IGF2BP3通過m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)喉癌中TMA7介導(dǎo)的自噬和順鉑耐藥
翻譯體系相關(guān)的7同源物（TMA7）與增殖相關(guān)疾病密切相關(guān)。然而，TMA7在喉鱗狀細(xì)胞癌（LSCC）中的作用和調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討TMA7在喉癌發(fā)生發(fā)展中的作用，并探討其作用機(jī)制。TMA7在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)上調(diào)，并與預(yù)后不良有關(guān)。TMA7下調(diào)后，自噬水平增加，抑制了LSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。M6A甲基化閱讀器IGF2BP3增強(qiáng)了TMA7的穩(wěn)定性，降低了自噬水平。TMA7與UBA2直接相互作用。此外，IGF2BP3調(diào)節(jié)的TMA7-UBA2-PI3K通路的激活是TMA7抑制自噬、促進(jìn)喉癌進(jìn)展的主要機(jī)制。目前的研究表明，IGF2BP3介導(dǎo)的TMA7 m6A修飾通過UBA2-PI3K途徑促進(jìn)LSCC的進(jìn)展和順鉑耐藥，為LSCC自噬相關(guān)機(jī)制、潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供了新的見解。本文于2023年2月發(fā)表于《International Journal of Biological Sciences》期刊上，IF=9.2
主要技術(shù)路線：
1、喉癌組織中TMA7癌基因表達(dá)上調(diào)
為了研究該基因的表達(dá)，我們選擇了5對(duì)喉癌和癌旁組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合分析。我們選擇了OmicStudio工具來分析數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖1a-e所示。在log2FoldChange>1或log2FoldChange<-1（p<0.05）的轉(zhuǎn)錄分析中，剔除極端數(shù)據(jù)后，選取有代表性的基因進(jìn)行聚類分析，其中54個(gè)基因與癌旁組織相比顯著上調(diào)，11個(gè)基因顯著下調(diào)（圖1A）。在蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果中，在p<0.05處，2486個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出顯著差異。在相同條件下，剔除極端數(shù)據(jù)后，選擇具有代表性的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚類分析，與癌旁組織相比，15個(gè)蛋白質(zhì)顯著上調(diào)，15個(gè)蛋白質(zhì)顯著下調(diào)（圖1B）。
轉(zhuǎn)錄組分析表明，6828個(gè)基因在患者樣本中與鄰近組織中存在差異表達(dá)。在蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中，共有6187個(gè)蛋白質(zhì)得到了差異表達(dá)。在兩組數(shù)據(jù)中總共有2131個(gè)差異表達(dá)的基因（圖1C）。對(duì)這兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析表明，在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中存在差異表達(dá)的基因，如圖1D所示。藍(lán)點(diǎn)代表了兩個(gè)具有相同組學(xué)表達(dá)趨勢(shì)的基因?；鹕綀D也是使用OmicStudio工具進(jìn)行的（圖1E）。此外，我們?cè)u(píng)估了在特定篩選條件下喉癌組織中上調(diào)基因的意義、組織中的蛋白質(zhì)含量以及差異表達(dá)倍數(shù)，并鑒定了上調(diào)表達(dá)的基因。
其中，TMA7在RNA和蛋白質(zhì)水平上均有上調(diào)。因此，我們選擇TMA7作為目的基因。統(tǒng)計(jì)分析表明，喉癌組織中TMA7的表達(dá)水平在蛋白質(zhì)水平和RNA水平均高于癌旁組織。根據(jù)喉癌組織中TMA7的表達(dá)情況分析其臨床病理特征（表1）。如表1所示，喉癌TMA7高表達(dá)患者的臨床分期（***p<0.001）和T分期（**p<0.01）均較高。此外，TMA7升高的患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（***p<0.001）和頻繁復(fù)發(fā)（**p<0.01）。然而，TMA7的表達(dá)與年齡、性別和原發(fā)部位無關(guān)。此外，Kaplan-Meier生存曲線顯示TMA7升高與預(yù)后不良相關(guān)（圖1F-G）。因此，TMA7的IHC是在喉癌和癌旁組織中進(jìn)行的，如圖1H所示。
