繪制和建模人類結(jié)直腸癌與腫瘤微環(huán)境的相互作用

        結(jié)直腸癌(CRC)是全球第三大致死率和第四大確診率最高的癌癥，發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率都在增加，死亡率下降方面只有微小進(jìn)展，老年患者(65歲以上)居多。最近，人類結(jié)直腸癌的幾個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜揭示了TME內(nèi)許多細(xì)胞群的身份。然而，這些了解是有限的，部分原因是數(shù)據(jù)集中缺乏癌細(xì)胞，以及缺乏可以直接測試癌細(xì)胞對巨噬細(xì)胞前體或TME其他細(xì)胞的影響。本文中，作者試圖利用人類結(jié)直腸癌的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析來繪制人類結(jié)直腸癌細(xì)胞和TME細(xì)胞之間假定的相互作用。于2023年11月發(fā)布于《Nature Communications》，IF=16.6。 

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)預(yù)測癌細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境之間廣泛的串?dāng)_

        為了了解結(jié)直腸癌中癌- TME的相互作用，作者收集原發(fā)腫瘤、表型正常的鄰近結(jié)腸組織和肝轉(zhuǎn)移瘤。然后對手術(shù)樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析(scRNA-seq)和類器官培養(yǎng)并行處理(圖1A)?？偟膩碚f，作者收集了16例不同腫瘤級別、分期和CMS類型的患者的腫瘤(圖1B - d)。這些腫瘤中大多數(shù)(14/16)為微衛(wèi)星穩(wěn)定性(MSS)，其中2例為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)(圖1B)。來自腫瘤(類腫瘤)和鄰近正常上皮(結(jié)腸腺)的類器官培養(yǎng)至少2個(gè)月，維持4-6代，然后使用類似于原發(fā)組織的方法和試劑進(jìn)行scRNA測序(圖1A, C, D)。作者從原發(fā)腫瘤中捕獲了總共38,063個(gè)細(xì)胞，從正常鄰近組織中捕獲了11,221個(gè)細(xì)胞，從4個(gè)轉(zhuǎn)移灶中捕獲了5906個(gè)細(xì)胞。體外培養(yǎng)的正常類器官和類腫瘤細(xì)胞分別為24,156/20,855。基于scRNA-seq圖譜的細(xì)胞類型分配表明，正如預(yù)期的那樣，原代樣品含有TME細(xì)胞(非上皮細(xì)胞)，而類器官/類腫瘤培養(yǎng)僅由上皮細(xì)胞/癌細(xì)胞組成(圖1E)。為了開始了解結(jié)直腸癌中腫瘤-TME的相互作用，作者初步評估了TME的組成。原發(fā)腫瘤包含多種細(xì)胞類型，包括免疫成分(巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、t細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞)，以及非免疫細(xì)胞類型，包括內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，在患者中出現(xiàn)頻率不同(圖2A、B)。腫瘤上皮細(xì)胞群中的幾個(gè)小簇表明，不同患者的癌細(xì)胞表達(dá)模式不同，可能反映了不同的突變景觀。免疫細(xì)胞，尤其是巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和血漿/B細(xì)胞，在大多數(shù)患者中存在高豐度(圖2B)。為了從空間上理解上皮微環(huán)境的相互作用，作者還使用CODEX (CO-Detection by indEXing)空間蛋白質(zhì)組學(xué)在組織學(xué)切片中生成了細(xì)胞類型注釋(圖2C, D)。不出所料，CODEX分析顯示，在正常鄰近結(jié)腸和腫瘤切片中，上皮(或癌)細(xì)胞最有可能進(jìn)行同型接觸。然而，與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞與來自微環(huán)境的細(xì)胞相互作用的傾向更高，這可能是由于正常組織結(jié)構(gòu)的破壞以及基質(zhì)和免疫成分的腫瘤浸潤(圖2D)。為了全局繪制這些不同細(xì)胞類型之間的分子互擾，作者進(jìn)行了細(xì)胞-細(xì)胞通信分析(見方法)，揭示了癌細(xì)胞與其微環(huán)境內(nèi)細(xì)胞之間廣泛的潛在受體-配體相互作用(圖2E, F)。

