長(cháng)時(shí)間麻醉的確會(huì )有不良后果哦

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2024-06-14
研究表明,長(cháng)時(shí)間麻醉會(huì )引發(fā)NF-κB炎癥通路激活、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元興奮性抑制、認知功能障礙和焦慮樣行為......

 

      老年手術(shù)患者圍手術(shù)期神經(jīng)認知障礙(PND)的發(fā)生率很高,這與麻醉誘導的長(cháng)時(shí)間神經(jīng)毒性密切相關(guān)。麻醉誘導的神經(jīng)毒性的神經(jīng)形態(tài)病理學(xué)基礎一直難以捉摸。這項研究表明,長(cháng)時(shí)間麻醉會(huì )引發(fā)NF-κB炎癥通路激活、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元興奮性抑制、認知功能障礙和焦慮樣行為。RNA 測序發(fā)現,長(cháng)時(shí)間麻醉后,不同類(lèi)型突觸的基因下調。小膠質(zhì)細胞的遷移、活化和吞噬作用增強。同時(shí)還觀(guān)察到小膠質(zhì)細胞形態(tài)的改變。補體級聯(lián)的啟動(dòng)子 C1qa 和 C3 增加,標記突觸的 C1qa 也升高。然后,作者發(fā)現 "Eat Me "補體途徑介導了長(cháng)時(shí)間麻醉后海馬的小膠質(zhì)細胞突觸吞噬。之后,海馬突觸明顯丟失。此外,樹(shù)突棘減少,其基因也被下調。敲除小膠質(zhì)細胞可以改善神經(jīng)炎癥和補體的激活,并挽救突觸丟失、認知功能障礙和焦慮樣行為。當神經(jīng)炎癥受到抑制或 C1q 中和時(shí),補體也會(huì )減少,突觸消失也會(huì )中斷。這些研究結果表明,長(cháng)時(shí)間麻醉會(huì )引發(fā)神經(jīng)炎癥和補體介導的小膠質(zhì)細胞突觸吞噬,從而在病理上導致 七氟醚誘導的神經(jīng)毒性(SIN)中的突觸消失。本文證明了 SIN 的神經(jīng)形態(tài)病理學(xué)基礎,這對 PND 患者有直接的治療意義。本文于2023年1月發(fā)表在《BMC Medicine》IF: 9.3期刊上

技術(shù)路線(xiàn)

 

 

 

主要實(shí)驗結果

1、長(cháng)時(shí)間麻醉會(huì )引發(fā)認知功能障礙和焦慮樣行為

       第一次實(shí)驗的時(shí)間表如圖1a所示。圖1的MWM、OFT以及EPM實(shí)驗表明長(cháng)時(shí)間七氟烷暴露誘導的 SIN 大鼠模型表現出一些神經(jīng)行為改變,包括認知功能障礙和焦慮樣行為。

 

 

圖1 長(cháng)時(shí)間麻醉引起大鼠認知功能障礙和焦慮樣行為

 

2、長(cháng)時(shí)間麻醉誘導神經(jīng)炎癥,上調NF-κB炎癥通路,下調神經(jīng)元興奮性,使凋亡信號失活

       臨床上,PND 主要發(fā)生在手術(shù)和麻醉后 1 周內。結合行為實(shí)驗的結果,在七氟烷暴露后的第一天采集了大鼠的腦組織。ELISA表明,七氟烷暴露后,大腦皮層和海馬中的促炎細胞因子,包括 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 都增加了(圖 2 A、B)。與對照組相比,Sevo 組海馬中磷酸-NF-κB p65 的表達上調(圖 2 D)。七氟烷暴露后,海馬中 Phospho-NF-κB p65 向細胞核的轉位增加(圖 2 E)。然后,關(guān)注七氟烷暴露對神經(jīng)元的影響,神經(jīng)元是認知功能的執行細胞基礎。HE 染色顯示,兩組患者海馬中神經(jīng)元的形態(tài)完好無(wú)損(圖 2 C)。IF 染色顯示,作為海馬 CA1 區神經(jīng)元興奮性參數的 C-fos 在七氟醚暴露后下調(圖 2 F)。同樣,腦電圖也顯示海馬中的突發(fā)性抑制。圖 2 G 顯示了具有代表性的海馬腦電圖原始軌跡(上圖)和功率頻譜圖(下圖),它們顯示了七氟烷暴露后向突發(fā)性抑制的過(guò)渡。如圖 2 H 所示,BSR 的顯著(zhù)增加也證明了這一變化。這種神經(jīng)興奮性的抑制促使作者探索它是否受到神經(jīng)元凋亡的影響。七氟醚暴露后,海馬 CA1 區和皮層的 TUNEL 檢測呈陰性,無(wú)神經(jīng)元凋亡(圖 2 I)。Nissl 染色也表明,七氟與對照組海馬 CA1 區的 Nissl 體數量沒(méi)有差異(圖 2 J)。凋亡相關(guān)蛋白表達也沒(méi)有明顯改變(圖2 K-M)。因此,七氟醚暴露對細胞凋亡信號轉導沒(méi)有影響。更重要的是,長(cháng)時(shí)間麻醉會(huì )誘導神經(jīng)炎癥激活,激活 NF-κB 炎癥通路,并下調神經(jīng)元的興奮性。

