METTL16促進(jìn)膽管癌生長(cháng)

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2024-06-05
本研究旨在探討RNA甲基轉移酶METTL16在膽管癌中的作用及其機制......

 

       m6A修飾與包括膽管癌(CCA)在內的人類(lèi)癌癥的進(jìn)展有關(guān)。METTL16最近被鑒定為一種新的RNA甲基轉移酶,負責m6A修飾,盡管METTL16在CCA中的作用尚未被研究。本研究旨在探討RNA甲基轉移酶METTL16在CCA中的作用及其機制。我們觀(guān)察到METTL16在人CCA組織中的表達明顯增加。METTL16的缺失可顯著(zhù)抑制CCA細胞增殖,降低腫瘤進(jìn)展。PRDM15被鑒定為CCA細胞中METTL16的關(guān)鍵靶點(diǎn)。從機制上講,我們的數據表明METTL16通過(guò)依賴(lài)YTHDF1的翻譯調節PRDM15蛋白的表達。我們觀(guān)察到恢復PRDM15的表達可以挽救METTL16缺失導致的CCA細胞增殖/集落形成缺陷。我們隨后的分析顯示,METTL16-PRDM15信號調節CCA細胞中FGFR4的表達。我們觀(guān)察到PRDM15蛋白與FGFR4啟動(dòng)子相關(guān),以調節其表達。此外,我們發(fā)現在CCA細胞中,組蛋白乙酰轉移酶p300與轉錄因子YY1共同作用,通過(guò)組蛋白H3賴(lài)氨酸27 (H3K27)乙?;{節M(mǎn)ETTL16基因的表達。本研究描述了一種新的METTL16-PRDM15-FGFR4信號軸,它對CCA生長(cháng)至關(guān)重要,可能具有重要的治療意義。我們發(fā)現,METTL16的缺失顯著(zhù)抑制了CCA細胞的增殖并降低了腫瘤的進(jìn)展。本文于2023年10月發(fā)表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”(IF=11.3)上。

技術(shù)路線(xiàn)

 

 

 

結果

1)METTL16在CCA中上調

       我們分析了METTL16在CCA和非腫瘤組織樣本中的表達。我們的分析表明,在TCGA-膽管癌(TCGA-CHOL)(圖1A)和GSE107943(圖1B)數據集中,與匹配或未匹配的非腫瘤組織相比,METTL16在CCA組織中的表達上調。對GSE107101數據集的分析顯示,與原發(fā)性CCA組織相比,晚期CCA組織中METTL16的表達水平更高(圖1C)。對TCGA-CHOL數據集中現有臨床數據的患者進(jìn)行進(jìn)一步的生存分析表明,CCA組織中METTL16的高表達往往與患者生存率較差相關(guān)(圖1D)。通過(guò)對人CCA組織中METTL16進(jìn)行免疫組化(IHC)染色,我們觀(guān)察到METTL16在CCA中的表達明顯高于正常膽管上皮(圖1E和1F)。這些臨床分析表明METTL16在CCA中具有潛在的致癌作用。

 

 

 

2)METTL16的缺失抑制CCA細胞生長(cháng)

       為了確定METTL16在CCA細胞中的功能作用,我們使用兩組siRNA在兩種人類(lèi)CCA細胞系(CCLP1和HuCCT1)中敲低METTL16。Western blot分析證實(shí)了令人滿(mǎn)意的敲除效果(圖2A)。我們觀(guān)察到,METTL16的敲除導致CCA細胞增殖和集落形成能力顯著(zhù)下降(圖2B和2C)。同時(shí),我們使用CRISPR/Cas9基因編輯方法刪除了CCLP1和HuCCT1細胞中METTL16的表達(圖2D)。與siRNA敲低結果一致,CRISPR/Cas9導致METTL16的缺失也顯著(zhù)降低了CCA細胞的增殖和集落形成(圖2E和2F)。這些結果證明了METTL16在體外CCA細胞生長(cháng)中的重要作用。然后,我們將CRISPR/cas9介導的METTL16敲除和對照CCA細胞皮下接種NOD/SCID小鼠。如圖3A至3F所示,在這種異種移植腫瘤模型中,METTL16的缺失顯著(zhù)抑制了CCA的生長(cháng)。同時(shí),我們采用了一種單獨的CCA異種移植模型,將人CCA細胞接種到NOD/SCID小鼠的肝臟中。我們觀(guān)察到,當腫瘤細胞接種到肝臟中時(shí),METTL16缺失也顯著(zhù)抑制了CCA的生長(cháng)(圖3G-3I)。綜上所述,這些發(fā)現證明了METTL16在體內對CCA生長(cháng)的重要作用。

 

 

 

 

3)PRDM15是METTL16的直接靶點(diǎn)

