2)和酮體D-β-HB在四個(gè)索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞株中差異表達(dá)。在索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞中,較低的HMGCS2和β-HB水平與較多的糖酵解改變和較高的乳酸生成相關(guān)。機(jī)制上,β-HB聯(lián)合索拉非尼或瑞戈非尼可通過抑制B-raf/絲裂原活化蛋白激酶通路和間質(zhì)n-鈣黏蛋白-波形蛋白軸促進(jìn)索拉非尼耐藥肝癌細(xì)胞的抗增殖和抗遷移能力。該研究于2023年9月發(fā)表在《Biomarker Research》,IF:11.1。
技術(shù)路線
主要研究結(jié)果
1. 4種HCC-SR細(xì)胞株中β-HB和HMGCS2基因表達(dá)的差異
使用四種肝癌細(xì)胞系(Huh7,Sk-Hep-1,Hep3B和HepG2),首先評(píng)估了KB (β-HB和乙酰乙酸)水平在親代細(xì)胞和獲得性索拉非尼耐藥(SR)細(xì)胞之間的差異。與親代肝癌細(xì)胞相比,在Huh7-SR和Sk-Hep1-SR細(xì)胞中β-HB表達(dá)水平較低,而在Hep3B-SR和HepG2-SR細(xì)胞中β-HB表達(dá)水平較高(圖1A)。然而,在任何肝癌細(xì)胞系中,親本細(xì)胞和SR細(xì)胞之間的乙酰乙酸水平?jīng)]有顯著差異。此外,HMGCS2基因和蛋白水平在Huh7-SR和Sk-Hep1-SR細(xì)胞中下調(diào),在Hep3B-SR和HepG2-SR細(xì)胞中上調(diào)(圖1B,C)。根據(jù)圖1A-C,將四種HCC-SR細(xì)胞系分為低HMGCS2/β-HB水平和高HMGCS2/β-HB水平兩組。然而,乙酰輔酶a主要通過兩條途徑形成:脂肪酸的β-氧化和糖酵解(圖1D)。為了確定脂肪酸合成是否與4種肝癌細(xì)胞系中β-HB的差異水平相關(guān),分析了脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)。與親本細(xì)胞相比,四個(gè)HCC-SR細(xì)胞系的FAS表達(dá)沒有顯著差異,表明與乙酰輔酶a復(fù)氧化的弱相關(guān)性(圖1E)。與親本細(xì)胞相比,SCD1在四個(gè)HCC-SR細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào),但DGAT1的表達(dá)沒有差異(圖1E)。此外,在四個(gè)親本細(xì)胞系和它們的SR細(xì)胞系之間,沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸水平的顯著差異(圖1F)。綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明HMGCS2和β-HB的差異水平不受脂肪酸氧化的調(diào)節(jié)。
對(duì)1807個(gè)上調(diào)至少2倍的基因進(jìn)行的富集分子相互作用網(wǎng)絡(luò)分析表明,索拉非尼耐藥細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和傷口愈合網(wǎng)絡(luò)增加(圖2A)。為了進(jìn)一步了解肝癌細(xì)胞獲得性索拉非尼耐藥過程中可能受到影響的通路類型,KEGG通路富集分析顯示,傷口愈合信號(hào)通路、GDP -葡萄糖生物合成、葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸降解、p38 MAPK信號(hào)通路和ERK/MAPK信號(hào)通路在索拉非尼耐藥細(xì)胞中上調(diào)(圖2 B)。
圖1. 在4種HCC-SR細(xì)胞株中,不同水平的HMGCS2對(duì)β-HB的影響大于對(duì)乙酰乙酸的影響;此外,脂肪酸介導(dǎo)的通路與4種SR細(xì)胞株的β-HB水平無關(guān)
圖2. IPA分析索拉非尼耐藥Huh7細(xì)胞中上調(diào)的通路
2. 四種HCC-SR細(xì)胞系中不同的糖酵解移位和乳酸的產(chǎn)生
糖酵解依賴的乙酰輔酶a形成是合成β-HB的另一個(gè)途徑(圖1D)。研究了四種HCC-SR細(xì)胞系中糖酵解調(diào)節(jié)分子之間的潛在關(guān)聯(lián)。與各自親本肝癌細(xì)胞株相比,四個(gè)肝癌-SR細(xì)胞株的己糖激酶I和II的蛋白水平較高,表明肝癌-SR細(xì)胞具有較高的糖酵解活性(圖3A,B)。磷酸果糖激酶在Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞中表達(dá)降低,而在Hep3B-SR和HepG2-SR細(xì)胞中表達(dá)升高(圖3A,B)。
