己糖激酶2通過(guò)組蛋白乳酸化促進(jìn)肝纖維化

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2024-06-07
肝纖維化是肝臟對各種損傷的傷口愈合反應,與嚴重的發(fā)病率和死亡率有關(guān)。目前,除肝移植外,尚無(wú)治療肝纖維化的有效方法......

 

       肝纖維化是肝臟對各種損傷的傷口愈合反應,與嚴重的發(fā)病率和死亡率有關(guān)。目前,除肝移植外,尚無(wú)治療肝纖維化的有效方法。在肝損傷期間,靜止的肝星狀細胞(HSC)被激活并轉分化為α -平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)陽(yáng)性的肌成纖維細胞,這是纖維化肝臟中膠原生成細胞的主要貢獻者。最近,包括有氧糖酵解在內的代謝重編程已成為HSC激活的一個(gè)關(guān)鍵特征,有證據表明,抑制有氧糖酵解可阻止HSC激活。盡管觀(guān)察到在HSC激活過(guò)程中有氧糖酵解的增強會(huì )增加乳酸的產(chǎn)生,但乳酸與HSC激活相關(guān)的潛在機制仍然難以捉摸。該文章就該問(wèn)題進(jìn)行了詳細的闡述,于2023年9月發(fā)表在《Cell Metabolism》,IF=29。

技術(shù)路線(xiàn)

 

 

主要研究結果

1、HK2的催化活性誘導組蛋白乙?;?,但不誘導組蛋白乙?;?/strong>

       為了探討HK2的表達及其催化活性是否影響組蛋白乳酸化,作者使用了中國倉鼠卵巢(CHO)細胞MI5-4(HK基因表達不可見(jiàn)且HK活性有限的)。作者在這些細胞中表達野生型(WT) HK2或激酶死亡突變型(SA) HK2。在突變體中,丙氨酸取代了催化活性所需的氨基末端和羧基末端的絲氨酸殘基(S155A/S603A)。如圖1A所示,在MI5-4 CHO細胞中,WT和SA HK2的表達水平相同。然而,細胞外酸化率(ECAR)測量顯示,糖酵解活性?xún)H在WT HK2細胞中顯著(zhù)增加(圖1B和1C)。WT HK2細胞的糖酵解活性也導致乳酸產(chǎn)生和細胞乳酸水平的顯著(zhù)誘導(圖1D)。為了確定HK2誘導的乳酸生成是否足以促進(jìn)細胞中組蛋白的乳酸化,作者檢測了H3K18la。賴(lài)氨酸殘基也被乙?;?H3K18ac)。有趣的是,H3K18la在空載體(EV)和SA HK2細胞中幾乎檢測不到,但在WT HK2細胞中卻高度升高,而H3K18ac無(wú)論HK2表達如何都可以檢測到,在WT HK2細胞中略有降低(圖1E)。除了H3K18la外,作者發(fā)現H3K9la、H3K14la、H4K8la和H4K12la也僅在WT HK2細胞中升高。作者還觀(guān)察到,在WT HK2細胞中,非組蛋白的乙?;潭却蠖嗌?,而在WT HK2細胞中,盡管細胞乙酰輔酶a水平較高,但大多數非組蛋白的乙?;潭葲](méi)有增加,甚至降低。為了進(jìn)一步闡明H3K18la和H3K18ac的潛在功能意義,作者接下來(lái)進(jìn)行了一種新的全基因組免疫檢測CUT&Tag。對H3K18la和H3K18ac的全基因組分布分析表明,這兩種組蛋白修飾主要位于啟動(dòng)子區域(圖1F)。與作者的免疫印跡實(shí)驗結果一致,作者還觀(guān)察到,在WT HK2中,H3K18la峰在轉錄起始位點(diǎn)(tss)附近增加,但H3K18ac峰沒(méi)有增加H3K18ac峰甚至略有下降(圖1G)。為了確定H3K18la和H3K18ac調控的潛在候選基因,作者首先比較了相同基因啟動(dòng)子區域的組蛋白修飾水平。在WT HK2細胞中,大多數基因標記為H3K18la升高,而H3K18ac未被顯著(zhù)誘導(圖1H和1I)。只有在WT HK2細胞中,這些基因的H3K18ac均未升高。因此,雖然HK2的表達,通過(guò)增加糖酵解,可以增加乳酸和乙酰輔酶a的水平,但它只影響組蛋白的乳酸化。

