己糖激酶2通過(guò)組蛋白乳酸化促進(jìn)肝纖維化

       肝纖維化是肝臟對(duì)各種損傷的傷口愈合反應(yīng)，與嚴(yán)重的發(fā)病率和死亡率有關(guān)。目前，除肝移植外，尚無(wú)治療肝纖維化的有效方法。在肝損傷期間，靜止的肝星狀細(xì)胞(HSC)被激活并轉(zhuǎn)分化為α -平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)陽(yáng)性的肌成纖維細(xì)胞，這是纖維化肝臟中膠原生成細(xì)胞的主要貢獻(xiàn)者。最近，包括有氧糖酵解在內(nèi)的代謝重編程已成為HSC激活的一個(gè)關(guān)鍵特征，有證據(jù)表明，抑制有氧糖酵解可阻止HSC激活。盡管觀察到在HSC激活過(guò)程中有氧糖酵解的增強(qiáng)會(huì)增加乳酸的產(chǎn)生，但乳酸與HSC激活相關(guān)的潛在機(jī)制仍然難以捉摸。該文章就該問(wèn)題進(jìn)行了詳細(xì)的闡述，于2023年9月發(fā)表在《Cell Metabolism》,IF=29。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1、HK2的催化活性誘導(dǎo)組蛋白乙?；徽T導(dǎo)組蛋白乙?；?/strong>

       為了探討HK2的表達(dá)及其催化活性是否影響組蛋白乳酸化，作者使用了中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞MI5-4（HK基因表達(dá)不可見(jiàn)且HK活性有限的）。作者在這些細(xì)胞中表達(dá)野生型(WT) HK2或激酶死亡突變型(SA) HK2。在突變體中，丙氨酸取代了催化活性所需的氨基末端和羧基末端的絲氨酸殘基(S155A/S603A)。如圖1A所示，在MI5-4 CHO細(xì)胞中，WT和SA HK2的表達(dá)水平相同。然而，細(xì)胞外酸化率(ECAR)測(cè)量顯示，糖酵解活性僅在WT HK2細(xì)胞中顯著增加(圖1B和1C)。WT HK2細(xì)胞的糖酵解活性也導(dǎo)致乳酸產(chǎn)生和細(xì)胞乳酸水平的顯著誘導(dǎo)(圖1D)。為了確定HK2誘導(dǎo)的乳酸生成是否足以促進(jìn)細(xì)胞中組蛋白的乳酸化，作者檢測(cè)了H3K18la。賴氨酸殘基也被乙?；?H3K18ac)。有趣的是，H3K18la在空載體(EV)和SA HK2細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到，但在WT HK2細(xì)胞中卻高度升高，而H3K18ac無(wú)論HK2表達(dá)如何都可以檢測(cè)到，在WT HK2細(xì)胞中略有降低(圖1E)。除了H3K18la外，作者發(fā)現(xiàn)H3K9la、H3K14la、H4K8la和H4K12la也僅在WT HK2細(xì)胞中升高。作者還觀察到，在WT HK2細(xì)胞中，非組蛋白的乙酰化程度大多升高，而在WT HK2細(xì)胞中，盡管細(xì)胞乙酰輔酶a水平較高，但大多數(shù)非組蛋白的乙酰化程度沒(méi)有增加，甚至降低。為了進(jìn)一步闡明H3K18la和H3K18ac的潛在功能意義，作者接下來(lái)進(jìn)行了一種新的全基因組免疫檢測(cè)CUT&Tag。對(duì)H3K18la和H3K18ac的全基因組分布分析表明，這兩種組蛋白修飾主要位于啟動(dòng)子區(qū)域(圖1F)。與作者的免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，作者還觀察到，在WT HK2中，H3K18la峰在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(tss)附近增加，但H3K18ac峰沒(méi)有增加H3K18ac峰甚至略有下降(圖1G)。為了確定H3K18la和H3K18ac調(diào)控的潛在候選基因，作者首先比較了相同基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白修飾水平。在WT HK2細(xì)胞中，大多數(shù)基因標(biāo)記為H3K18la升高，而H3K18ac未被顯著誘導(dǎo)(圖1H和1I)。只有在WT HK2細(xì)胞中，這些基因的H3K18ac均未升高。因此，雖然HK2的表達(dá)，通過(guò)增加糖酵解，可以增加乳酸和乙酰輔酶a的水平，但它只影響組蛋白的乳酸化。