圖1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)概述:建立腫瘤類器官和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集

圖2、在人類結(jié)直腸癌中定位癌-TME相互作用

2、類腫瘤培養(yǎng)改變細(xì)胞類型分布，抑制與上皮免疫串?dāng)_相關(guān)的基因表達(dá)程序

        接下來，作者試圖了解將癌細(xì)胞從體內(nèi)腫瘤環(huán)境中移除并引入三維類器官培養(yǎng)如何改變其基因表達(dá)程序，特別是與TME通信相關(guān)的基因表達(dá)程序。作者最初專注于了解來自原代組織和長期類器官培養(yǎng)的上皮/癌細(xì)胞的特性?；?span>umap的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組可視化和Pearson相關(guān)性不僅揭示了正常上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞之間的差異，還揭示了原代細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞之間的差異(圖3A, B)。在原發(fā)結(jié)腸和結(jié)腸腺樣本中，患者正常上皮樣本之間的轉(zhuǎn)錄特征有更多的一致性，而腫瘤/類腫瘤樣本之間的一致性較少(圖3B)。引人注目的是，類腫瘤細(xì)胞和結(jié)腸腺細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)錄組彼此之間的相似性要大于它們在體內(nèi)的同類細(xì)胞(圖3B)。為了解釋這一現(xiàn)象，作者檢查了樣本內(nèi)的異質(zhì)性，結(jié)果顯示，當(dāng)癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤中移除并維持在類腫瘤培養(yǎng)物中時(shí)，多樣性會減少(圖3C)。然后，作者檢查了四種樣本類型(原發(fā)性結(jié)腸、類器官、原發(fā)性腫瘤、類腫瘤)中轉(zhuǎn)錄特性更類似于隱底柱狀干細(xì)胞(SC)、轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)增祖細(xì)胞(TA)或成熟吸收性結(jié)腸炎細(xì)胞(CC)的細(xì)胞比例(圖3D)。正如預(yù)期的那樣，作者發(fā)現(xiàn)，相對于正常結(jié)腸炎，原發(fā)性正常鄰近結(jié)腸中富集了分化的結(jié)腸炎細(xì)胞。它們有更多的干細(xì)胞和轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)增種群。有趣的是，相對于它們在體內(nèi)的同類，類腫瘤也會向干細(xì)胞和轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)增的身份轉(zhuǎn)變(圖3D)。這些觀察結(jié)果可能是由于營養(yǎng)和生態(tài)位細(xì)胞因子充滿的培養(yǎng)條件驅(qū)動了干細(xì)胞相對于體內(nèi)環(huán)境的自我更新和增殖。聚焦于癌細(xì)胞，作者發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)癌細(xì)胞相比，在類腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞中，被抑制的基因數(shù)量多于被激活的基因數(shù)量(圖3E)，以及在結(jié)腸腺培養(yǎng)細(xì)胞中，與正常鄰近上皮細(xì)胞相比，被抑制的基因數(shù)量更多(圖4C)。對這些下調(diào)基因的途徑分析表明，類腫瘤/結(jié)腸腺培養(yǎng)細(xì)胞主要抑制參與與免疫系統(tǒng)溝通的基因表達(dá)程序。特別是那些與白細(xì)胞遷移和炎癥有關(guān)的(圖3F)。這一發(fā)現(xiàn)與這些長期培養(yǎng)中免疫細(xì)胞的缺失是一致的(圖1D)。作者以正常鄰近結(jié)腸和結(jié)腸體作為對照基線，比較了基因在體外和體內(nèi)的log2倍表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)許多在體內(nèi)癌細(xì)胞中上調(diào)的基因在體外也上調(diào)。然而，類腫瘤和結(jié)腸體在體外的差異遠(yuǎn)小于在體內(nèi)的差異(擬合線性系數(shù)= 0.31 < 1，圖3G)，表明在培養(yǎng)中腫瘤特異性基因表達(dá)程序總體上受到抑制。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)受體和配體表達(dá)的抑制大于平均水平(p值= 0.024)，這表明在進(jìn)入類器官培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，與細(xì)胞-細(xì)胞通信相關(guān)的基因程序受到了顯著影響(圖3G)。相反，與細(xì)胞分裂、模式和代謝相關(guān)的基因表達(dá)程序在培養(yǎng)中相對于體內(nèi)組織通常被激活。這與在培養(yǎng)中觀察到的干細(xì)胞和祖細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，以及從最終分化的吸收狀態(tài)的轉(zhuǎn)變是一致的(圖3D, F)。盡管在體外培養(yǎng)中細(xì)胞類型分布的平衡發(fā)生了這些變化，但類腫瘤和結(jié)腸腺保留了在體內(nèi)環(huán)境中觀察到的上皮細(xì)胞類型和細(xì)胞類型身份的多樣性，這表明培養(yǎng)本身并不改變上皮細(xì)胞身份。