 

 

圖1、在MI5-4 CHO細胞中,HK2表達誘導糖酵解、乳酸生成和組蛋白乳酸化

 

2、H3K18la標記基因參與基因表達調控和多種代謝過(guò)程

       為了研究HK2表達和乳酸如何通過(guò)組蛋白乳酸化影響全局基因表達,作者首先通過(guò)外源性乳酸處理優(yōu)化組蛋白乳酸化水平。作者發(fā)現,在EV細胞中,10 mM乳酸處理24小時(shí),誘導的H3K18la水平與WT HK2細胞相當(圖2A)。接下來(lái),作者進(jìn)行RNA測序(RNA-seq)來(lái)比較對照細胞(EV)、WT HK2細胞和乳酸處理的對照細胞(EV + Lac)的轉錄組。作者的差異表達基因(DEG)分析顯示,外源性乳酸處理改變基因表達的模式與在WT HK2細胞中觀(guān)察到的相似,通常上調1109個(gè)基因(WT HK2為68.5%,EV + Lac為62.7%),下調1532個(gè)基因(WT HK2為75.6%,EV + Lac為75.0%)(圖2B, 2C)。接下來(lái),作者確定了493個(gè)被HK2和乳酸處理上調的基因,這些基因在其啟動(dòng)子區域也被H3K18la標記(圖2D)。在作者對基因本體(GO)生物過(guò)程(GOBP)術(shù)語(yǔ)的分析中,H3K18la標記的基因參與了基因表達、RNA和蛋白質(zhì)代謝過(guò)程以及蛋白質(zhì)修飾過(guò)程的調控(圖2E)。通過(guò)qPCR證實(shí),在EV、WT HK2、SA HK2和EV + Lac細胞中,選擇了富含GOBP項的基因表達,包括冠層FGF信號調節因子2 (Cnpy2)、轉錄延伸因子Supt4a、富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子11 (Srsf11)、線(xiàn)粒體轉錄拯救因子1 (Mtres1)、金屬蛋白酶組織抑制劑1 (Timp1)和富含小脯氨酸蛋白1a (Sprr1a)。此外,在所選基因的啟動(dòng)子處驗證了H3K18la和H3K18ac峰,在WT HK2細胞中觀(guān)察到H3K18la峰明顯增加,H3K18ac峰略有下降(圖2G)。為了進(jìn)一步證明HK2表達與組蛋白乳酸化之間的關(guān)系,作者生成了表達誘導HK2的MI5-4細胞。根據ECAR和耗氧率(OCR)的升高,證實(shí)了誘導HK2表達引起的糖酵解活性。與作者關(guān)于HK2組成表達的研究結果一致,作者觀(guān)察到誘導可誘導的HK2表達也誘導了H3K18la,同時(shí)誘導了基因表達,而將HK2表達降低到基礎水平則消除了這種作用。綜上所述,這些結果表明HK2表達可提高糖酵解活性和乳酸生成,從而通過(guò)H3K18la影響基因表達。

 

 

圖2、HK2/ h3k18la特異性基因參與MI5-4 CHO細胞的基因表達和多種代謝過(guò)程的調控

 