 

 

圖2 長(cháng)時(shí)間麻醉誘導神經(jīng)炎癥,上調NF-κB炎癥通路,下調神經(jīng)元興奮性,使凋亡信號失活

 

3、長(cháng)時(shí)間麻醉誘導小膠質(zhì)細胞激活,促炎表型標志物增加,抗炎表型標志物減少,海馬小膠質(zhì)細胞形態(tài)改變

       小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(CNS)的常駐吞噬細胞,是應激源的第一反應者,它們會(huì )迅速調整表型并發(fā)生功能變化,并參與 SIN 的病理過(guò)程。與對照組相比,七氟醚暴露后海馬中的促炎表型標志物,包括 TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、CD86 mRNA 和 iNOS mRNA 均上調(圖 3 A)。此外,與對照組相比,抗炎表型標記物,包括海馬中的 IL-4 mRNA、IL-10 mRNA、CD206 mRNA 和 Arg1 mRNA 均下調(圖 3 B)。iba1(一種小膠質(zhì)細胞活化標記物)的 IF 染色顯示,與對照組相比,七氟醚暴露后海馬中的小膠質(zhì)細胞數量增加(圖 3 C、E),這意味著(zhù)小膠質(zhì)細胞活化。與對照組相比,七氟醚暴露后海馬 CA1 區的抗炎標記物 Arg-1 下調(圖 3 D, I)。使用 Sholl 分析來(lái)確定海馬 CA1 區的小膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)改變,以確認其激活和功能變化(圖 3 F)。圖中的intersection mask圖描述了小膠質(zhì)細胞偽足的空間分布和數量(圖 3 F)。七氟烷暴露后,小膠質(zhì)細胞固縮增加,最大交集數減少(圖 3 G、H),這意味著(zhù)小膠質(zhì)細胞面積擴大,小膠質(zhì)細胞偽足數量減少。交叉圖顯示,七氟烷暴露后,偽足分布更靠近小膠質(zhì)細胞體(圖 3 K),這說(shuō)明小膠質(zhì)細胞偽足回縮。此外,利用小膠質(zhì)細胞的三維圖像來(lái)觀(guān)察小膠質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)改變。如圖 3 J 所示,小膠質(zhì)細胞的細胞體增大,偽足減少并變短,七氟烷暴露強烈誘導了這些小膠質(zhì)細胞形態(tài)的改變。

 

 

圖3長(cháng)時(shí)間麻醉誘導小膠質(zhì)細胞激活,促炎表型標志物增加,抗炎表型標志物減少,海馬小膠質(zhì)細胞形態(tài)改變

 

4、RNA-seq分析顯示長(cháng)時(shí)間麻醉后海馬DEGs富集不同突觸通路中,突觸相關(guān)基因下調

       使用 RNA-seq 篩選通路和基因,以確定導致 SIN 的可能神經(jīng)形態(tài)病理學(xué)基礎。令人驚訝的是,KEGG通路富集和GO富集分析都強烈表明,大多數DEGs與不同的突觸或突觸成分有關(guān)(圖4)。

 

 

圖4 RNA-seq分析顯示,長(cháng)時(shí)間麻醉后海馬DEGs富集至不同突觸通路中,突觸相關(guān)基因下調

 