圖3、對類器官培養(yǎng)的適應(yīng)抑制了參與癌- TME通訊的基因表達(dá)程序

3、繪制細(xì)胞外基質(zhì)相互作用及其在體內(nèi)和體外的變化

        除了免疫系統(tǒng)之外，TME的另一個(gè)關(guān)鍵組成部分是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。在圖3所描述的腫瘤與類腫瘤的比較中，作者發(fā)現(xiàn)與ECM組織相關(guān)的基因本體(GO)在類腫瘤癌細(xì)胞中相對于體內(nèi)癌細(xì)胞顯著下調(diào)(調(diào)整后的p值= 3.5e?08)。腫瘤與結(jié)腸、類腫瘤與結(jié)腸之間的分析表明，與正常上皮細(xì)胞相比，與ECM組織相關(guān)的基因在癌細(xì)胞中高度上調(diào)(補(bǔ)充圖6A, B)。在比較類腫瘤和結(jié)腸瘤時(shí)，與ECM重塑相關(guān)的差異表達(dá)基因(DEGs)相對較少，這表明與細(xì)胞外基質(zhì)串?dāng)_相關(guān)的基因表達(dá)差異的主要驅(qū)動因素是體內(nèi)和體外狀態(tài)之間的差異，可能是由于從內(nèi)源性ECM到基質(zhì)的轉(zhuǎn)。為了更詳細(xì)地了解癌細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞之間以及體內(nèi)和體外環(huán)境之間ECM細(xì)胞相互作用的差異，作者基于matrixDB的ECM網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)分析，該數(shù)據(jù)庫從matrietr軟件包中獲得。作者計(jì)算了體內(nèi)癌細(xì)胞或類腫瘤細(xì)胞之間的兩兩基因表達(dá)相關(guān)性，并將相關(guān)性繪制為ECM網(wǎng)絡(luò)上的邊緣顏色。與類腫瘤細(xì)胞相比，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞中ECM基因之間的總體相關(guān)性更高。與GO分析一致，ECM網(wǎng)絡(luò)中多個(gè)基因的表達(dá)差異，包括膠原(COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL4A1)，纖維連接蛋白(FN1)， Lumican (LUM)和骨連接蛋白(SPARC)，在體內(nèi)與在體外相比具有高度顯著性。成纖維細(xì)胞，包括肌成纖維細(xì)胞，是ECM的主要生產(chǎn)者，它們在腫瘤樣本中富集(圖2B)。重要的是，除了這些人群的比例差異外，作者發(fā)現(xiàn)與正常成纖維細(xì)胞相比，caf中有幾個(gè)基因上調(diào)。這些包括CTHRC1、INHBA、BGN和PDPN，所有這些已知都能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