3、H3K18la在活化的小鼠和HSC中被誘導

       最近的研究表明,在慢性炎癥和纖維化過(guò)程中,糖酵解的增強不僅局限于癌細胞,也發(fā)生在肝、肺和腎臟的成纖維細胞和肌成纖維細胞中。肝損傷后,靜止的HSC被激活,成為纖維化肝臟中肌成纖維細胞的主要群體。盡管大量研究表明,通過(guò)誘導各種糖酵解酶,HSC的激活伴隨著(zhù)乳酸的產(chǎn)生,但乳酸是如何與HSC的激活聯(lián)系在一起的仍是未知的?;谏鲜鲈贛I5-4 CHO細胞中的發(fā)現,作者假設在HSC激活過(guò)程中,產(chǎn)生HK2的乳酸可能通過(guò)組蛋白乳酸化影響基因表達。為了驗證這一假設,作者首先在CCl4注射或膽管結扎(BDL)引起的小鼠肝纖維化模型中證實(shí)了HK2的表達。作者觀(guān)察到,在纖維化肝臟中,HK2的表達主要與表達a- SMA的肌成纖維細胞共定位。隨后,作者用其他HSC激活誘導基因(Col1a1和Timp1)評估了HK2的mRNA水平,并觀(guān)察到纖維化肝臟中HK2與HSC激活誘導的基因表達水平呈正相關(guān)。接下來(lái),作者從小鼠肝臟中分離原代HSC。作者的免疫印跡分析顯示,在注射ccl4的小鼠肝臟的原代HSC中,HK2的表達被強烈誘導,而在健康肝臟的HSC中已經(jīng)表達的HK1,僅在活化的HSC中被輕微誘導(圖3A)。同樣,在靜止的HSC中檢測不到HK2的表達,但在培養3天和7天的小鼠原代HSC中,作者觀(guān)察到HK2的強烈表達和a-SMA的表達(圖3B)。在ccl4注射小鼠肝臟的原代HSC、BDL小鼠肝臟的HSC(公開(kāi)可訪(fǎng)問(wèn)的RNA-seq數據集GEO: GSE154170)和體外培養7天的HSC(公開(kāi)可訪(fǎng)問(wèn)的微陣列數據集GEO: GSE34949)中,也驗證了HK2而非HK1的強誘導作用。然而,肝臟中主要的HK亞型,葡萄糖激酶(GCK),在小鼠原代肝細胞中表達,而在靜止和激活的HSC中不表達(圖S3K)。接下來(lái),對ECAR、乳酸生成和細胞乳酸水平的測量顯示,活化的HSC中糖酵解活性明顯升高(圖3C),導致體內和體外活化過(guò)程中H3K18la誘導(圖3D和3E)。重要的是,除了H3K18la外,H3K9la、H3K14la、H4K8la和H4K12la在體外激活的HSC中也被誘導表達。與H3K18la不同,H3K18ac存在于靜止的HSC中,其水平在體內激活的HSC中保持不變,但在體外激活時(shí)被抑制,這表明HSC激活可能需要H3K18la而不需要H3K18ac。與組蛋白乳酸化和乙?;恢?,作者還發(fā)現非組蛋白乳酸化主要在體外活化的HSC中升高,但乙?;饕档?。為了在人類(lèi)臨床環(huán)境中加強作者的發(fā)現,作者對肝硬化患者的人肝組織進(jìn)行了雙重免疫熒光染色?;颊吒闻K免疫染色顯示,82.9%±3.1%的a-SMA+細胞表達HK2, 63.0%±5.2%的細胞表達H3K18la, 78.2%±3.6%的COL1a1+細胞表達HK2, 66.6%±5.1%的細胞表達H3K18la(圖3F),支持HSC活化與HK2表達和H3K18la存在的聯(lián)系??傊?,這些結果表明,誘導的HK2表達和糖酵解活性可能通過(guò)H3K18la在小鼠和人活化的HSC中發(fā)揮作用。

 

 

圖3、在HSC活化過(guò)程中,HK2/H3K18la被誘導并調控基因表達

 