圖1、在MI5-4 CHO細(xì)胞中，HK2表達(dá)誘導(dǎo)糖酵解、乳酸生成和組蛋白乳酸化

2、H3K18la標(biāo)記基因參與基因表達(dá)調(diào)控和多種代謝過(guò)程

       為了研究HK2表達(dá)和乳酸如何通過(guò)組蛋白乳酸化影響全局基因表達(dá)，作者首先通過(guò)外源性乳酸處理優(yōu)化組蛋白乳酸化水平。作者發(fā)現(xiàn)，在EV細(xì)胞中，10 mM乳酸處理24小時(shí)，誘導(dǎo)的H3K18la水平與WT HK2細(xì)胞相當(dāng)(圖2A)。接下來(lái)，作者進(jìn)行RNA測(cè)序(RNA-seq)來(lái)比較對(duì)照細(xì)胞(EV)、WT HK2細(xì)胞和乳酸處理的對(duì)照細(xì)胞(EV + Lac)的轉(zhuǎn)錄組。作者的差異表達(dá)基因(DEG)分析顯示，外源性乳酸處理改變基因表達(dá)的模式與在WT HK2細(xì)胞中觀察到的相似，通常上調(diào)1109個(gè)基因(WT HK2為68.5%，EV + Lac為62.7%)，下調(diào)1532個(gè)基因(WT HK2為75.6%，EV + Lac為75.0%)(圖2B, 2C)。接下來(lái)，作者確定了493個(gè)被HK2和乳酸處理上調(diào)的基因，這些基因在其啟動(dòng)子區(qū)域也被H3K18la標(biāo)記(圖2D)。在作者對(duì)基因本體(GO)生物過(guò)程(GOBP)術(shù)語(yǔ)的分析中，H3K18la標(biāo)記的基因參與了基因表達(dá)、RNA和蛋白質(zhì)代謝過(guò)程以及蛋白質(zhì)修飾過(guò)程的調(diào)控(圖2E)。通過(guò)qPCR證實(shí)，在EV、WT HK2、SA HK2和EV + Lac細(xì)胞中，選擇了富含GOBP項(xiàng)的基因表達(dá)，包括冠層FGF信號(hào)調(diào)節(jié)因子2 (Cnpy2)、轉(zhuǎn)錄延伸因子Supt4a、富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子11 (Srsf11)、線粒體轉(zhuǎn)錄拯救因子1 (Mtres1)、金屬蛋白酶組織抑制劑1 (Timp1)和富含小脯氨酸蛋白1a (Sprr1a)。此外，在所選基因的啟動(dòng)子處驗(yàn)證了H3K18la和H3K18ac峰，在WT HK2細(xì)胞中觀察到H3K18la峰明顯增加，H3K18ac峰略有下降(圖2G)。為了進(jìn)一步證明HK2表達(dá)與組蛋白乳酸化之間的關(guān)系，作者生成了表達(dá)誘導(dǎo)HK2的MI5-4細(xì)胞。根據(jù)ECAR和耗氧率(OCR)的升高，證實(shí)了誘導(dǎo)HK2表達(dá)引起的糖酵解活性。與作者關(guān)于HK2組成表達(dá)的研究結(jié)果一致，作者觀察到誘導(dǎo)可誘導(dǎo)的HK2表達(dá)也誘導(dǎo)了H3K18la，同時(shí)誘導(dǎo)了基因表達(dá)，而將HK2表達(dá)降低到基礎(chǔ)水平則消除了這種作用。綜上所述，這些結(jié)果表明HK2表達(dá)可提高糖酵解活性和乳酸生成，從而通過(guò)H3K18la影響基因表達(dá)。