4、相關(guān)的人腫瘤、類腫瘤和小鼠CRC模型

        考慮到TME，特別是免疫系統(tǒng)在結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展中的重要性，作者想知道在免疫系統(tǒng)完整的小鼠中，相對于常見的結(jié)直腸癌體內(nèi)模型，人類類腫瘤模型在多大程度上代表了人類原發(fā)腫瘤。為此，作者詢問各種小鼠CRC模型相對于人類類腫瘤模型如何很好地概括人類原發(fā)腫瘤。作者建立了家族性腺瘤性息肉病的Apcmin模型，炎癥驅(qū)動型結(jié)直腸癌的AOM-DSS模型，以及內(nèi)窺鏡引導(dǎo)下將具有致癌性Apc、Trp53、Kras和Smad4 (APKS)突變的CRISPR/ cas9工程類腫瘤原位植入同基因小鼠結(jié)腸黏膜產(chǎn)生的侵襲性、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌模型。與人類原發(fā)腫瘤一樣，作者觀察到在所有三種小鼠模型中，癌細(xì)胞群向干細(xì)胞樣狀態(tài)轉(zhuǎn)移。然而，與人類不同，作者在小鼠腫瘤中沒有觀察到顯著的群體向增殖瞬時(shí)擴(kuò)增細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)移。值得注意的是，盡管在培養(yǎng)中缺乏TME，但相對于小鼠模型，人類類腫瘤特異性轉(zhuǎn)錄組與人類原發(fā)性腫瘤特異性轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)性更好。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明，長期腫瘤類器官培養(yǎng)的主要影響是缺失了與腫瘤微環(huán)境細(xì)胞交流的基因表達(dá)程序。并且人類類器官模型可能在建模CRC方面提供了通常使用的免疫能力強(qiáng)的小鼠模型所沒有的優(yōu)勢。

5、人類腫瘤富含致瘤性巨噬細(xì)胞狀態(tài)，而缺乏抗原呈遞和促炎性巨噬細(xì)胞狀態(tài)