5、長(cháng)時(shí)間麻醉會(huì )增強小膠質(zhì)細胞的吞噬和趨化能力,并通過(guò)補體介導的小膠質(zhì)細胞修剪導致海馬突觸消失

       根據 RNA-seq 的結果,尋找將突觸丟失與補體介導的小膠質(zhì)細胞修剪聯(lián)系起來(lái)的證據。有報道稱(chēng),小膠質(zhì)細胞的突觸修剪可持續監測突觸和大腦發(fā)育,補體驅動(dòng)的病理性突觸修剪也在許多中樞神經(jīng)系統疾病中有所報道,包括阿爾茨海默病和額顳葉癡呆。首先,作者發(fā)現與對照組相比,Sevo 組海馬中的突觸標記物,包括 PSD95 mRNA、SYN1 mRNA 和 SYP mRNA 均出現下調(圖 5 A)。此外,與對照組相比,Sevo 組海馬中的 PSD95、SYN1 和 SYP 蛋白水平也出現了下調(圖 5 E、G-I)。突觸相關(guān)蛋白下調,這與 RNA 序列結果一致。隨后證實(shí)海馬中的補體標志物,包括 C1qa 和 C3,在蛋白和 mRNA 水平上也出現了上調(圖 5 B、E、F)。其次,CD68 作為小膠質(zhì)細胞吞噬標記物,在海馬中的蛋白和 mRNA 水平都有所增加(圖 5 C-E)。此外,海馬 CA1 區與 CD68 共定位的小膠質(zhì)細胞數量也有所增加(圖 5 J、K)。CX3CR1由小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元共同表達,介導小膠質(zhì)細胞的粘附、趨化和遷移功能。第三,與對照組相比,Sevo 組海馬 CA1 區標記有 CX3CR1 的小膠質(zhì)細胞數量增加(圖 5 M、N)。第四,檢測到七氟烷暴露后海馬 CA1 區小膠質(zhì)細胞標記 PSD95 的數量增加,表明小膠質(zhì)細胞吞噬了 PSD95 點(diǎn)(圖 5 L, O, P)。最后,觀(guān)察到小膠質(zhì)細胞定植 C1qa 的數量增加,表明長(cháng)時(shí)間麻醉誘導小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生補體 C1qa(圖 5 Q、R)。因此,吞噬能力增強、活性亢進(jìn)、粘附性和趨化性增強的小膠質(zhì)細胞會(huì )分泌補體,吞噬不同的突觸,導致突觸丟失和突觸蛋白減少。

 

 

圖5 長(cháng)時(shí)間麻醉增強小膠質(zhì)細胞吞噬和趨化性,然后觸發(fā)小膠質(zhì)突觸吞噬,導致突觸丟失

 

       有報道稱(chēng),C1qa 和 C3 參與突觸丟失,在突觸修剪過(guò)程中標記神經(jīng)元之間不適當的突觸連接,以便被吞噬小膠質(zhì)細胞清除。在海馬 CA1 區,Sevo 組與對照組相比,標記有 PSD95 點(diǎn)的 C1qa 數量增加(圖 6 A、D),這表明七氟烷暴露誘導了補體介導的突觸修剪。采用 IF 染色法檢測突觸數量和突觸密度。PSD95(突觸后蛋白標記)、SYN1(突觸前蛋白標記)和 SYP(突觸前蛋白標記)用于檢測突觸數量和突觸密度。與對照組相比,Sevo 組海馬 CA1 區的突觸密度(SYN1 點(diǎn))降低(圖 6 B,F)。此外,七氟醚暴露后海馬 CA1 區的突觸數量(PSD95 與 SYP 點(diǎn)相連)也減少了(圖 6 E、G)。用掃描電鏡觀(guān)察突觸的超微結構改變,以檢測突觸小泡、突觸前膜和突觸后膜、活動(dòng)區和突觸間隙。在 Sevo 組,突觸小泡減少,突觸后膜連續性中斷(圖 6 C)。因此,突觸數量和密度的減少以及突觸超微結構的改變與補體介導的小膠質(zhì)細胞修剪有關(guān)。

       根據 RNA-seq 結果,發(fā)現樹(shù)突棘和樹(shù)突中富集的 DEGs 大多被下調(圖 6 H、I 和圖 4 B)。這顯然表明樹(shù)突棘和樹(shù)突在七氟烷暴露后受到破壞。使用高爾基染色和 Sholl 分析檢測了海馬 CA1 區樹(shù)突棘和樹(shù)突的結構變化(圖 6 J)。與對照組相比,Sevo 組樹(shù)突棘(蘑菇狀、粗壯狀、細長(cháng)狀和總狀)的數量減少了(圖 6 K、N)。在 Sholl 分析中,Sevo 組神經(jīng)元的最大交集數低于對照組(圖 6 L、M)。圖 6 M 顯示了樹(shù)突和樹(shù)突棘的空間分布和數量。