圖1 TMA7作為癌基因在喉癌組織中表達(dá)上調(diào)
2、TMA7影響喉鱗狀細(xì)胞癌的增殖、侵襲、遷移和凋亡
為了闡明TMA7在LSCC細(xì)胞中的生物學(xué)功能，我們用慢病毒TU177、AMC - HN8和TU212的shRNA轉(zhuǎn)染LSCC細(xì)胞系來KD TMA7的表達(dá)（TMA7-KD）。RT-qPCR和Western blot證實(shí)TMA7被成功敲除（圖2A, B）。集落形成和EdU檢測(cè)顯示TMA7-KD抑制細(xì)胞增殖（圖2C, D）。Transwell分析顯示，TMA7 KD降低了LSCC細(xì)胞的侵襲性（圖2e）。隨后，通過傷口愈合試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估了LSCC細(xì)胞的遷移能力降低，隨后TMA7水平下降（圖2F）。在LSCC細(xì)胞TMA7-KD后，細(xì)胞的凋亡率增加（圖2G）。綜上所述，這些結(jié)果表明TMA7-KD減弱了LSCC細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和集落形成能力，增加了細(xì)胞的凋亡率。
圖2 TMA7影響喉鱗狀細(xì)胞癌的增殖、侵襲、遷移和凋亡
3、TMA7與喉癌細(xì)胞自噬相關(guān)
為了研究TMA7與下游分子之間的調(diào)控相關(guān)性，我們對(duì)三個(gè)LSCC細(xì)胞系及其相應(yīng)的TMA7 KD細(xì)胞系進(jìn)行了RNA-SEQ檢測(cè)。相關(guān)下游RNA分子的表達(dá)水平發(fā)生了變化。我們還發(fā)現(xiàn)，在FC≥1.5且p<0.05的截止點(diǎn)TMA7-KD上調(diào)了945個(gè)基因，下調(diào)了2521個(gè)基因。接下來，我們篩選出了泛素樣修飾物激活酶2（UBA2），它通過添加小蛋白SUMO（參見SUMO 1；MIM 601912）或類泛素化來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)定位，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。我們發(fā)現(xiàn)它的mRNA水平降低，經(jīng)過GO分析，它與蛋白質(zhì)結(jié)合有關(guān)。數(shù)據(jù)庫分析表明，它在UniProt預(yù)測(cè)的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。UBA2-KD促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的凋亡。本研究討論了與細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)的表型，因?yàn)榧?xì)胞凋亡和自噬與癌癥有關(guān)。因此，我們推測(cè)UBA2除了與細(xì)胞凋亡有關(guān)外，是否還與自噬有關(guān)，這在以前還沒有描述過。本研究探討了UBA2與自噬表型相關(guān)途徑的調(diào)控關(guān)系，并選擇UBA2作為TMA7的下游基因進(jìn)行進(jìn)一步研究。
為了研究喉鱗狀細(xì)胞癌TMA7-OE細(xì)胞生物學(xué)功能的變化，將TMA7-OE慢病毒導(dǎo)入LSCC細(xì)胞。RT-qPCR結(jié)果顯示，TMA7-OE慢病毒感染LSCC細(xì)胞后，TMA7的表達(dá)相應(yīng)增加（圖3A）。TMA7-OE慢病毒從Genecem（MD，美國(guó)）獲得。此外，我們進(jìn)行了Western印跡以驗(yàn)證LSCC細(xì)胞TMA7的OE和KD（圖3B）。結(jié)果表明，TMA7在LSCC細(xì)胞中成功地過表達(dá)或沉默（圖2B，圖8A），蛋白質(zhì)含量相應(yīng)地增加和減少。為了研究LSCC細(xì)胞中的自噬和TMA7，我們檢測(cè)了與自噬相關(guān)的蛋白：P62、LC3B-I和LC3B-II。TMA7-OE后，細(xì)胞自噬減弱，p62表達(dá)增加，LC3B-II/I比值降低。TMA7-KD提供了相互矛盾的結(jié)果（圖3B）。