4、H3K18la富集于活化HSC中誘導的基因的啟動(dòng)子區域

       為了進(jìn)一步確定H3K18la在HSC激活過(guò)程中是否在基因表達中發(fā)揮作用,作者對剛從健康肝臟分離或培養6天的小鼠原代HSC進(jìn)行了全基因組的CUT&Tag。有趣的是,活化的HSC中的H3K18la主要分布在啟動(dòng)子區域(42.5%),而H3K18ac在啟動(dòng)子區域的分布程度要小得多(27.4%),甚至低于包含子(28.2%)和遠端基因間區域(34.5%)(圖3G)。這些發(fā)現表明,H3K18la,而不是H3K18ac,在HSC激活過(guò)程中,在基因表達的誘導中起主要作用。通過(guò)分析啟動(dòng)子區域,作者確定了4070個(gè)基因為H3K18la標記的候選基因,117個(gè)基因共享H3K18la和H3K18ac,只有20個(gè)基因為H3K18ac標記的候選基因(圖3H)。因此,激活的HSC中的絕大多數基因在啟動(dòng)子區域被H3K18la標記。為了鑒定活化HSC中H3K18la標記的基因,作者對培養6天的原代HSC進(jìn)行了RNA-seq,結果顯示,在活化過(guò)程中,1677個(gè)基因顯著(zhù)上調,1505個(gè)基因顯著(zhù)下調(圖3I)。最后,作者鑒定出1126個(gè)基因在啟動(dòng)子區域被H3K18la誘導而上調(圖3J)。GOBP term分析顯示,這些H3K18la標記的基因參與了細胞粘附、遷移和傷口愈合(圖3K),提示H3K18la可能調控代表HSC主要特征的關(guān)鍵基因。

5、HK2基因缺失通過(guò)降低H3K18la來(lái)抑制HSC的激活,而H3K18la可以通過(guò)外源性乳酸而不是醋酸鹽的補充來(lái)恢復

       鑒于作者的研究結果,激活的HSC通過(guò)誘導糖酵解以及HK2表達和H3K18la進(jìn)行代謝重編程,作者推測HK2消融通過(guò)抑制H3K18la來(lái)阻礙HSC的激活。為了驗證作者的假設,作者從HK2f/f小鼠的肝臟中分離出原代HSC,并通過(guò)暴露于表達Cre重組酶與eGFP融合的腺病毒(Ad-GFP-Cre)進(jìn)行基因缺失,然后培養6天。HSC中HK2缺失使ECAR、乳酸生成和細胞乳酸水平降低約60%(圖4A-4C)。OCR也顯著(zhù)降低,表明HK2的表達促進(jìn)了HSC激活時(shí)糖酵解的主要部分,以提供丙酮酸,丙酮酸在細胞呼吸發(fā)生的線(xiàn)粒體中被還原為乳酸并氧化。此外,這種由HK2缺失引起的代謝擾動(dòng)抑制了a-SMA的表達和增殖,但沒(méi)有引起細胞死亡(圖4D)。正如預期的那樣,腺病毒Cre轉導不影響WT原代HSC的激活(圖4D)。在確定了HK2消融對糖酵解活性和HSC激活的影響后,作者接下來(lái)檢測了H3K18la和H3K18ac的水平。有趣的是,HK2缺失細胞的H3K18la和H3K18ac水平低于活化的HSC,但外源性乳酸處理恢復了H3K18la,而H3K18ac進(jìn)一步降低(圖4E)。與此一致的是,CUT&Tag結果的熱圖分析顯示,激活小鼠原代HSC中,H3K18la在基因的TSSs附近被顯著(zhù)誘導,通過(guò)HK2缺失而減弱,在添加乳酸后恢復(圖4F)。相比之下,H3K18ac在活化的HSC中減少,并通過(guò)HK2缺失和乳酸處理進(jìn)一步減少(圖4F)。為了進(jìn)一步研究H3K18la標記的基因是否依賴(lài)于HK2的表達以及乳酸處理,作者比較了活化的WT型HSC和活化的HK2敲除(KO)型HSC中H3K18la標記的基因的表達。作者發(fā)現,在活化的HK2-KO細胞中,下調基因增加了大約3倍(圖4G)。乳酸處理逆轉了大多數依賴(lài)于HK2表達的基因的表達(圖4H)。GOBP term分析顯示,這些依賴(lài)于HK2/H3K18la和乳酸處理的真實(shí)基因與細胞粘附、遷移、細胞外基質(zhì)組織和TGF-b受體信號通路有關(guān),表明HK2/H3K18la在調節HSC激活誘導基因中起關(guān)鍵作用。事實(shí)上,在活化的HSC中,H3K18la峰在關(guān)鍵誘導基因的啟動(dòng)子處高度富集,而在靜止和HK2-KO細胞中則沒(méi)有,但在HK2-KO細胞中,乳酸處理恢復了H3K18la峰(圖4I、4J)。與作者在tss附近的全基因組H3K18ac峰的發(fā)現一致,在活化的HK2-KO細胞和乳酸處理的HK2-KO細胞中,H3K18ac峰在基因的啟動(dòng)子處逐漸被抑制。已知補充乙酸可以增強組蛋白乙?;腿旧|(zhì)可及性。為了評估乳酸和醋酸鹽處理是否能恢復HK2-KO HSC中的基因表達,作者測量了HSC激活誘導基因的轉錄水平。令人驚訝的是,乳酸處理上調了被HK2缺失抑制的基因表達,而醋酸處理沒(méi)有(圖4K)。同樣,活化的HSC的侵襲能力因HK2缺乏而降低,但乳酸處理使其恢復,而醋酸處理未恢復表型(圖4L)??偟膩?lái)說(shuō),作者的研究結果表明,HK2缺失抑制HSC激活,乳酸處理(可能通過(guò)H3K18la)可以挽救HSC激活,而醋酸處理則不能。