        最近，一些研究已經(jīng)開始闡明骨髓細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞在人類結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中的身份和功能。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)與免疫抑制有關(guān)，在某些腫瘤類型中，巨噬細(xì)胞消耗可以增強(qiáng)腫瘤對免疫檢查點(diǎn)阻斷的反應(yīng)。TAMs表現(xiàn)出獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)程序，認(rèn)為主要受TME的影響(例如，營養(yǎng)可利用性、缺氧、纖維化基質(zhì)、CAFs和其他免疫細(xì)胞類型)。作者最初在體內(nèi)來源的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中檢查了髓系群體的身份和分布(圖4A, B)。作者發(fā)現(xiàn)了大量巨噬細(xì)胞，包括與腫瘤(原發(fā)性或肝臟轉(zhuǎn)移)或正常鄰近組織(正常結(jié)腸或肝臟)相關(guān)的巨噬細(xì)胞。作者還發(fā)現(xiàn)了許多其他的髓樣樹突狀細(xì)胞(DC)類型，包括效應(yīng)T細(xì)胞運(yùn)輸和過繼T細(xì)胞治療所需的BATF3+ DC，引發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的CD1c+ DC，腫瘤相關(guān)的LAMP3 + DC和LILRA4+漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞。接下來，作者試圖描述存在的主要巨噬細(xì)胞亞群。通過聚類和差異表達(dá)分析(見方法)，作者確定了三個(gè)主要人群:IL1B+狀態(tài)，SPP1+狀態(tài)和C1QC+狀態(tài)(圖4C)。這些狀態(tài)以基因群的共表達(dá)為特征，并以標(biāo)志基因IL1B、SPP1和C1QC的表達(dá)命名。通過檢查巨噬細(xì)胞中這些狀態(tài)在不同樣本類型中的分布，發(fā)現(xiàn)C1QC+狀態(tài)在正常鄰近結(jié)腸組織中最為普遍，在那里它與抗原呈遞和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)有關(guān)(圖4D-F)。IL1B+狀態(tài)在正常肝組織中最為普遍，并以炎癥反應(yīng)特征為特征(圖4D-F)。IL1B+狀態(tài)在正常肝組織中最為普遍，并以炎癥反應(yīng)特征為特征(圖4D-F)。相比之下，SPP1+狀態(tài)在腫瘤中相對于其他狀態(tài)更為普遍，無論是原發(fā)性腫瘤與正常結(jié)腸、肝轉(zhuǎn)移與正常肝臟、晚期腫瘤與早期腫瘤(圖4F)。作者預(yù)測在這些狀態(tài)下癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間廣泛的受體-配體相互作用。SPP1+狀態(tài)的特征是糖酵解基因表達(dá)程序、對氧水平的反應(yīng)以及與ECM組織相關(guān)的基因表達(dá)程序(圖4E)。重要的是，SPP1+巨噬細(xì)胞先前與適應(yīng)性免疫反應(yīng)的抑制有關(guān)，因此被認(rèn)為是一種促腫瘤狀態(tài)。與此一致，作者在微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)腫瘤中發(fā)現(xiàn)了豐富的SPP1+巨噬細(xì)胞，相對于高突變的微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)腫瘤，通常被認(rèn)為更具免疫抑制性，其中巨噬細(xì)胞優(yōu)先處于炎性IL1B狀態(tài)(圖4G)。先前的研究表明，巨噬細(xì)胞向SPP1+狀態(tài)的極化是TME特性的結(jié)果，包括氧張力、FAP+癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的存在和ECM組成，這與作者的途徑分析一致(圖4E)。有趣的是，SPP1本身編碼骨橋蛋白，骨橋蛋白是一種分泌的ECM成分和CD44的配體，已知具有促腫瘤和免疫抑制活性。在TCGA數(shù)據(jù)集(COAD和READ)中檢測SPP1及其受體CD44的表達(dá)顯示，相對于正常組織，該受體-配體對在腫瘤中一致上調(diào)，而C1QC在TCGA腫瘤中的表達(dá)顯著降低。與這些報(bào)道的SPP1和巨噬細(xì)胞在SPP1+狀態(tài)下的功能一致，通過SPP1特征富集對結(jié)直腸癌TCGA轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分層顯示，當(dāng)腫瘤具有高SPP1特征時(shí)，患者生存率顯著降低(圖4H)。鑒于這些結(jié)論主要來自單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，作者使用CODEX在腫瘤和正常鄰近組織的組織學(xué)切片中尋找支持的空間證據(jù)。作者觀察到，存在于組織學(xué)正常的結(jié)腸上皮中的巨噬細(xì)胞更可能是HLA-DQA1+ (C1QC+狀態(tài)的代理標(biāo)記物)，而存在于腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞更可能是SPP1+(圖4I-K)。此外，單分子熒光原位雜交證實(shí)了SPP1在結(jié)直腸癌組織中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中的表達(dá)(圖4L)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞主要處于SPP1+免疫抑制狀態(tài)(特別是在MSS腫瘤中)，腫瘤抑制促炎和抗原呈遞狀態(tài)。

圖4、人結(jié)直腸癌中的骨髓細(xì)胞和巨噬細(xì)胞狀態(tài)