用黃色自噬小體（mCherry和GFP）和紅色自噬溶體（MCherry）標(biāo)記的串聯(lián)熒光報(bào)告基因（mCherryGFP-LC3）直接監(jiān)測(cè)自噬通量。因此，黃點(diǎn)和紅點(diǎn)分別表示自噬小體和自噬溶體。用腺病毒（mCherry-GFP-LC3、韓恒、中國(guó)）感染用TMA7OE或KD感染的LSCC和對(duì)照細(xì)胞。共聚焦顯微鏡顯示，單個(gè)細(xì)胞的黃點(diǎn)和紅點(diǎn)的比例不變，但點(diǎn)數(shù)增加。分析表明，自噬-溶酶體代謝沒有改變，總體自噬水平增加。TMA7-KD后自噬增加，TMA7-OE后自噬減少（圖3C）。UBA2的表達(dá)在TMA7-KD后減少，TMA7-OE后增加（圖3B）。因此，我們推測(cè)UBA2可能是TMA7的下游分子，并被選中進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
圖3 TMA7與喉鱗狀細(xì)胞癌自噬相關(guān)
4、IGF2BP3在喉癌細(xì)胞中的癌基因功能
對(duì)來自多個(gè)數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因的分析表明，除了TMA7上調(diào)外，IGF2BP3在喉癌組織中也上調(diào)。在LSCC細(xì)胞中，IGF2BP3-KD或-OE后，IGF2BP3水平成功改變（圖4A-B）。免疫印跡顯示IGF2BP3-KD后IGF2BP3、TMA7和UBA2表達(dá)降低，而IGF2BP3-OE后IGF2BP3、TMA7和UBA2表達(dá)增加。為了研究IGF2BP3與LSCC細(xì)胞自噬的相關(guān)性，我們檢測(cè)了自噬相關(guān)蛋白P62和LC3B。IGF2BP3-OE后，自噬減弱，p62增加，Lc3B-II/I比值降低。相反，IGF2BP3的下調(diào)導(dǎo)致了相反的結(jié)果（圖4C）。
接下來，我們研究了IGF2BP3對(duì)LSCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響?？寺⌒纬?、EDU、傷口愈合和Transwell分析表明IGF2BP3-KD抑制LSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲（圖4D-f，4h），而IGF2BP3-OE促進(jìn)相反的結(jié)果。IGF2BP3-KD后LSCC細(xì)胞的凋亡增加，IGF2BP3-OE后LSCC細(xì)胞的凋亡減少（圖4G）。IGF2BP3-KD后自噬水平增強(qiáng)，IGF2BP3-OE后自噬水平減弱（圖4I）。
IGF2BP3促進(jìn)LSCC細(xì)胞遷移、增殖和侵襲，減少細(xì)胞凋亡和自噬，調(diào)節(jié)TMA7和UBA2的表達(dá)水平。
圖4 IGF2BP3在喉癌細(xì)胞中起癌基因的作用
5、IGF2BP3通過m6A甲基化調(diào)控TMA7
m6A在mRNA調(diào)控中起重要作用。TMA7 mRNA的3’-未翻譯（UTR）序列包含一個(gè)典型的m6A修飾基序，該基序由生物信息學(xué)分析（圖5A）管理。為了預(yù)測(cè)m6A修飾的可能位點(diǎn)，我們對(duì)MEME進(jìn)行了基序預(yù)測(cè)，得到了預(yù)測(cè)的m6A修飾位點(diǎn)序列RRACH（D=A、G或U；R=A或G；H=A、U或C）。m6A甲基化修飾發(fā)生在基序的A堿基上（圖5B）。Western印跡分析表明，在TU212細(xì)胞中的TMA7正義RNA探針下拉樣本中存在IGF2BP3（圖5C）。為了證明IGF2BP3與TMA7之間的相互作用，我們進(jìn)行了RIP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明IGF2BP3可能與TMA7結(jié)合（圖5D）。接下來，我們?cè)?span>TU212中進(jìn)行了MERIP，并在TMA7的3’-UTR區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個(gè)m6A修飾位點(diǎn)。因此，我們選擇了上述序列并進(jìn)行了下一步的驗(yàn)證。MERIP后的RT-qPCR分析（m6A RIP）進(jìn)一步證實(shí)了m6A修飾的TMA7 mRNA（圖5E）。與促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯的潛在作用相一致，減少TMA7 mRNA的m6A修飾降低了TMA7蛋白的表達(dá)和新生TMA7蛋白的合成。（圖4C）。隨后，我們得出結(jié)論：IGF2BP3直接與TMA7的mRNA分子結(jié)合。IGF2BP3 OE或KD后，用Actinomycin D檢測(cè)TMA7 mRNA在LSCC細(xì)胞上的穩(wěn)定性。如前所述，提取總RNA用于RT-qPCR分析。計(jì)算指定時(shí)間點(diǎn)的mRNA表達(dá)，并根據(jù)GAPDH的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。因此，我們得出結(jié)論，IGF2BP3的消除可以縮短TMA7 mRNA的半衰期。IGF2BP3-OE延長(zhǎng)了TMA7 mRNA的半衰期（圖5F，g）。