 

 

圖6 長(cháng)時(shí)間麻醉通過(guò)補體介導的突觸消融和樹(shù)突棘及其基因減少引起海馬突觸消融

 

6、小膠質(zhì)細胞耗竭挽救了SIN大鼠的認知功能障礙并改善了焦慮樣行為

       接下來(lái),研究過(guò)度活躍的小膠質(zhì)細胞是否會(huì )在認知功能障礙和焦慮樣行為中發(fā)揮關(guān)鍵作用。第二個(gè)實(shí)驗的時(shí)間表如圖 7 A 所示。利用補充了 PLX3397 的飲食喂養大鼠,以消除小膠質(zhì)細胞群,同時(shí)又不會(huì )對正常動(dòng)物造成明顯的認知損傷。PLX3397能有效減少海馬中的小膠質(zhì)細胞數量和iba1蛋白水平(圖7 B-D)。在MWM測試中,PLX3397增加了穿越平臺的次數和在平臺象限中游泳的時(shí)間,從而緩解了七氟烷暴露造成的認知障礙(圖7 E和F)。在 OFT 試驗中,PLX3397 治療增加了進(jìn)入中心區的次數和時(shí)間,緩解了焦慮和壓力(圖 7 G、H)。在 EPM 試驗中,開(kāi)放臂的停留時(shí)間和進(jìn)入開(kāi)放臂的次數增加了,這同樣改善了焦慮樣行為(圖 7 I、J)。令人驚訝的是,小膠質(zhì)細胞耗竭后,與 SYP 點(diǎn)定位的補體急劇減少,這意味著(zhù)小膠質(zhì)細胞耗竭改善了由補體驅動(dòng)的病理性突觸修剪(圖 7 K、L)。

 

 

圖7 小膠質(zhì)細胞耗竭挽救了SIN大鼠的認知功能障礙并改善了焦慮樣行為

 

7、RNA-seq分析表明消耗小膠質(zhì)細胞可挽救海馬突觸相關(guān)基因的下調

       為研究小膠質(zhì)細胞缺失是否能挽救突觸消融,再次使用 RNA-seq 鑒定 DEGs 及其富集,如圖8所示,不出所料,這些 DEGs 和富集途徑也與突觸相關(guān)。

 

 

圖8 RNA-seq分析顯示,小膠質(zhì)細胞缺失后海馬中DEGs富集至不同突觸通路,且突觸相關(guān)基因上調

 

8、小膠質(zhì)細胞缺失改善了NF-κB炎癥通路的激活、海馬炎癥、補體激活和突觸消融

       隨后研究PLX3397 治療是否能破壞小膠質(zhì)細胞的吞噬功能、炎癥反應、補體生成和突觸丟失。ELISA顯示,海馬中的促炎細胞因子 IL-1β 和 TNF-α 有所減少(圖 9 A、B)。此外,PLX3397 通過(guò)下調磷酸-NF-kB p65 的表達,顯著(zhù)抑制 NF-κB 的炎癥通路(圖 9 E、F)。此外,PLX3397 還能抑制小膠質(zhì)細胞的吞噬(下調 CD68 表達)和補體生成(圖 9 C、D)。然后,通過(guò) PLX3397 處理消耗小膠質(zhì)細胞可挽救突觸的消除并恢復突觸蛋白的表達(圖 9 G-J)。因此,PLX3397 誘導的小膠質(zhì)細胞缺陷阻止了小膠質(zhì)細胞介導的病理生理效應,包括神經(jīng)炎癥、補體產(chǎn)生、突觸修剪和突觸消除。