       為了確定METTL16在CCA中致癌作用的潛在下游靶點(diǎn),我們在人CCA細胞(CCLP1和HuCCT1)中進(jìn)行了m6A甲基化RNA免疫沉淀測序(MeRIP-seq)。通過(guò)分析m6A RNA-seq數據,我們鑒定出80個(gè)具有m6A RNA修飾的基因,這些基因在METTL16敲除后在這兩個(gè)細胞系中至少減少了1.5倍(圖4A(a))。對鑒定基因的GO富集分析顯示,在涉及甲基轉移酶活性的生物過(guò)程中存在富集(圖4A(b))。所鑒定的基因包括PRDM15、SETD5、KMT2D和NSD2,與正常組織相比,這些基因在CCA中的表達均上調。與對照細胞相比,METTL16缺失的細胞中與這4個(gè)基因相關(guān)的m6A峰的讀數降低(圖4A(c))。MeRIP-qPCR證實(shí)CCLP1和HuCCT1細胞中METTL16缺失后m6A水平顯著(zhù)降低(圖4A(d))。Western blotting分析顯示,METTL16缺失降低了PRDM15的蛋白表達,而不影響SETD5、KMT2D和NSD2的蛋白水平(圖4B,C)。因此,PRDM15是CCA細胞中METTL16的直接靶點(diǎn)。敲低YTHDF1,而不敲低YTHDF3,會(huì )降低CCA細胞中PRDM15蛋白的表達(圖4D)。這些發(fā)現表明,YTHDF1在CCA細胞中調節PRDM15蛋白的表達。我們隨后進(jìn)行了RIP實(shí)驗。數據顯示,YTHDF1蛋白能夠在CCA細胞中結合PRDM15 mRNA。值得注意的是,METTL16的缺失顯著(zhù)降低了YTHDF1蛋白與PRDM15 mRNA之間的相互作用(圖4E)。為了進(jìn)一步確定YTHDF1在PRDM15翻譯中的作用,我們進(jìn)行了核糖體免疫沉淀試驗。如圖4F所示,在對照細胞中,核糖體積累了PRDM15 mRNA,而在YTHDF1缺失的細胞中,PRDM15 mRNA的核糖體占用率顯著(zhù)降低。這些結果表明,在CCA細胞中,METTL16通過(guò)RNA m6A修飾和YTHDF1依賴(lài)的翻譯機制調控PRDM15。

 

 

 

4)PRDM15參與METTL16介導CCA細胞生長(cháng)

       為了證明PRDM15在CCA中的功能作用,我們分析了PRDM15缺失后CCA細胞的細胞增殖和集落形成能力。我們的數據顯示,PRDM15的缺失顯著(zhù)抑制了CCA細胞的增殖和集落形成能力(圖5A-5C)?;谶@些結果,我們在METTL16缺失的CCA細胞中進(jìn)行了PRDM15強制過(guò)表達的拯救實(shí)驗。我們觀(guān)察到,PRDM15的恢復能夠部分修復METTL16缺失引起的CCA細胞增殖/集落形成缺陷(圖5D-5F)。這些結果表明,PRDM15是CCA細胞中METTL16在功能上的重要靶點(diǎn)。

 

 

 

5)METTL16誘導PRDM15調控FGFR4的表達

       由于PRDM15是一種轉錄調節因子,我們試圖進(jìn)一步確定METTL16誘導的PRDM15在CCA細胞中的潛在下游靶點(diǎn)。為此,我們比較了CCA細胞中METTL16調控的基因(來(lái)自我們的RNA-Seq數據)與PRDM15正相關(guān)的基因(來(lái)自TCGA-CHOL數據庫)。這種方法鑒定出19個(gè)METTL16調控的基因,它們在CCA中與PRDM15呈正相關(guān)(圖6A)。在已鑒定的19個(gè)基因中,我們選擇關(guān)注FGFR4,該基因已被充分證明在CCA中發(fā)揮重要作用。為了確定PRDM15對FGFR4表達的影響,我們分析了PRDM15缺失的CCA細胞中FGFR4的mRNA和蛋白表達。我們的數據顯示,PRDM15的缺失降低了FGFR4的mRNA和蛋白質(zhì)水平(圖6B和6C)。接下來(lái),我們評估了FGFR4是否可能是PRDM15的直接靶點(diǎn)。為此,我們進(jìn)行了轉錄因子結合譜分析,以尋找FGFR4基因啟動(dòng)子中可能的PRDM15結合位點(diǎn)。這項工作鑒定出了FGFR4啟動(dòng)子中三個(gè)推測的PRDM15結合位點(diǎn)(圖6D)?;谶@些信息,我們進(jìn)行了ChIP-qPCR檢測,以確定其與FGFR4基因啟動(dòng)子的關(guān)聯(lián)。我們的實(shí)驗結果證實(shí)了PRDM15與CCA細胞中FGFR4基因啟動(dòng)子的結合(圖6D)。為了進(jìn)一步驗證METTL16-PRDM15對FGFR4的調控,我們檢測了METTL16缺失細胞中FGFR4的表達。我們的數據顯示,METTL16的缺失導致FGFR4表達的減少,而這種影響被PRDM15的強制過(guò)表達逆轉(圖6E)。與METTL16介導的PRDM15-FGFR4調節一致,我們的數據顯示,METTL16被其GapmeR反義寡核苷酸(ASO)消耗后,降低了CCA細胞中PRDM15和FGFR4的蛋白水平(圖6F)。此外,我們發(fā)現聯(lián)合使用FGFR4抑制劑BLU-554和METTL16 GapmeR ASO表現出更強的腫瘤抑制作用(圖6G)。