 

 

圖4、HK2基因缺失通過(guò)降低H3K18la來(lái)抑制HSC的激活,而外源性乳酸處理可以挽救H3K18la,而醋酸處理則不能

 

6、抑制外源性乳酸產(chǎn)生可以抑制HSC的激活

       為了繼續研究組蛋白乳酸化與HSC激活之間的關(guān)系,作者進(jìn)一步評估了乳酸生成藥物抑制劑治療后基因表達的激活。草酸酯通過(guò)抑制乳酸脫氫酶(LDH)抑制丙酮酸產(chǎn)生乳酸,而DCA通過(guò)抑制丙酮酸脫氫酶激酶(PDHK)增加丙酮酸轉化為乙酰輔酶a而不是乳酸來(lái)抑制乳酸的產(chǎn)生(圖5A)。正如之前報道的那樣,草酸酯和DCA處理顯著(zhù)降低了乳酸生成和細胞乳酸水平(圖5B、5C),這種干預抑制了小鼠原代HSC的細胞增殖,而不引起細胞死亡(圖5D)。草酸酯和DCA處理有效地降低了H3K18la和HSC激活誘導基因的表達,乳酸可以挽救HSC激活誘導基因,而乙酸補充不能(圖5E-5H)。為了進(jìn)一步確定LDH與HK2誘導的組蛋白乳酸化和隨后的基因表達之間的直接關(guān)系,作者在小鼠原代HSC中轉染了靶向LDH的小干擾RNA (siRNA)。與LDH抑制劑處理一致,Ldha的siRNA敲低降低了細胞乳酸水平和H3K18la以及HSC激活誘導的基因表達,乳酸處理恢復了細胞乳酸水平,而醋酸處理沒(méi)有恢復。TGF-b1被認為是在HSC纖維化信號通路中起重要作用的關(guān)鍵細胞因子。最近,越來(lái)越多的證據表明TGF-b1也通過(guò)增強HSC和成纖維細胞的糖酵解通量參與代謝重編程。因此,作者研究了TGF-b1對Lx-2細胞活化的影響。正如預期的那樣,TGF-b1增加了乳酸的產(chǎn)生,這一作用被草酸鹽或DCA處理所減弱。將葡萄糖水平從25 mM降低到5 mM會(huì )降低H3K18la,但TGF-b1在兩種葡萄糖濃度下均會(huì )增加H3K18la,同時(shí)降低H3K18ac。正如預期的那樣,TGF-b1誘導a-SMA基因表達和COL1A1基因表達。作者隨后的時(shí)間過(guò)程研究發(fā)現,在TGF-b1處理后的較晚時(shí)間點(diǎn)(6-24 h), H3K18la持續升高,這與HSC激活誘導基因的顯著(zhù)上調相關(guān)。相比之下,H3K18ac水平在1 h時(shí)略有升高,但在TGF-b1處理后,這種升高隨后持續降低。為了確定TGF-b1對Lx-2細胞中a-SMA基因啟動(dòng)子組蛋白修飾的影響,作者采用ChIPqPCR分析了啟動(dòng)子區域組蛋白的乳酸化和乙?;?。與作者的免疫印跡結果一致,TGF-b1增加了a-SMA啟動(dòng)子上的H3K18la,但降低了H3K18ac。接下來(lái),作者發(fā)現草酸酯和DCA降低了H3K18la,抑制了TGF-b1升高的a-SMA表達。作者進(jìn)一步證實(shí)這種抑制不是由于細胞死亡。在作者的拯救實(shí)驗中,乳酸可以恢復激活誘導基因的表達減少,而醋酸不能恢復。作者的研究結果表明,干擾乳酸的產(chǎn)生會(huì )降低H3K18la和HSC激活誘導基因的表達,乳酸可以恢復,而乙酸不能恢復。綜上所述,這些結果表明組蛋白乳酸化在HSC激活和隨后的基因表達誘導中起著(zhù)關(guān)鍵作用。

