METTL16促進(jìn)膽管癌生長(zhǎng)

       m6A修飾與包括膽管癌(CCA)在內(nèi)的人類癌癥的進(jìn)展有關(guān)。METTL16最近被鑒定為一種新的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)m6A修飾，盡管METTL16在CCA中的作用尚未被研究。本研究旨在探討RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL16在CCA中的作用及其機(jī)制。我們觀察到METTL16在人CCA組織中的表達(dá)明顯增加。METTL16的缺失可顯著抑制CCA細(xì)胞增殖，降低腫瘤進(jìn)展。PRDM15被鑒定為CCA細(xì)胞中METTL16的關(guān)鍵靶點(diǎn)。從機(jī)制上講，我們的數(shù)據(jù)表明METTL16通過依賴YTHDF1的翻譯調(diào)節(jié)PRDM15蛋白的表達(dá)。我們觀察到恢復(fù)PRDM15的表達(dá)可以挽救METTL16缺失導(dǎo)致的CCA細(xì)胞增殖/集落形成缺陷。我們隨后的分析顯示，METTL16-PRDM15信號(hào)調(diào)節(jié)CCA細(xì)胞中FGFR4的表達(dá)。我們觀察到PRDM15蛋白與FGFR4啟動(dòng)子相關(guān)，以調(diào)節(jié)其表達(dá)。此外，我們發(fā)現(xiàn)在CCA細(xì)胞中，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300與轉(zhuǎn)錄因子YY1共同作用，通過組蛋白H3賴氨酸27 (H3K27)乙酰化調(diào)節(jié)METTL16基因的表達(dá)。本研究描述了一種新的METTL16-PRDM15-FGFR4信號(hào)軸，它對(duì)CCA生長(zhǎng)至關(guān)重要，可能具有重要的治療意義。我們發(fā)現(xiàn)，METTL16的缺失顯著抑制了CCA細(xì)胞的增殖并降低了腫瘤的進(jìn)展。本文于2023年10月發(fā)表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=11.3）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）METTL16在CCA中上調(diào)

       我們分析了METTL16在CCA和非腫瘤組織樣本中的表達(dá)。我們的分析表明，在TCGA-膽管癌(TCGA-CHOL)(圖1A)和GSE107943(圖1B)數(shù)據(jù)集中，與匹配或未匹配的非腫瘤組織相比，METTL16在CCA組織中的表達(dá)上調(diào)。對(duì)GSE107101數(shù)據(jù)集的分析顯示，與原發(fā)性CCA組織相比，晚期CCA組織中METTL16的表達(dá)水平更高(圖1C)。對(duì)TCGA-CHOL數(shù)據(jù)集中現(xiàn)有臨床數(shù)據(jù)的患者進(jìn)行進(jìn)一步的生存分析表明，CCA組織中METTL16的高表達(dá)往往與患者生存率較差相關(guān)(圖1D)。通過對(duì)人CCA組織中METTL16進(jìn)行免疫組化(IHC)染色，我們觀察到METTL16在CCA中的表達(dá)明顯高于正常膽管上皮(圖1E和1F)。這些臨床分析表明METTL16在CCA中具有潛在的致癌作用。

2）METTL16的缺失抑制CCA細(xì)胞生長(zhǎng)