 

 

 

6)H3K27ac介導METTL16表達的調控

       鑒于METTL16在CCA細胞中的表達顯著(zhù)增加及其致癌作用,我們進(jìn)一步研究了METTL16在CCA細胞中的表達上調機制。我們使用UCSC基因組瀏覽器分析了METTL16啟動(dòng)子。分析顯示,METTL16基因的啟動(dòng)子區域高度富集了組蛋白H3賴(lài)氨酸27乙?;?H3K27ac)(圖7A)。這一觀(guān)察結果表明,METTL16的表達可能在轉錄水平上受到組蛋白乙?;目刂?。通過(guò)使用抗H3K27ac進(jìn)行ChIP-qPCR檢測,我們在CCA細胞的METTL16啟動(dòng)子處發(fā)現了H3K27ac的增加(圖7B)。由于p300(也稱(chēng)為EP300)和CBP是組蛋白乙?;匦璧?,我們使用抗p300和抗CBP分別進(jìn)行了ChIP-qPCR檢測;這些研究的結果證實(shí)了METTL16啟動(dòng)子上p300的富集,而不是CBP的富集(圖7C)?;谶@些結果,我們用p300抑制劑C646處理CCA細胞進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗。我們的數據顯示,用p300抑制劑C646處理CCA細胞顯著(zhù)降低了METTL16啟動(dòng)子處的H3K27ac和p300富集(圖7D和7E)。相應地,C646處理也降低了CCA細胞中METTL16 mRNA和蛋白水平(圖7F和7G)。這些發(fā)現表明,在CCA細胞中,p300介導的組蛋白H3賴(lài)氨酸27乙?;{節了METTL16的表達。

 

 

 

7)YY1與p300合作調控METTL16的表達

       由于p300通常被轉錄因子募集到靶基因啟動(dòng)子,我們進(jìn)一步研究了可能與p300協(xié)同調節CCA細胞中METTL16表達的轉錄因子。通過(guò)分析BioGrid預測的p300相互作用因子和SwissRegulon預測的METTL16推定轉錄因子,我們檢測到這兩個(gè)數據集中共有13個(gè)轉錄因子(圖8A)。通過(guò)分析TCGA數據庫中METTL16與CCA組織中鑒定的轉錄因子之間的相關(guān)性,我們發(fā)現CCA組織中有5個(gè)轉錄因子與METTL16呈正相關(guān),包括SP1、SP3、TBL1XR1、YY1、和ZBTB3(圖8B)。與非腫瘤組織相比,上述五種轉錄因子在CCA中升高(圖8C),但在CCA中只有YY1的表達與患者生存相關(guān)(圖8D)?;谶@些分析,我們進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗來(lái)證明YY1和P300在CCA細胞中的相互作用。如圖8E所示,免疫沉淀法證實(shí)p300與YY1在CCLP1和HuCCT1細胞中存在關(guān)聯(lián)。通過(guò)對JASPAR數據庫的分析,我們在METTL16的啟動(dòng)子區域發(fā)現了兩個(gè)YY1結合位點(diǎn)(圖8F)。通過(guò)ChIP-qPCR檢測,我們發(fā)現YY1能夠結合METTL16啟動(dòng)子上的這兩個(gè)位點(diǎn)。此外,我們觀(guān)察到用p300抑制劑C646處理CCA細胞可顯著(zhù)降低YY1與METTL16啟動(dòng)子的結合(圖8F)。綜上所述,YY1與p300共同調控CCA細胞中METTL16基因的表達。

 

 

 

結論

       我們的實(shí)驗發(fā)現揭示了一種新的METTL16-PRDM15-FGFR4信號軸,它與CCA有重要關(guān)系,可能作為新的治療靶點(diǎn)。

 

實(shí)驗方法

qRT?PCR,Western blot,IHC,RIP,m6A測序,免疫沉淀,MeRIP-qPCR,ChIP,動(dòng)物實(shí)驗。

參考文獻

Liu N, Zhang J, Chen W, Ma W, Wu T. The RNA methyltransferase METTL16 enhances cholangiocarcinoma growth through PRDM15-mediated FGFR4 expression. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Oct 11;42(1):263. doi: 10.1186/s13046-023-02844-5.