圖5 IGF2BP3通過m6A甲基化識(shí)別和結(jié)合TMA7
6、UBA2在喉癌細(xì)胞中的癌基因功能
在用RNA-seq（圖3）分析了差異表達(dá)基因后，我們選擇UBA2作為TMA7的下游分子，用于TMA7-KD之后的下一步研究。
據(jù)報(bào)道，UBA2在癌癥中起主要作用，但它在喉癌中的作用尚不清楚。目前的數(shù)據(jù)表明，LSCC細(xì)胞中的UBA2-OE或UBA2-KD成功地改變了UBA2的表達(dá)（圖6A-C）。為了闡明UBA2和自噬在LSCC細(xì)胞中的作用，我們對(duì)自噬相關(guān)蛋白P62和LC3B進(jìn)行了研究。UBA2的OE減少了自噬，增加了p62，降低了LC3B-II/I比值。UBA2的破壞導(dǎo)致LC3B-II/I升高，p62降低（圖6C）。
接下來，我們研究了UBA2對(duì)LSCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響?？寺⌒纬?、EDU、傷口愈合和Transwell分析表明，UBA2-KD抑制LSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而UBA2-OE促進(jìn)這種差異（圖6D-G）。UBA2-KD后細(xì)胞凋亡率增加，UBA2-OE后細(xì)胞凋亡率降低（圖6H）。此外，當(dāng)UBA2缺失時(shí)，自噬增加，而當(dāng)UBA2過度表達(dá)時(shí)，自噬減弱（圖6I）。先前的一項(xiàng)研究證明，TMA7的水平與UBA2（圖3B）有關(guān)；因此，我們進(jìn)行了co-IP實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，這兩個(gè)分子直接相互作用（圖6J），表明兩個(gè)分子可能相互結(jié)合。結(jié)果表明，UBA2在喉鱗狀細(xì)胞癌中起癌基因作用。在UBA2和TMA7之間建立了結(jié)合關(guān)系。
圖6 UBA2在喉癌細(xì)胞中的癌基因功能
7、TMA7通過UBA2和PI3K/mTOR途徑影響LSCC自噬
在TMA7-KD后，我們用RNA-seq富集PI3K-mTOR通路，發(fā)現(xiàn)PI3K-mTOR通路與TMA7的變化有關(guān)。因此，我們進(jìn)一步研究了TMA7對(duì)PI3K-mTOR信號(hào)通路的影響。Western印跡分析表明，TMA7-KD減少，而TMA7-OE增加了PI3K和mTOR的磷酸化水平（圖7A）。推測(cè)TMA7可以激活PI3K-mTOR信號(hào)通路。自噬通量分析表明，UBA2-OE減弱了TMA7-KD引起的自噬增加，而UBA2-KD增強(qiáng)了TMA7-OE引起的自噬減少（圖7C）。
為了評(píng)估PI3K-mTOR信號(hào)通路在TMA7介導(dǎo)的自噬抑制中的重要性，我們用雷帕霉素處理TMA7-OE LSCC細(xì)胞。Western印跡和自噬通量分析表明，當(dāng)3-MA處理TMA7-KD LSCC細(xì)胞時(shí)，抑制PI3K磷酸化可以重新激活被TMA7-OE抑制的自噬，而PI3K磷酸化的激活再一次抑制了由TMA7-KD激活的自噬（圖7B，C）。此外，UBA2-OE還可挽救TMA7-KD引起的細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的減少。此外，UBA2-KD挽救了TMA7-OE引起的細(xì)胞增殖、侵襲和遷移（圖7D，7F-H）。UBA2-OE挽救了TMA7-KD引起的細(xì)胞凋亡增加，而UBA2-KD拯救了TMA7-OE引起的細(xì)胞凋亡減少（圖7E）。因此，我們推測(cè)TMA7與UBA2相互作用，并通過PI3K/mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)喉癌自噬水平。
圖7 TMA7通過UBA2和PI3K/mTOR途徑影響LSCC自噬
8、IGF2BP3通過TMA7調(diào)節(jié)LSCC自噬和UBA2表達(dá)
為了驗(yàn)證TMA7在IGF2BP3介導(dǎo)的抑制自噬中的重要性，用TMA7-KD感染IGF2BP3-OE LSCC細(xì)胞，用TMA7-OE慢病毒處理IGF2BP3-KD LSCC細(xì)胞。Western印跡顯示，TMA7-KD可抑制IGF2BP3-OE誘導(dǎo)的UBA2上調(diào)和自噬抑制。而IGF2BP3-KD對(duì)UBA2的下調(diào)和自噬的激活則被TMA7-OE拯救（圖8A）。在此，TMA7-OE挽救了IGF2BP3-KD誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的減少。相反，TMA7-KD挽救了IGF2BP3-OE誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的增加（圖8B-E）。