       為了確定METTL16在CCA細(xì)胞中的功能作用，我們使用兩組siRNA在兩種人類CCA細(xì)胞系(CCLP1和HuCCT1)中敲低METTL16。Western blot分析證實(shí)了令人滿意的敲除效果(圖2A)。我們觀察到，METTL16的敲除導(dǎo)致CCA細(xì)胞增殖和集落形成能力顯著下降(圖2B和2C)。同時(shí)，我們使用CRISPR/Cas9基因編輯方法刪除了CCLP1和HuCCT1細(xì)胞中METTL16的表達(dá)(圖2D)。與siRNA敲低結(jié)果一致，CRISPR/Cas9導(dǎo)致METTL16的缺失也顯著降低了CCA細(xì)胞的增殖和集落形成(圖2E和2F)。這些結(jié)果證明了METTL16在體外CCA細(xì)胞生長(zhǎng)中的重要作用。然后，我們將CRISPR/cas9介導(dǎo)的METTL16敲除和對(duì)照CCA細(xì)胞皮下接種NOD/SCID小鼠。如圖3A至3F所示，在這種異種移植腫瘤模型中，METTL16的缺失顯著抑制了CCA的生長(zhǎng)。同時(shí)，我們采用了一種單獨(dú)的CCA異種移植模型，將人CCA細(xì)胞接種到NOD/SCID小鼠的肝臟中。我們觀察到，當(dāng)腫瘤細(xì)胞接種到肝臟中時(shí)，METTL16缺失也顯著抑制了CCA的生長(zhǎng)(圖3G-3I)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)證明了METTL16在體內(nèi)對(duì)CCA生長(zhǎng)的重要作用。

3）PRDM15是METTL16的直接靶點(diǎn)

       為了確定METTL16在CCA中致癌作用的潛在下游靶點(diǎn)，我們?cè)谌薈CA細(xì)胞(CCLP1和HuCCT1)中進(jìn)行了m6A甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序(MeRIP-seq)。通過分析m6A RNA-seq數(shù)據(jù)，我們鑒定出80個(gè)具有m6A RNA修飾的基因，這些基因在METTL16敲除后在這兩個(gè)細(xì)胞系中至少減少了1.5倍(圖4A(a))。對(duì)鑒定基因的GO富集分析顯示，在涉及甲基轉(zhuǎn)移酶活性的生物過程中存在富集(圖4A(b))。所鑒定的基因包括PRDM15、SETD5、KMT2D和NSD2，與正常組織相比，這些基因在CCA中的表達(dá)均上調(diào)。與對(duì)照細(xì)胞相比，METTL16缺失的細(xì)胞中與這4個(gè)基因相關(guān)的m6A峰的讀數(shù)降低(圖4A(c))。MeRIP-qPCR證實(shí)CCLP1和HuCCT1細(xì)胞中METTL16缺失后m6A水平顯著降低(圖4A(d))。Western blotting分析顯示，METTL16缺失降低了PRDM15的蛋白表達(dá)，而不影響SETD5、KMT2D和NSD2的蛋白水平(圖4B，C)。因此，PRDM15是CCA細(xì)胞中METTL16的直接靶點(diǎn)。敲低YTHDF1，而不敲低YTHDF3，會(huì)降低CCA細(xì)胞中PRDM15蛋白的表達(dá)(圖4D)。這些發(fā)現(xiàn)表明，YTHDF1在CCA細(xì)胞中調(diào)節(jié)PRDM15蛋白的表達(dá)。我們隨后進(jìn)行了RIP實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)顯示，YTHDF1蛋白能夠在CCA細(xì)胞中結(jié)合PRDM15 mRNA。值得注意的是，METTL16的缺失顯著降低了YTHDF1蛋白與PRDM15 mRNA之間的相互作用(圖4E)。為了進(jìn)一步確定YTHDF1在PRDM15翻譯中的作用，我們進(jìn)行了核糖體免疫沉淀試驗(yàn)。如圖4F所示，在對(duì)照細(xì)胞中，核糖體積累了PRDM15 mRNA，而在YTHDF1缺失的細(xì)胞中，PRDM15 mRNA的核糖體占用率顯著降低。這些結(jié)果表明，在CCA細(xì)胞中，METTL16通過RNA m6A修飾和YTHDF1依賴的翻譯機(jī)制調(diào)控PRDM15。

4）PRDM15參與METTL16介導(dǎo)的CCA細(xì)胞生長(zhǎng)