圖2、HK2/ h3k18la特異性基因參與MI5-4 CHO細(xì)胞的基因表達(dá)和多種代謝過(guò)程的調(diào)控

3、H3K18la在活化的小鼠和HSC中被誘導(dǎo)

       最近的研究表明，在慢性炎癥和纖維化過(guò)程中，糖酵解的增強(qiáng)不僅局限于癌細(xì)胞，也發(fā)生在肝、肺和腎臟的成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞中。肝損傷后，靜止的HSC被激活，成為纖維化肝臟中肌成纖維細(xì)胞的主要群體。盡管大量研究表明，通過(guò)誘導(dǎo)各種糖酵解酶，HSC的激活伴隨著乳酸的產(chǎn)生，但乳酸是如何與HSC的激活聯(lián)系在一起的仍是未知的?；谏鲜鲈贛I5-4 CHO細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)，作者假設(shè)在HSC激活過(guò)程中，產(chǎn)生HK2的乳酸可能通過(guò)組蛋白乳酸化影響基因表達(dá)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者首先在CCl4注射或膽管結(jié)扎(BDL)引起的小鼠肝纖維化模型中證實(shí)了HK2的表達(dá)。作者觀察到，在纖維化肝臟中，HK2的表達(dá)主要與表達(dá)a- SMA的肌成纖維細(xì)胞共定位。隨后，作者用其他HSC激活誘導(dǎo)基因(Col1a1和Timp1)評(píng)估了HK2的mRNA水平，并觀察到纖維化肝臟中HK2與HSC激活誘導(dǎo)的基因表達(dá)水平呈正相關(guān)。接下來(lái)，作者從小鼠肝臟中分離原代HSC。作者的免疫印跡分析顯示，在注射ccl4的小鼠肝臟的原代HSC中，HK2的表達(dá)被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而在健康肝臟的HSC中已經(jīng)表達(dá)的HK1，僅在活化的HSC中被輕微誘導(dǎo)(圖3A)。同樣，在靜止的HSC中檢測(cè)不到HK2的表達(dá)，但在培養(yǎng)3天和7天的小鼠原代HSC中，作者觀察到HK2的強(qiáng)烈表達(dá)和a-SMA的表達(dá)(圖3B)。在ccl4注射小鼠肝臟的原代HSC、BDL小鼠肝臟的HSC(公開(kāi)可訪問(wèn)的RNA-seq數(shù)據(jù)集GEO: GSE154170)和體外培養(yǎng)7天的HSC(公開(kāi)可訪問(wèn)的微陣列數(shù)據(jù)集GEO: GSE34949)中，也驗(yàn)證了HK2而非HK1的強(qiáng)誘導(dǎo)作用。然而，肝臟中主要的HK亞型，葡萄糖激酶(GCK)，在小鼠原代肝細(xì)胞中表達(dá)，而在靜止和激活的HSC中不表達(dá)(圖S3K)。接下來(lái)，對(duì)ECAR、乳酸生成和細(xì)胞乳酸水平的測(cè)量顯示，活化的HSC中糖酵解活性明顯升高(圖3C)，導(dǎo)致體內(nèi)和體外活化過(guò)程中H3K18la誘導(dǎo)(圖3D和3E)。重要的是，除了H3K18la外，H3K9la、H3K14la、H4K8la和H4K12la在體外激活的HSC中也被誘導(dǎo)表達(dá)。與H3K18la不同，H3K18ac存在于靜止的HSC中，其水平在體內(nèi)激活的HSC中保持不變，但在體外激活時(shí)被抑制，這表明HSC激活可能需要H3K18la而不需要H3K18ac。與組蛋白乳酸化和乙?；恢?，作者還發(fā)現(xiàn)非組蛋白乳酸化主要在體外活化的HSC中升高，但乙?；饕档?。為了在人類(lèi)臨床環(huán)境中加強(qiáng)作者的發(fā)現(xiàn)，作者對(duì)肝硬化患者的人肝組織進(jìn)行了雙重免疫熒光染色?；颊吒闻K免疫染色顯示，82.9%±3.1%的a-SMA+細(xì)胞表達(dá)HK2, 63.0%±5.2%的細(xì)胞表達(dá)H3K18la, 78.2%±3.6%的COL1a1+細(xì)胞表達(dá)HK2, 66.6%±5.1%的細(xì)胞表達(dá)H3K18la(圖3F)，支持HSC活化與HK2表達(dá)和H3K18la存在的聯(lián)系?？傊@些結(jié)果表明，誘導(dǎo)的HK2表達(dá)和糖酵解活性可能通過(guò)H3K18la在小鼠和人活化的HSC中發(fā)揮作用。