6、適應(yīng)性免疫細(xì)胞及其與巨噬細(xì)胞狀態(tài)的關(guān)系

        適應(yīng)性免疫細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，人們對了解腫瘤和TME如何促進(jìn)“冷”腫瘤的免疫抑制非常感興趣。因此，作者在數(shù)據(jù)集中檢查了T細(xì)胞和B細(xì)胞譜系。作者鑒定了主要的T/NK細(xì)胞亞群，包括幼稚T細(xì)胞或記憶T細(xì)胞(Tn/Tm, CCR7 +)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs, FOXP3 +)，效應(yīng)T細(xì)胞或效應(yīng)記憶T細(xì)胞(Teff/Tem, GZMA/GZMB +)，短壽命效應(yīng)細(xì)胞(SLEC, KLRG1 +)， NKT細(xì)胞(CD3 + NKG7 +)以及循環(huán)T細(xì)胞(MKI67 +)， T-癌細(xì)胞雙細(xì)胞簇和NK細(xì)胞。這些T/NK細(xì)胞亞群的分布因樣本類型和腫瘤分期而異，腫瘤和肝轉(zhuǎn)移樣本顯示出一些共性，盡管解剖位置不同。具體來說，作者觀察到腫瘤組織中Tregs、Teff/Tem的富集，以及Tn/Tm和NK細(xì)胞相對于正常結(jié)腸/肝臟的減少。在晚期患者中，Tregs的比例也呈上升趨勢，Teff/Tem群體減少，表明免疫抑制環(huán)境更加明顯。對于幾乎所有的T細(xì)胞亞群，基于一組已知的T細(xì)胞衰竭標(biāo)志物計(jì)算的衰竭評分，當(dāng)比較TME中的T細(xì)胞與鄰近正常組織中的T細(xì)胞時(shí)，顯示出顯著的升高。最后，作者通過觀察每個(gè)樣本中處于不同狀態(tài)的T細(xì)胞比例與巨噬細(xì)胞中IL1B/SPP1/C1QC平均狀態(tài)概率之間的相關(guān)性，觀察巨噬細(xì)胞狀態(tài)與T細(xì)胞狀態(tài)之間是否存在關(guān)聯(lián)。如圖4M、N所示，IL1B+炎性巨噬細(xì)胞狀態(tài)與Tn/Tm和NK細(xì)胞比例高度相關(guān)。相反，SPP1+狀態(tài)與Treg、SLEC和NKT細(xì)胞比例呈正相關(guān)，與Tn/Tm、Teff/Tem、NK細(xì)胞和循環(huán)T細(xì)胞比例負(fù)相關(guān)，與SPP1+巨噬細(xì)胞和骨橋蛋白本身在腫瘤免疫抑制中的作用一致。C1QC+狀態(tài)概率幾乎呈現(xiàn)相反的趨勢。如果僅將腫瘤樣本納入分析，這一趨勢更為顯著(圖4N)。這些觀察結(jié)果與作者的研究以及更廣泛的文獻(xiàn)中的觀察結(jié)果一致，即SPP1+巨噬細(xì)胞狀態(tài)指示免疫抑制性TME。這進(jìn)一步表明T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞狀態(tài)是高度協(xié)調(diào)的，可能是由于兩種細(xì)胞類型之間的串?dāng)_。對B/漿細(xì)胞亞群進(jìn)行了一組類似的分析。作者鑒定出na?ve B細(xì)胞、循環(huán)/分化B/漿細(xì)胞和表達(dá)不同抗體的漿細(xì)胞亞群。在正常結(jié)腸中，B細(xì)胞主要以表達(dá)igha1的漿細(xì)胞的形式存在，參與維持腸道免疫。在大多數(shù)癌癥患者中，存在向表達(dá)ighg1的漿細(xì)胞的轉(zhuǎn)換。在計(jì)算與巨噬細(xì)胞狀態(tài)概率的相關(guān)性時(shí)，在高SPP1+巨噬細(xì)胞特征的樣本中觀察到B細(xì)胞增殖和分化受到抑制(Pearson相關(guān)性= - 0.37)，而在高C1QC+狀態(tài)的樣本中觀察到相反的趨勢(Pearson相關(guān)性= 0.47)，這可能表明這些巨噬細(xì)胞在腫瘤TME中起著不同的作用。 