       為了證明PRDM15在CCA中的功能作用，我們分析了PRDM15缺失后CCA細(xì)胞的細(xì)胞增殖和集落形成能力。我們的數(shù)據(jù)顯示，PRDM15的缺失顯著抑制了CCA細(xì)胞的增殖和集落形成能力(圖5A-5C)?；谶@些結(jié)果，我們?cè)贛ETTL16缺失的CCA細(xì)胞中進(jìn)行了PRDM15強(qiáng)制過表達(dá)的拯救實(shí)驗(yàn)。我們觀察到，PRDM15的恢復(fù)能夠部分修復(fù)METTL16缺失引起的CCA細(xì)胞增殖/集落形成缺陷(圖5D-5F)。這些結(jié)果表明，PRDM15是CCA細(xì)胞中METTL16在功能上的重要靶點(diǎn)。

5）METTL16誘導(dǎo)的PRDM15調(diào)控FGFR4的表達(dá)

       由于PRDM15是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，我們?cè)噲D進(jìn)一步確定METTL16誘導(dǎo)的PRDM15在CCA細(xì)胞中的潛在下游靶點(diǎn)。為此，我們比較了CCA細(xì)胞中METTL16調(diào)控的基因(來自我們的RNA-Seq數(shù)據(jù))與PRDM15正相關(guān)的基因(來自TCGA-CHOL數(shù)據(jù)庫)。這種方法鑒定出19個(gè)METTL16調(diào)控的基因，它們?cè)贑CA中與PRDM15呈正相關(guān)(圖6A)。在已鑒定的19個(gè)基因中，我們選擇關(guān)注FGFR4，該基因已被充分證明在CCA中發(fā)揮重要作用。為了確定PRDM15對(duì)FGFR4表達(dá)的影響，我們分析了PRDM15缺失的CCA細(xì)胞中FGFR4的mRNA和蛋白表達(dá)。我們的數(shù)據(jù)顯示，PRDM15的缺失降低了FGFR4的mRNA和蛋白質(zhì)水平(圖6B和6C)。接下來，我們?cè)u(píng)估了FGFR4是否可能是PRDM15的直接靶點(diǎn)。為此，我們進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合譜分析，以尋找FGFR4基因啟動(dòng)子中可能的PRDM15結(jié)合位點(diǎn)。這項(xiàng)工作鑒定出了FGFR4啟動(dòng)子中三個(gè)推測(cè)的PRDM15結(jié)合位點(diǎn)(圖6D)。基于這些信息，我們進(jìn)行了ChIP-qPCR檢測(cè)，以確定其與FGFR4基因啟動(dòng)子的關(guān)聯(lián)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了PRDM15與CCA細(xì)胞中FGFR4基因啟動(dòng)子的結(jié)合(圖6D)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證METTL16-PRDM15對(duì)FGFR4的調(diào)控，我們檢測(cè)了METTL16缺失細(xì)胞中FGFR4的表達(dá)。我們的數(shù)據(jù)顯示，METTL16的缺失導(dǎo)致FGFR4表達(dá)的減少，而這種影響被PRDM15的強(qiáng)制過表達(dá)逆轉(zhuǎn)(圖6E)。與METTL16介導(dǎo)的PRDM15-FGFR4調(diào)節(jié)一致，我們的數(shù)據(jù)顯示，METTL16被其GapmeR反義寡核苷酸(ASO)消耗后，降低了CCA細(xì)胞中PRDM15和FGFR4的蛋白水平(圖6F)。此外，我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用FGFR4抑制劑BLU-554和METTL16 GapmeR ASO表現(xiàn)出更強(qiáng)的腫瘤抑制作用(圖6G)。