圖3、在HSC活化過(guò)程中，HK2/H3K18la被誘導(dǎo)并調(diào)控基因表達(dá)

4、H3K18la富集于活化HSC中誘導(dǎo)的基因的啟動(dòng)子區(qū)域

       為了進(jìn)一步確定H3K18la在HSC激活過(guò)程中是否在基因表達(dá)中發(fā)揮作用，作者對(duì)剛從健康肝臟分離或培養(yǎng)6天的小鼠原代HSC進(jìn)行了全基因組的CUT&Tag。有趣的是，活化的HSC中的H3K18la主要分布在啟動(dòng)子區(qū)域(42.5%)，而H3K18ac在啟動(dòng)子區(qū)域的分布程度要小得多(27.4%)，甚至低于包含子(28.2%)和遠(yuǎn)端基因間區(qū)域(34.5%)(圖3G)。這些發(fā)現(xiàn)表明，H3K18la，而不是H3K18ac，在HSC激活過(guò)程中，在基因表達(dá)的誘導(dǎo)中起主要作用。通過(guò)分析啟動(dòng)子區(qū)域，作者確定了4070個(gè)基因?yàn)镠3K18la標(biāo)記的候選基因，117個(gè)基因共享H3K18la和H3K18ac，只有20個(gè)基因?yàn)镠3K18ac標(biāo)記的候選基因(圖3H)。因此，激活的HSC中的絕大多數(shù)基因在啟動(dòng)子區(qū)域被H3K18la標(biāo)記。為了鑒定活化HSC中H3K18la標(biāo)記的基因，作者對(duì)培養(yǎng)6天的原代HSC進(jìn)行了RNA-seq，結(jié)果顯示，在活化過(guò)程中，1677個(gè)基因顯著上調(diào)，1505個(gè)基因顯著下調(diào)(圖3I)。最后，作者鑒定出1126個(gè)基因在啟動(dòng)子區(qū)域被H3K18la誘導(dǎo)而上調(diào)(圖3J)。GOBP term分析顯示，這些H3K18la標(biāo)記的基因參與了細(xì)胞粘附、遷移和傷口愈合(圖3K)，提示H3K18la可能調(diào)控代表HSC主要特征的關(guān)鍵基因。

5、HK2基因缺失通過(guò)降低H3K18la來(lái)抑制HSC的激活，而H3K18la可以通過(guò)外源性乳酸而不是醋酸鹽的補(bǔ)充來(lái)恢復(fù)