7、結(jié)直腸癌小鼠模型概括了人類腫瘤中巨噬細(xì)胞狀態(tài)的分布

        最終，這些在人體組織中的分析為結(jié)直腸癌的腫瘤-免疫TME相互作用提供了有價(jià)值的見解，但是在人體系統(tǒng)中進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)的平臺嚴(yán)重有限，小鼠模型仍然是進(jìn)行針對腫瘤-TME相互作用的功能分析的主要平臺。因此，作者回到前面介紹的三種廣泛應(yīng)用的結(jié)直腸癌小鼠模型——家族性腺瘤性息肉病的Apcmin/+模型，炎癥驅(qū)動的結(jié)直腸癌的AOM-DSS模型，以及內(nèi)鏡引導(dǎo)下原位植入的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的APKS類腫瘤模型(圖5A)。與人類相似，這些小鼠模型顯示出與正常小鼠結(jié)腸相似的TME組成，具有顯著的髓系細(xì)胞浸潤(圖5A, B)。繪制小鼠模型中預(yù)測的受體-配體相互作用，并將這些相互作用與人類觀察到的相互作用進(jìn)行交叉對照，顯示小鼠腫瘤僅捕獲了人類中發(fā)現(xiàn)的約一半的受體和配體(圖5C, D)。這可能與小鼠模型中相對于人類類腫瘤的DEG恢復(fù)的限制有關(guān)，與原發(fā)人類腫瘤相比。然而，盡管存在這種明顯的局限性，但對小鼠巨噬細(xì)胞中人類組織中發(fā)現(xiàn)的狀態(tài)的存在和分布的檢查顯示，IL1B +、SPP1 +和C1QC+狀態(tài)都可以很容易地識別出來(圖5E)。與人體組織一致，與正常結(jié)腸相比，三種小鼠腫瘤模型中SPP1+狀態(tài)均豐富，C1QC+狀態(tài)均受到抑制(圖5F)。因此，雖然這些小鼠腫瘤模型并不能完全反映作者在人類中觀察到的細(xì)胞類型分布和假定的癌- TME通訊，但它們似乎在很大程度上概括了與惡性腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞狀態(tài)變化。

圖5、小鼠結(jié)直腸癌模型再現(xiàn)了人類腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞狀態(tài)

8、癌細(xì)胞指示巨噬細(xì)胞進(jìn)入致瘤前免疫抑制狀態(tài)