6）H3K27ac介導(dǎo)METTL16表達(dá)的調(diào)控

       鑒于METTL16在CCA細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加及其致癌作用，我們進(jìn)一步研究了METTL16在CCA細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)機(jī)制。我們使用UCSC基因組瀏覽器分析了METTL16啟動(dòng)子。分析顯示，METTL16基因的啟動(dòng)子區(qū)域高度富集了組蛋白H3賴氨酸27乙酰化(H3K27ac)(圖7A)。這一觀察結(jié)果表明，METTL16的表達(dá)可能在轉(zhuǎn)錄水平上受到組蛋白乙?；目刂?。通過使用抗H3K27ac進(jìn)行ChIP-qPCR檢測(cè)，我們?cè)贑CA細(xì)胞的METTL16啟動(dòng)子處發(fā)現(xiàn)了H3K27ac的增加(圖7B)。由于p300(也稱為EP300)和CBP是組蛋白乙?；匦璧?，我們使用抗p300和抗CBP分別進(jìn)行了ChIP-qPCR檢測(cè)；這些研究的結(jié)果證實(shí)了METTL16啟動(dòng)子上p300的富集，而不是CBP的富集(圖7C)?；谶@些結(jié)果，我們用p300抑制劑C646處理CCA細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。我們的數(shù)據(jù)顯示，用p300抑制劑C646處理CCA細(xì)胞顯著降低了METTL16啟動(dòng)子處的H3K27ac和p300富集(圖7D和7E)。相應(yīng)地，C646處理也降低了CCA細(xì)胞中METTL16 mRNA和蛋白水平(圖7F和7G)。這些發(fā)現(xiàn)表明，在CCA細(xì)胞中，p300介導(dǎo)的組蛋白H3賴氨酸27乙?；{(diào)節(jié)了METTL16的表達(dá)。

7）YY1與p300合作調(diào)控METTL16的表達(dá)

       由于p300通常被轉(zhuǎn)錄因子募集到靶基因啟動(dòng)子，我們進(jìn)一步研究了可能與p300協(xié)同調(diào)節(jié)CCA細(xì)胞中METTL16表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。通過分析BioGrid預(yù)測(cè)的p300相互作用因子和SwissRegulon預(yù)測(cè)的METTL16推定轉(zhuǎn)錄因子，我們檢測(cè)到這兩個(gè)數(shù)據(jù)集中共有13個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(圖8A)。通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中METTL16與CCA組織中鑒定的轉(zhuǎn)錄因子之間的相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn)CCA組織中有5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子與METTL16呈正相關(guān)，包括SP1、SP3、TBL1XR1、YY1、和ZBTB3(圖8B)。與非腫瘤組織相比，上述五種轉(zhuǎn)錄因子在CCA中升高(圖8C)，但在CCA中只有YY1的表達(dá)與患者生存相關(guān)(圖8D)。基于這些分析，我們進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證明YY1和P300在CCA細(xì)胞中的相互作用。如圖8E所示，免疫沉淀法證實(shí)p300與YY1在CCLP1和HuCCT1細(xì)胞中存在關(guān)聯(lián)。通過對(duì)JASPAR數(shù)據(jù)庫的分析，我們?cè)贛ETTL16的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)YY1結(jié)合位點(diǎn)(圖8F)。通過ChIP-qPCR檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)YY1能夠結(jié)合METTL16啟動(dòng)子上的這兩個(gè)位點(diǎn)。此外，我們觀察到用p300抑制劑C646處理CCA細(xì)胞可顯著降低YY1與METTL16啟動(dòng)子的結(jié)合(圖8F)。綜上所述，YY1與p300共同調(diào)控CCA細(xì)胞中METTL16基因的表達(dá)。

結(jié)論

       我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)揭示了一種新的METTL16-PRDM15-FGFR4信號(hào)軸，它與CCA有重要關(guān)系，可能作為新的治療靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法

qRT?PCR，Western blot，IHC，RIP，m6A測(cè)序，免疫沉淀，MeRIP-qPCR，ChIP，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)

Liu N, Zhang J, Chen W, Ma W, Wu T. The RNA methyltransferase METTL16 enhances cholangiocarcinoma growth through PRDM15-mediated FGFR4 expression. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Oct 11;42(1):263. doi: 10.1186/s13046-023-02844-5.