 

 

圖5、通過(guò)抑制乳酸生成或I類(lèi)HDAC抑制劑治療降低H3K18la,使造血干細胞失活

 

7、一類(lèi)HDAC抑制劑可提高H3K18ac,抑制H3K18la,從而抑制HSC激活誘導基因的表達

       組蛋白去乙?;?hdac)催化從組蛋白賴(lài)氨酸殘基中去除乙?;?,導致染色質(zhì)凝聚,抑制基因轉錄。先前的研究表明,在體外和體內,抑制僅局限于細胞核的I類(lèi)hdac可使HSC失活??紤]到作者的研究結果,H3K18la是一種新的組蛋白修飾,反映了HSC激活誘導基因的表達,作者假設I類(lèi)HDAC抑制劑可能誘導H3K18ac, H3K18la與H3K18la在組蛋白H3上相同的賴(lài)氨酸18殘基上競爭。首先,作者用I類(lèi)HDAC抑制劑apicidin和MS275 (entinostat)處理活化的小鼠原代HSC(圖5I)。抑制劑處理增加了H3K18ac,但降低了H3K18la,表明賴(lài)氨酸18的乙?;腿樗峄g存在競爭(圖5J)。其次,apicidin和MS275處理顯著(zhù)降低了基因表達和增殖的激活,這些影響不是由于細胞死亡(圖5K)。為了進(jìn)一步探索組蛋白乙?;腿樗峄g競爭的可能性,作者用乳酸和乙酸處理Lx-2細胞。單獨乳酸處理增加了a-SMA的表達,而單獨醋酸處理顯示相反的效果。有趣的是,當添加醋酸鹽時(shí),乳酸誘導的a-SMA表達被消除。事實(shí)上,H3K18la在乳酸處理下被高度升高,但當添加醋酸鹽時(shí),這種升高被抑制,因此H3K18ac水平恢復。因此,作者的研究結果表明,I類(lèi)HDAC抑制劑可能通過(guò)上調H3K18ac而失活HSC, H3K18la與H3K18la競爭,導致H3K18la依賴(lài)性基因表達下調。