結(jié)果表明，TMA7-OE挽救了IGF2BP3-KD引起的細(xì)胞凋亡增加。此外，TMA7-KD還挽救了IGF2BP3-OE引起的細(xì)胞凋亡的減少（圖 8F）。自噬通量表明TMA7-OE減弱了IGF2BP3-KD誘導(dǎo)的自噬增加。相反，TMA7-KD增強(qiáng)了IGF2BP3-OE誘導(dǎo)的自噬的減少（圖8G）。
因此，我們得出IGF2BP3和TMA7之間的相互作用，且IGF2BP3通過TMA7調(diào)節(jié)LSCC中UBA2的表達(dá)和自噬。
圖8 IGF2BP3通過TMA7調(diào)節(jié)LSCC自噬和UBA2表達(dá)
9、TMA7影響LSCC細(xì)胞自噬誘導(dǎo)的順鉑耐藥
為了檢查TMA7是否調(diào)節(jié)喉癌對(duì)順鉑的化療敏感性，我們構(gòu)建了順鉑耐藥的AMC-HN-8/DDP和TU212/DDP細(xì)胞。結(jié)果顯示，TMA7增加可促進(jìn)細(xì)胞活力并誘導(dǎo)順鉑處理細(xì)胞的化療耐藥性，而RAPA則使細(xì)胞對(duì)順鉑處理敏感。雷帕霉素可能會(huì)改變TMA7對(duì)LSCC細(xì)胞耐藥性的影響（圖9A-D）。RAPA降低了IC50，而TMA7-OE增加了IC50（圖9E）。
此外，我們替換了自噬抑制劑雷帕霉素，雷帕霉素可以抑制自噬并檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白。Western blotting顯示TMA7-OE增加了p62并降低了LC3B-II/I比率，而雷帕霉素觸發(fā)了順鉑耐藥細(xì)胞的自噬（圖9F）。
接下來，我們檢查了TMA7對(duì)順鉑耐藥細(xì)胞中PI3K-mTOR信號(hào)傳導(dǎo)的影響。Western blot表明TMA7-OE增加，而雷帕霉素降低mTOR磷酸化水平。此外，TMA7-OE降低了BAX、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9的水平，而雷帕霉素增加了這些蛋白的水平，表明由于順鉑耐藥細(xì)胞的凋亡水平較低（圖9G），TMA7-OE激活順鉑耐藥細(xì)胞中的PI3K-mTOR通路。
自噬通量表明雷帕霉素減弱了TMA7-OE誘導(dǎo)的自噬減少（圖9H）。在裸鼠體內(nèi)，用TMA7-KD轉(zhuǎn)染的LSCC細(xì)胞（n=5）治療，另一組用TMA7-KD和UBA2-OE轉(zhuǎn)染的TU212穩(wěn)定細(xì)胞治療（n=5），第三組注射TU212細(xì)胞。所有裸鼠飼養(yǎng)34天。異種移植數(shù)據(jù)顯示，低水平的TMA7顯著抑制異種移植瘤的生長(zhǎng)，而UBA2-OE增強(qiáng)喉癌的致瘤性（圖9I，K，L）。
與未處理的LSCC細(xì)胞相比，TMA7-KD細(xì)胞中的自噬小體由線粒體結(jié)構(gòu)組成，表明TMA7-KD激活了線粒體自噬并觸發(fā)了隨后的自噬（圖9J）。
圖9 TMA7對(duì)自噬誘導(dǎo)LSCC細(xì)胞順鉑耐藥的影響
綜上所述，目前的研究表明，TMA7在喉鱗狀細(xì)胞癌中升高，與預(yù)后不良有關(guān)。TMA7是一種癌基因，調(diào)節(jié)喉癌細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡、自噬和化療敏感性。TMA7通過UBA2調(diào)節(jié)PI3K/mTOR通路，而IGF2BP3以m6A依賴的方式調(diào)節(jié)PI3K/mTOR通路。因此，這項(xiàng)研究可能為喉癌提供潛在的分子標(biāo)記和治療靶點(diǎn)（圖9M）。
實(shí)驗(yàn)方法
WB、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)多組學(xué)分析、集落形成試驗(yàn)、Transwell侵襲試驗(yàn)
參考文獻(xiàn)：
Yang L, Yan B, Qu L, Ren J, Li Q, Wang J, et al. IGF2BP3 Regulates TMA7-mediated Autophagy and Cisplatin Resistance in Laryngeal Cancer via m6A RNA Methylation. Int J Biol Sci. 2023;19(5):1382-400. Epub 2023/04/15. doi: 10.7150/ijbs.80921. PubMed PMID: 37056932; PubMed Central PMCID: PMCPMC10086756.