與各自的親本Huh7和Sk-Hep-1細(xì)胞相比,Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞的PDH蛋白水平降低(圖3A,B),而Hep3B-SR和HepG2-SR細(xì)胞的PDH蛋白水平升高。Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞的PDH mRNA水平始終低于其親本細(xì)胞(圖3C)。LDHA是一種乳酸合酶基因,在Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞中上調(diào),但在Hep3B-SR和HepG2-SR細(xì)胞中下調(diào)(圖3A-C)。PDH和LDHA在4種HCC-SR細(xì)胞株中均有不同程度的表達(dá)。如圖2A所示,丙酮酸被LDHA轉(zhuǎn)化為乳酸。雖然與其親本HCC細(xì)胞相比,所有四個(gè)HCC-SR細(xì)胞系中的乳酸水平均增強(qiáng),但Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞中的乳酸水平高3.5倍,而Hep3B-SR和HepG2-SR細(xì)胞中的乳酸水平僅高1.5倍(圖3D)。結(jié)合圖1和圖3的結(jié)果,可以將四株HCC-SR細(xì)胞分為兩組:Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞,其β-HB水平和PDH表達(dá)低于另一組,乳酸生成和LDHA表達(dá)高于另一組,即Hep3B-SR和HepG2-SR細(xì)胞。
圖3. PDH,LDHA和乳酸在四種HCC-SR細(xì)胞系中的差異表達(dá)
3. β-HB逆轉(zhuǎn)Huh7和Sk-Hep-1細(xì)胞糖酵解相關(guān)的索拉非尼耐藥
在低水平的HMGCS2和β-HB HCC-SR細(xì)胞中觀察到高糖酵解和乳酸產(chǎn)生(圖1A-C)。因此研究β-HB處理是否改變Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞的糖酵解能力。β-HB處理增加Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞中PDH蛋白的表達(dá)水平,而LDHA水平?jīng)]有變化(圖4A,B)。在1%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基中培養(yǎng)Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞,β-HB處理顯著增強(qiáng)PDH和異檸檬酸脫氫酶(IDH)的表達(dá),其中IDH是TCA循環(huán)中的限速酶,并降低LDHA的表達(dá)(圖4C,D)。檢測(cè)SR誘導(dǎo)的乳酸生成是否被β-HB處理逆轉(zhuǎn)。如圖4E所示,在β-HB處理的Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞中,觀察到乳酸水平的劑量依賴性降低。這些結(jié)果提示β-HB可能通過減弱糖酵解蛋白和乳酸生成改變肝癌-SR細(xì)胞的能量代謝。
圖4. β-HB處理改變Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞中PDH、LDHA和乳酸的表達(dá)水平
4. β-HB可逆轉(zhuǎn)HCC-SR細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥并增強(qiáng)其對(duì)瑞戈非尼的敏感性
將不同劑量的β-HB與10 μM索拉非尼聯(lián)合處理Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞。如圖5 A所示,β-HB處理后細(xì)胞活力明顯降低,且呈劑量依賴性。進(jìn)一步用5 μM的瑞戈非尼聯(lián)合β-HB處理HCC-SR細(xì)胞。β-HB顯著增強(qiáng)了瑞戈非尼對(duì)HCC-SR細(xì)胞的細(xì)胞毒性(圖5B)。為進(jìn)一步闡明與β-HB和瑞戈非尼共同處理的SR細(xì)胞活性抑制相關(guān)的機(jī)制,分析MAPK介導(dǎo)的增殖和凋亡狀態(tài)的抑制。瑞戈非尼處理后,B-raf、MEK和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)的磷酸化水平下降,而β-HB-regorafenib聯(lián)合處理顯著降低B-raf、MEK和ERK的活化(圖5C、D)。Annexin V/PI染色顯示,β-HB處理不影響Huh7-SR和Sk-Hep-1- SR細(xì)胞的早期和晚期凋亡率(圖5E)。此外,在β-HB和瑞戈非尼共處理的SR細(xì)胞中,凋亡率并沒有增加(圖5F)。這些結(jié)果表明,β-HB處理通過抑制B-raf/MAPK通路而不是促進(jìn)凋亡來增強(qiáng)HCC-SR細(xì)胞的藥物敏感性。