9、神經(jīng)炎癥抑制拯救突觸消除和抑制補體激活

       消除小膠質(zhì)細胞和抑制神經(jīng)炎癥的治療效果可以挽救突觸損失。然而,僅抑制神經(jīng)炎癥是否能逆轉突觸缺失尚不清楚。使用非甾體抗炎藥美洛昔康(NSAID-meloxicam)來(lái)減輕神經(jīng)炎癥,并檢測抗神經(jīng)炎癥對突觸缺失的影響。美洛昔康可以有效抑制海馬的神經(jīng)炎癥(圖 9 M)。令人驚訝的是,神經(jīng)炎癥抑制還能減少突觸消除,降低補體激活,并挽救突觸蛋白的損失(圖 9 L-P)。同時(shí),神經(jīng)炎癥抑制后與 PSD95 標記的 C1q 數量急劇下降(圖 9 Q)。因此,通過(guò)抑制補體介導的突觸丟失來(lái)抑制神經(jīng)炎癥可以逆轉長(cháng)期麻醉誘導的病理性突觸損傷。

 

 

圖9 小膠質(zhì)細胞缺失改善了NF-κB炎癥通路的激活、海馬炎癥、補體激活和突觸消融,神經(jīng)炎癥抑制也挽救了突觸消融

 

10、C1q中和抑制補體介導的突觸消除和抑制小膠質(zhì)細胞激活,從而改善SIN大鼠的認知功能障礙和焦慮樣行為

       第四次實(shí)驗的時(shí)間表如圖10A所示。使用 C1q 中和抗體來(lái)減少 C1q 并檢測補體對突觸丟失的影響。ELISA 分析表明,C1q 中和抗體能有效降低海馬中的 C1q 水平(圖 10 G)。WB 分析也證實(shí),C1q 中和抗體能顯著(zhù)下調海馬中 C1qa 的表達(圖 10 E、H)。在 CFC 中,C1q 中和增加了凝固時(shí)間的百分比,從而挽救了七氟烷暴露造成的認知障礙(圖 10 B)。在 OFT 中,C1q 中和增加了進(jìn)入中心區的次數和時(shí)間,從而緩解了焦慮和壓力(圖 10 C、D)。在 C1q 中和的同時(shí),iba1 的表達下調(圖 10 F、I)。同時(shí),海馬中突觸蛋白(PSD95、SYN1 和 SYP)的表達也有所增加(圖 10 J-N)。因此,C1q中和可抑制補體介導的突觸消除和抑制小膠質(zhì)細胞活化,從而挽救突觸丟失,改善SIN大鼠的認知功能障礙和焦慮樣行為。

 

 

圖10 SIN大鼠的C1q中和挽救突觸消融,抑制小膠質(zhì)細胞激活,改善認知功能障礙和焦慮樣行為

 

       總之,七氟醚對大鼠的長(cháng)時(shí)間麻醉會(huì )引發(fā)認知障礙、焦慮樣行為、神經(jīng)炎癥和補體激活。在長(cháng)時(shí)間麻醉后,海馬中的補體和神經(jīng)炎癥會(huì )導致小膠質(zhì)細胞突觸消失和樹(shù)突棘脫落。海馬中吞噬性和趨化性小膠質(zhì)細胞明顯增加,C1qa在突觸上聚集,突觸蛋白和基因下調?;罨男∧z質(zhì)細胞具有特定的形態(tài)結構和表型,會(huì )誘發(fā)神經(jīng)炎癥和補體激活,吞噬突觸,導致突觸丟失。通過(guò) PLX3397 治療消耗小膠質(zhì)細胞可阻止這一過(guò)程。此外,用美洛昔康和 C1q 中和抑制神經(jīng)炎癥也能挽救突觸丟失。     

 

 

圖11 SIN 的發(fā)病機理圖。

 

實(shí)驗方法

SD大鼠處理和建模,大鼠飼料中PLX3397配方,美洛昔康注射液,莫里斯水迷宮(MWM),礦場(chǎng)實(shí)驗(OFT),高架十字迷宮實(shí)驗(EPM),電極放置和海馬局部場(chǎng)電位(LFP)記錄,突發(fā)抑制識別與分析,RNA-seq,RT-PCR,ELISA,WB,免疫熒光染色,HE,Nissl染色,TUNEL,掃描電子顯微鏡(SEM),高爾基染色法,Sholl分析和定量形態(tài)學(xué)

參考文獻

Xu F, Han L, Wang Y, Deng D, Ding Y, Zhao S, Zhang Q, Ma L, Chen X. Prolonged anesthesia induces neuroinflammation and complement-mediated microglial synaptic elimination involved in neurocognitive dysfunction and anxiety-like behaviors. BMC Med. 2023 Jan 5;21(1):7. doi: 10.1186/s12916-022-02705-6.