       鑒于作者的研究結(jié)果，激活的HSC通過(guò)誘導(dǎo)糖酵解以及HK2表達(dá)和H3K18la進(jìn)行代謝重編程，作者推測(cè)HK2消融通過(guò)抑制H3K18la來(lái)阻礙HSC的激活。為了驗(yàn)證作者的假設(shè)，作者從HK2f/f小鼠的肝臟中分離出原代HSC，并通過(guò)暴露于表達(dá)Cre重組酶與eGFP融合的腺病毒(Ad-GFP-Cre)進(jìn)行基因缺失，然后培養(yǎng)6天。HSC中HK2缺失使ECAR、乳酸生成和細(xì)胞乳酸水平降低約60%(圖4A-4C)。OCR也顯著降低，表明HK2的表達(dá)促進(jìn)了HSC激活時(shí)糖酵解的主要部分，以提供丙酮酸，丙酮酸在細(xì)胞呼吸發(fā)生的線粒體中被還原為乳酸并氧化。此外，這種由HK2缺失引起的代謝擾動(dòng)抑制了a-SMA的表達(dá)和增殖，但沒(méi)有引起細(xì)胞死亡(圖4D)。正如預(yù)期的那樣，腺病毒Cre轉(zhuǎn)導(dǎo)不影響WT原代HSC的激活(圖4D)。在確定了HK2消融對(duì)糖酵解活性和HSC激活的影響后，作者接下來(lái)檢測(cè)了H3K18la和H3K18ac的水平。有趣的是，HK2缺失細(xì)胞的H3K18la和H3K18ac水平低于活化的HSC，但外源性乳酸處理恢復(fù)了H3K18la，而H3K18ac進(jìn)一步降低(圖4E)。與此一致的是，CUT&Tag結(jié)果的熱圖分析顯示，激活小鼠原代HSC中，H3K18la在基因的TSSs附近被顯著誘導(dǎo)，通過(guò)HK2缺失而減弱，在添加乳酸后恢復(fù)(圖4F)。相比之下，H3K18ac在活化的HSC中減少，并通過(guò)HK2缺失和乳酸處理進(jìn)一步減少(圖4F)。為了進(jìn)一步研究H3K18la標(biāo)記的基因是否依賴于HK2的表達(dá)以及乳酸處理，作者比較了活化的WT型HSC和活化的HK2敲除(KO)型HSC中H3K18la標(biāo)記的基因的表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)，在活化的HK2-KO細(xì)胞中，下調(diào)基因增加了大約3倍(圖4G)。乳酸處理逆轉(zhuǎn)了大多數(shù)依賴于HK2表達(dá)的基因的表達(dá)(圖4H)。GOBP term分析顯示，這些依賴于HK2/H3K18la和乳酸處理的真實(shí)基因與細(xì)胞粘附、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)組織和TGF-b受體信號(hào)通路有關(guān)，表明HK2/H3K18la在調(diào)節(jié)HSC激活誘導(dǎo)基因中起關(guān)鍵作用。事實(shí)上，在活化的HSC中，H3K18la峰在關(guān)鍵誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子處高度富集，而在靜止和HK2-KO細(xì)胞中則沒(méi)有，但在HK2-KO細(xì)胞中，乳酸處理恢復(fù)了H3K18la峰(圖4I、4J)。與作者在tss附近的全基因組H3K18ac峰的發(fā)現(xiàn)一致，在活化的HK2-KO細(xì)胞和乳酸處理的HK2-KO細(xì)胞中，H3K18ac峰在基因的啟動(dòng)子處逐漸被抑制。已知補(bǔ)充乙酸可以增強(qiáng)組蛋白乙?；腿旧|(zhì)可及性。為了評(píng)估乳酸和醋酸鹽處理是否能恢復(fù)HK2-KO HSC中的基因表達(dá)，作者測(cè)量了HSC激活誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄水平。令人驚訝的是，乳酸處理上調(diào)了被HK2缺失抑制的基因表達(dá)，而醋酸處理沒(méi)有(圖4K)。同樣，活化的HSC的侵襲能力因HK2缺乏而降低，但乳酸處理使其恢復(fù)，而醋酸處理未恢復(fù)表型(圖4L)?？偟膩?lái)說(shuō)，作者的研究結(jié)果表明，HK2缺失抑制HSC激活，乳酸處理(可能通過(guò)H3K18la)可以挽救HSC激活，而醋酸處理則不能。