圖5. β-HB通過抑制B-raf/MAPK通路逆轉(zhuǎn)Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥并增強(qiáng)瑞戈非尼的敏感性
5. β-HB通過抑制HCC-SR細(xì)胞的遷移能力和EMT,提高瑞戈非尼的細(xì)胞毒性作用
單獨(dú)使用瑞戈非尼僅輕微抑制HCC-SR細(xì)胞的遷移,而聯(lián)合使用β-HB顯著抑制Huh7-SR和SkHep-1-SR細(xì)胞的遷移(圖6A-D)。EMT相關(guān)分子分析顯示,上皮相關(guān)標(biāo)志物β-catenin和zona occludens(ZO)-1的表達(dá)在β-HB和瑞戈非尼聯(lián)合處理的HCC-SR細(xì)胞和瑞戈非尼單獨(dú)處理的HCC-SR細(xì)胞之間沒有差異(圖6E,F(xiàn))。然而,間質(zhì)標(biāo)志物vimentin和N-cadherin的表達(dá)在β-HB和瑞戈非尼聯(lián)合處理的細(xì)胞中降低(圖6E,F(xiàn))。這些結(jié)果表明,β-HB處理通過調(diào)節(jié)EMT介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞-SR的遷移能力來增強(qiáng)瑞戈非尼的敏感性。
圖6. β-HB通過抑制Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細(xì)胞的N-cadherin/vimentin軸而增強(qiáng)瑞戈非尼的抗遷移作用
6. β-HB治療可下調(diào)體內(nèi)HCC-SR的增殖和代謝蛋白表達(dá)
裸鼠移植瘤模型檢測(cè)β-HB是否抑制索拉非尼耐藥腫瘤的生長(zhǎng)。將皮下種植Sk-Hep-1-SR細(xì)胞的NOD/SCID小鼠分為3組:溶劑對(duì)照組、β-HB(300 mg/kg)處理組和β-HB(600 mg/kg)處理組。研究期間雖然β-HB治療對(duì)腫瘤的大小和重量沒有負(fù)面影響(圖7B,C),但增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的蛋白水平在β-HB治療的SR腫瘤中顯著降低(圖7D,E),這意味著β-HB具有抗增殖作用。此外,β-HB處理降低LDHA蛋白水平,增加PDH水平(圖7D,E)。相反,F(xiàn)AS蛋白表達(dá)模式在三組中相似(圖7D,E)。這些數(shù)據(jù)表明,β-HB處理通過改變糖酵解和乳酸信號(hào)通路損害HCC-SR細(xì)胞的增殖。
圖7. β-HB降低荷瘤小鼠PCNA和LDHA的表達(dá),增加PDH的表達(dá)
結(jié)論
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)外源性β-HB可通過誘導(dǎo)糖酵解轉(zhuǎn)移減少乳酸生成,逆轉(zhuǎn)索拉非尼耐藥;它還與瑞戈非尼協(xié)同治療索拉非尼耐藥的HCC。
實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞培養(yǎng),索拉非尼耐藥細(xì)胞的產(chǎn)生,細(xì)胞活力測(cè)定,WB,傷口愈合遷移試驗(yàn),β-HB量化,乙酰乙酸鹽量化,乳酸量化,游離脂肪酸定量,RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng),免疫組化,IPA,細(xì)胞凋亡檢測(cè)
參考文獻(xiàn)
Suk FM, Wu CY, Fang CC, Chen TL, Liao YJ. β-HB treatment reverses sorafenib resistance by shifting glycolysis-lactate metabolism in HCC. Biomed Pharmacother. 2023 Oct;166:115293. doi: 10.1016/j.biopha.2023.115293. Epub 2023 Aug 9. PMID: 37567069.