8、HSC特異性和系統性的HK2缺失在體內抑制肝纖維化

       為了進(jìn)一步證實(shí)HK2/H3K18la在肝纖維化背景下在HSC中的作用,作者首先生成HK2f/f;LratCre小鼠,其中HK2可以在HSC中特異性刪除。小鼠注射CCl4 3周,誘導肝纖維化(圖6A)。Sirius red和Masson’s三色染色顯示,當HSC中缺失HK2時(shí),肝臟中CCl4引起的膠原積累明顯減少(圖6B和6E)。在膠原沉積的同時(shí),a-SMA在HSC特異性HK2-KO小鼠肝臟中的表達顯著(zhù)降低(圖6B和6D)。為了驗證H3K18la水平是否反映了體內HSC的激活,作者在給藥CCl4后從HSC特異性HK2-KO小鼠的肝臟中分離小鼠原代HSC。作者證實(shí),CCl4給藥后小鼠肝臟原代HSC中誘導的H3K18la水平因缺乏HK2而顯著(zhù)降低(圖6C)。然而,H3K18ac水平?jīng)]有改變。接下來(lái),ALT(丙氨酸轉氨酶)和AST(天冬氨酸轉氨酶)的測定顯示,HSC中HK2的缺失對肝毒性沒(méi)有顯著(zhù)影響(圖6F)??紤]到外源性乳酸補充在體外挽救了HK2缺失的HSC的HSC激活表型,作者接下來(lái)通過(guò)注射2 g/kg乳酸(腹腔注射)來(lái)評估乳酸對HSC特異性HK2-KO小鼠的影響,連續注射CCl4 3周,每隔一天一次。有趣的是,作者的Sirius red和a-SMA免疫染色結果顯示,體內添加乳酸后,HSC特異性HK2-KO小鼠肝臟中膠原沉積減少和a-SMA表達恢復??傊?,作者的研究結果表明,HSC特異性缺失HK2可減輕HSC中的H3K18la并抑制肝纖維化,而體內慢性和全身乳酸治療可恢復膠原沉積和a-SMA表達。作者之前的研究表明,成年小鼠的全身HK2缺失對乳腺癌和肺癌具有良好的耐受性和治療性,沒(méi)有不良的生理后果。接下來(lái),作者用CCl4治療系統性HK2缺失小鼠3周(圖7A)。值得注意的是,作者的Sirius red和Masson’s三色染色結果顯示,在系統性缺失HK2后,肝臟中的膠原積累明顯受到抑制(圖7B和7D)。此外,證實(shí)a- SMA表達顯著(zhù)減少(圖7B和7C)。為了進(jìn)一步分析系統性HK2缺失的抗纖維化作用,作者接下來(lái)在注射他莫昔芬后建立了bdl誘導的HK2f/f;UBCCreERT2小鼠纖維化模型(圖7F)。與作者之前的體內實(shí)驗結果一致,系統性缺失HK2有效抑制了bdl小鼠肝臟中膠原的積累和a-SMA的表達(圖7G-7I)。在ccl4誘導和bdl誘導的纖維化模型中,血清ALT和AST活性在HK2熟練組和HK2缺乏組之間相似,這表明體內系統性的HK2缺失不會(huì )引起顯著(zhù)的細胞毒性(圖7E和7J)。接下來(lái),為了進(jìn)一步了解系統性HK2缺失對治療潛力的影響,作者首先用CCl4治療3周誘導肝纖維化,然后嘗試系統性地刪除HK2(圖7K)。在系統性缺失HK2的小鼠肝臟中,Sirius紅和Masson三色染色顯示膠原沉積明顯減少(圖7L和7M)。作者觀(guān)察到,在肝纖維化建立后,當全身缺失HK2時(shí),a-SMA的表達也減少(圖7N)。 此外,在誘導肝纖維化后,刪除HK2對血清ALT和AST活性沒(méi)有明顯影響(圖7O)。綜上所述,作者的研究結果表明,靶向HK2可以系統性地抑制HSC的激活;因此,HK2可能是肝纖維化的治療靶點(diǎn)。

 

 

圖6、造血干細胞中特異性缺失HK2可改善ccl4誘導的肝纖維化

 

圖7、體內系統缺失HK2對ccl4和bdl誘導的肝纖維化的抑制作用

 

結論

       總之,作者發(fā)現HK2介導的乳酸生成通過(guò)組蛋白乳酸化影響基因表達。作者發(fā)現在活化的HSC中誘導HK2的表達對于HSC的激活至關(guān)重要,并且由HK2表達引起的組蛋白乳酸化決定了HSC激活后的基因表達。此外,作者的研究結果表明,干預HK2/H3K18la軸是肝纖維化的一種潛在治療策略。

 

實(shí)驗方法

WB, qPCR,IHC,IF,RNA-seq,CUT&Tag,CHIP-qPCR,CHIP-seq,ECAR,OCR,代謝組學(xué) 

參考文獻

Rho H, Terry AR, Chronis C, Hay N. Hexokinase 2-mediated gene expression via histone lactylation is required for hepatic stellate cell activation and liver fibrosis. Cell Metab. 2023 Aug 8;35(8):1406-1423.e8. doi: 10.1016/j.cmet.2023.06.013. Epub 2023 Jul 17. PMID: 37463576.