圖4、HK2基因缺失通過(guò)降低H3K18la來(lái)抑制HSC的激活，而外源性乳酸處理可以挽救H3K18la，而醋酸處理則不能

6、抑制外源性乳酸產(chǎn)生可以抑制HSC的激活

       為了繼續(xù)研究組蛋白乳酸化與HSC激活之間的關(guān)系，作者進(jìn)一步評(píng)估了乳酸生成藥物抑制劑治療后基因表達(dá)的激活。草酸酯通過(guò)抑制乳酸脫氫酶(LDH)抑制丙酮酸產(chǎn)生乳酸，而DCA通過(guò)抑制丙酮酸脫氫酶激酶(PDHK)增加丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶a而不是乳酸來(lái)抑制乳酸的產(chǎn)生(圖5A)。正如之前報(bào)道的那樣，草酸酯和DCA處理顯著降低了乳酸生成和細(xì)胞乳酸水平(圖5B、5C)，這種干預(yù)抑制了小鼠原代HSC的細(xì)胞增殖，而不引起細(xì)胞死亡(圖5D)。草酸酯和DCA處理有效地降低了H3K18la和HSC激活誘導(dǎo)基因的表達(dá)，乳酸可以挽救HSC激活誘導(dǎo)基因，而乙酸補(bǔ)充不能(圖5E-5H)。為了進(jìn)一步確定LDH與HK2誘導(dǎo)的組蛋白乳酸化和隨后的基因表達(dá)之間的直接關(guān)系，作者在小鼠原代HSC中轉(zhuǎn)染了靶向LDH的小干擾RNA (siRNA)。與LDH抑制劑處理一致，Ldha的siRNA敲低降低了細(xì)胞乳酸水平和H3K18la以及HSC激活誘導(dǎo)的基因表達(dá)，乳酸處理恢復(fù)了細(xì)胞乳酸水平，而醋酸處理沒(méi)有恢復(fù)。TGF-b1被認(rèn)為是在HSC纖維化信號(hào)通路中起重要作用的關(guān)鍵細(xì)胞因子。最近，越來(lái)越多的證據(jù)表明TGF-b1也通過(guò)增強(qiáng)HSC和成纖維細(xì)胞的糖酵解通量參與代謝重編程。因此，作者研究了TGF-b1對(duì)Lx-2細(xì)胞活化的影響。正如預(yù)期的那樣，TGF-b1增加了乳酸的產(chǎn)生，這一作用被草酸鹽或DCA處理所減弱。將葡萄糖水平從25 mM降低到5 mM會(huì)降低H3K18la，但TGF-b1在兩種葡萄糖濃度下均會(huì)增加H3K18la，同時(shí)降低H3K18ac。正如預(yù)期的那樣，TGF-b1誘導(dǎo)a-SMA基因表達(dá)和COL1A1基因表達(dá)。作者隨后的時(shí)間過(guò)程研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-b1處理后的較晚時(shí)間點(diǎn)(6-24 h)， H3K18la持續(xù)升高，這與HSC激活誘導(dǎo)基因的顯著上調(diào)相關(guān)。相比之下，H3K18ac水平在1 h時(shí)略有升高，但在TGF-b1處理后，這種升高隨后持續(xù)降低。為了確定TGF-b1對(duì)Lx-2細(xì)胞中a-SMA基因啟動(dòng)子組蛋白修飾的影響，作者采用ChIPqPCR分析了啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白的乳酸化和乙?；Ｅc作者的免疫印跡結(jié)果一致，TGF-b1增加了a-SMA啟動(dòng)子上的H3K18la，但降低了H3K18ac。接下來(lái)，作者發(fā)現(xiàn)草酸酯和DCA降低了H3K18la，抑制了TGF-b1升高的a-SMA表達(dá)。作者進(jìn)一步證實(shí)這種抑制不是由于細(xì)胞死亡。在作者的拯救實(shí)驗(yàn)中，乳酸可以恢復(fù)激活誘導(dǎo)基因的表達(dá)減少，而醋酸不能恢復(fù)。作者的研究結(jié)果表明，干擾乳酸的產(chǎn)生會(huì)降低H3K18la和HSC激活誘導(dǎo)基因的表達(dá)，乳酸可以恢復(fù)，而乙酸不能恢復(fù)。綜上所述，這些結(jié)果表明組蛋白乳酸化在HSC激活和隨后的基因表達(dá)誘導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。

圖5、通過(guò)抑制乳酸生成或I類(lèi)HDAC抑制劑治療降低H3K18la，使造血干細(xì)胞失活

7、一類(lèi)HDAC抑制劑可提高H3K18ac，抑制H3K18la，從而抑制HSC激活誘導(dǎo)基因的表達(dá)

       組蛋白去乙?；?hdac)催化從組蛋白賴氨酸殘基中去除乙?；?，導(dǎo)致染色質(zhì)凝聚，抑制基因轉(zhuǎn)錄。先前的研究表明，在體外和體內(nèi)，抑制僅局限于細(xì)胞核的I類(lèi)hdac可使HSC失活?？紤]到作者的研究結(jié)果，H3K18la是一種新的組蛋白修飾，反映了HSC激活誘導(dǎo)基因的表達(dá)，作者假設(shè)I類(lèi)HDAC抑制劑可能誘導(dǎo)H3K18ac, H3K18la與H3K18la在組蛋白H3上相同的賴氨酸18殘基上競(jìng)爭(zhēng)。首先，作者用I類(lèi)HDAC抑制劑apicidin和MS275 (entinostat)處理活化的小鼠原代HSC(圖5I)。抑制劑處理增加了H3K18ac，但降低了H3K18la，表明賴氨酸18的乙?；腿樗峄g存在競(jìng)爭(zhēng)(圖5J)。其次，apicidin和MS275處理顯著降低了基因表達(dá)和增殖的激活，這些影響不是由于細(xì)胞死亡(圖5K)。為了進(jìn)一步探索組蛋白乙酰化和乳酸化之間競(jìng)爭(zhēng)的可能性，作者用乳酸和乙酸處理Lx-2細(xì)胞。單獨(dú)乳酸處理增加了a-SMA的表達(dá)，而單獨(dú)醋酸處理顯示相反的效果。有趣的是，當(dāng)添加醋酸鹽時(shí)，乳酸誘導(dǎo)的a-SMA表達(dá)被消除。事實(shí)上，H3K18la在乳酸處理下被高度升高，但當(dāng)添加醋酸鹽時(shí)，這種升高被抑制，因此H3K18ac水平恢復(fù)。因此，作者的研究結(jié)果表明，I類(lèi)HDAC抑制劑可能通過(guò)上調(diào)H3K18ac而失活HSC, H3K18la與H3K18la競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致H3K18la依賴性基因表達(dá)下調(diào)。

8、HSC特異性和系統(tǒng)性的HK2缺失在體內(nèi)抑制肝纖維化

       為了進(jìn)一步證實(shí)HK2/H3K18la在肝纖維化背景下在HSC中的作用，作者首先生成HK2f/f;LratCre小鼠，其中HK2可以在HSC中特異性刪除。小鼠注射CCl4 3周，誘導(dǎo)肝纖維化(圖6A)。Sirius red和Masson’s三色染色顯示，當(dāng)HSC中缺失HK2時(shí)，肝臟中CCl4引起的膠原積累明顯減少(圖6B和6E)。在膠原沉積的同時(shí)，a-SMA在HSC特異性HK2-KO小鼠肝臟中的表達(dá)顯著降低(圖6B和6D)。為了驗(yàn)證H3K18la水平是否反映了體內(nèi)HSC的激活，作者在給藥CCl4后從HSC特異性HK2-KO小鼠的肝臟中分離小鼠原代HSC。作者證實(shí)，CCl4給藥后小鼠肝臟原代HSC中誘導(dǎo)的H3K18la水平因缺乏HK2而顯著降低(圖6C)。然而，H3K18ac水平?jīng)]有改變。接下來(lái)，ALT(丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶)和AST(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)的測(cè)定顯示，HSC中HK2的缺失對(duì)肝毒性沒(méi)有顯著影響(圖6F)?？紤]到外源性乳酸補(bǔ)充在體外挽救了HK2缺失的HSC的HSC激活表型，作者接下來(lái)通過(guò)注射2 g/kg乳酸(腹腔注射)來(lái)評(píng)估乳酸對(duì)HSC特異性HK2-KO小鼠的影響，連續(xù)注射CCl4 3周，每隔一天一次。有趣的是，作者的Sirius red和a-SMA免疫染色結(jié)果顯示，體內(nèi)添加乳酸后，HSC特異性HK2-KO小鼠肝臟中膠原沉積減少和a-SMA表達(dá)恢復(fù)?？傊髡叩难芯拷Y(jié)果表明，HSC特異性缺失HK2可減輕HSC中的H3K18la并抑制肝纖維化，而體內(nèi)慢性和全身乳酸治療可恢復(fù)膠原沉積和a-SMA表達(dá)。作者之前的研究表明，成年小鼠的全身HK2缺失對(duì)乳腺癌和肺癌具有良好的耐受性和治療性，沒(méi)有不良的生理后果。接下來(lái)，作者用CCl4治療系統(tǒng)性HK2缺失小鼠3周(圖7A)。值得注意的是，作者的Sirius red和Masson’s三色染色結(jié)果顯示，在系統(tǒng)性缺失HK2后，肝臟中的膠原積累明顯受到抑制(圖7B和7D)。此外，證實(shí)a- SMA表達(dá)顯著減少(圖7B和7C)。為了進(jìn)一步分析系統(tǒng)性HK2缺失的抗纖維化作用，作者接下來(lái)在注射他莫昔芬后建立了bdl誘導(dǎo)的HK2f/f;UBCCreERT2小鼠纖維化模型(圖7F)。與作者之前的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，系統(tǒng)性缺失HK2有效抑制了bdl小鼠肝臟中膠原的積累和a-SMA的表達(dá)(圖7G-7I)。在ccl4誘導(dǎo)和bdl誘導(dǎo)的纖維化模型中，血清ALT和AST活性在HK2熟練組和HK2缺乏組之間相似，這表明體內(nèi)系統(tǒng)性的HK2缺失不會(huì)引起顯著的細(xì)胞毒性(圖7E和7J)。接下來(lái)，為了進(jìn)一步了解系統(tǒng)性HK2缺失對(duì)治療潛力的影響，作者首先用CCl4治療3周誘導(dǎo)肝纖維化，然后嘗試系統(tǒng)性地刪除HK2(圖7K)。在系統(tǒng)性缺失HK2的小鼠肝臟中，Sirius紅和Masson三色染色顯示膠原沉積明顯減少(圖7L和7M)。作者觀察到，在肝纖維化建立后，當(dāng)全身缺失HK2時(shí)，a-SMA的表達(dá)也減少(圖7N)。 此外，在誘導(dǎo)肝纖維化后，刪除HK2對(duì)血清ALT和AST活性沒(méi)有明顯影響(圖7O)。綜上所述，作者的研究結(jié)果表明，靶向HK2可以系統(tǒng)性地抑制HSC的激活;因此，HK2可能是肝纖維化的治療靶點(diǎn)。

圖6、造血干細(xì)胞中特異性缺失HK2可改善ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化

圖7、體內(nèi)系統(tǒng)缺失HK2對(duì)ccl4和bdl誘導(dǎo)的肝纖維化的抑制作用

結(jié)論

       總之，作者發(fā)現(xiàn)HK2介導(dǎo)的乳酸生成通過(guò)組蛋白乳酸化影響基因表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)在活化的HSC中誘導(dǎo)HK2的表達(dá)對(duì)于HSC的激活至關(guān)重要，并且由HK2表達(dá)引起的組蛋白乳酸化決定了HSC激活后的基因表達(dá)。此外，作者的研究結(jié)果表明，干預(yù)HK2/H3K18la軸是肝纖維化的一種潛在治療策略。

實(shí)驗(yàn)方法

WB, qPCR，IHC，IF，RNA-seq，CUT&Tag，CHIP-qPCR，CHIP-seq，ECAR，OCR，代謝組學(xué) 

參考文獻(xiàn)

Rho H, Terry AR, Chronis C, Hay N. Hexokinase 2-mediated gene expression via histone lactylation is required for hepatic stellate cell activation and liver fibrosis. Cell Metab. 2023 Aug 8;35(8):1406-1423.e8. doi: 10.1016/j.cmet.2023.06.013. Epub 2023 Jul 17. PMID: 37463576.