        TME與腫瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞極化有關(guān)，然而，癌細(xì)胞本身直接影響巨噬細(xì)胞身份的程度在很大程度上仍未被探索，特別是在結(jié)直腸癌中。因此，作者開始通過利用類腫瘤模型系統(tǒng)來解決癌細(xì)胞影響巨噬細(xì)胞極化的程度，該系統(tǒng)不含TME成分，并且缺乏TME串?dāng)_背后的基因表達(dá)程序。為此，作者通過人M-CSF刺激在體外產(chǎn)生人單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞，然后將這些巨噬細(xì)胞引入正常的類器官或類腫瘤培養(yǎng)物中，隨后對培養(yǎng)物中的巨噬細(xì)胞和上皮成分進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析(圖6A)。作者觀察到巨噬細(xì)胞向SPP1+狀態(tài)的明顯轉(zhuǎn)變(圖6B, C)，這種轉(zhuǎn)變在與來自5個(gè)不同患者的類腫瘤共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中一致出現(xiàn)(圖6C)。在一些患者來源的培養(yǎng)物中，IL1B+狀態(tài)也適度誘導(dǎo)，同時(shí)抑制C1QC+狀態(tài)，這在很大程度上反映了圖4中觀察到的腫瘤組織與正常相鄰組織的體內(nèi)狀態(tài)(圖6C)。有趣的是，患者28的癌細(xì)胞對巨噬細(xì)胞的存在沒有反應(yīng)，這表明可能延長培養(yǎng)時(shí)間可能導(dǎo)致對TAM的存在作出反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄程序的表觀遺傳抑制，和/或在這種類腫瘤系中骨橋蛋白受體CD44的低水平(圖6B, D)。來自患者86和92的類腫瘤培養(yǎng)物對巨噬細(xì)胞的存在有反應(yīng)，并且相對于來自患者28的無反應(yīng)的癌細(xì)胞表達(dá)更高水平的CD44(圖6C-E)。作者觀察到巨噬細(xì)胞與類腫瘤共培養(yǎng)足以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化進(jìn)入SPP1+狀態(tài)，這引發(fā)了幾個(gè)問題。TME的其他各個(gè)方面都與巨噬細(xì)胞極化有關(guān)，包括癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)的存在，而癌細(xì)胞與CAFs在巨噬細(xì)胞中引發(fā)這種反應(yīng)的相對貢獻(xiàn)尚不清楚，癌細(xì)胞引發(fā)SPP1+極化反應(yīng)的機(jī)制也不清楚。為了解決這些問題，作者對巨噬細(xì)胞單獨(dú)進(jìn)行了額外的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，巨噬細(xì)胞與類器官/類腫瘤共培養(yǎng)，與CAFs共培養(yǎng)，與CAFs和類器官/類腫瘤共培養(yǎng)，或與類器官/類腫瘤條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)，然后進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析。在這里，作者使用患者8和24的類腫瘤和正常鄰近類器官，觀察到相對于癌細(xì)胞，CAFs誘導(dǎo)SPP1+巨噬細(xì)胞極化的能力有限，并且癌細(xì)胞和CAFs的存在都會引發(fā)最強(qiáng)的SPP1+巨噬細(xì)胞極化。有趣的是，將類腫瘤/類器官條件培養(yǎng)基應(yīng)用于巨噬細(xì)胞培養(yǎng)并不足以誘導(dǎo)SPP1極化，而是誘導(dǎo)其向C1QC+免疫原狀態(tài)極化，這表明SPP1極化需要巨噬細(xì)胞與上皮細(xì)胞直接接觸。將巨噬細(xì)胞暴露于癌細(xì)胞培養(yǎng)(含或不含CAFs)的最明顯結(jié)果是向SPP1+狀態(tài)極化。SPP1基因產(chǎn)物骨橋蛋白是一種具有多效信號功能的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。雖然TAM產(chǎn)生的骨橋蛋白有助于減弱對癌癥的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，但它具有廣泛的癌細(xì)胞自主功能，包括促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，這與其與CD44和整合素αvβ3相互作用下游的癌癥干細(xì)胞特性和轉(zhuǎn)移傾向增加有關(guān)。因此，作者研究了癌細(xì)胞對共培養(yǎng)中巨噬細(xì)胞的反應(yīng)性質(zhì)。巨噬細(xì)胞的引入導(dǎo)致患者源性類腫瘤和正常鄰近類器官中不同程度的差異基因表達(dá)，有趣的是，通常與癌細(xì)胞的細(xì)胞周期減少有關(guān)，但與巨噬細(xì)胞周期增加有關(guān)(圖6F)。與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，類腫瘤和類器官中EMT特征基因表達(dá)增加(圖6G)，患者86和92中間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin上調(diào)(圖6H)。這一發(fā)現(xiàn)與癌癥誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞SPP1促進(jìn)EMT的模型一致，可能為先前觀察到的SPP1表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移之間的聯(lián)系提供了機(jī)制基礎(chǔ)。最后，作者詢問巨噬細(xì)胞引入類腫瘤培養(yǎng)物在多大程度上再現(xiàn)了體內(nèi)觀察到的巨噬細(xì)胞-癌受體-配體串?dāng)_。將體外受體-配體相互作用疊加在體內(nèi)癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的完整相互作用組上(圖6I)，表明這些相互作用的一個(gè)子集在培養(yǎng)中重新建立(圖6I)，包括SPP1-CD44相互作用等。這種預(yù)測的SPP1-CD44相互作用通過近端結(jié)扎實(shí)驗(yàn)在類腫瘤-巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)中得到了驗(yàn)證(圖6J)。綜上所述，本研究表明，人腫瘤源性類器官培養(yǎng)在體內(nèi)抑制癌細(xì)胞與TME之間串?dāng)_的轉(zhuǎn)錄程序。然而，這一明顯的局限性也為特異性腫瘤- TME相互作用的重點(diǎn)重建提供了機(jī)會，使這些相互作用在體內(nèi)高度復(fù)雜的系統(tǒng)中進(jìn)行功能評估的簡化方法成為可能

圖6、在類腫瘤培養(yǎng)中重建癌-巨噬細(xì)胞相互作用

結(jié)論

        本研究揭示了人類患者源性腫瘤類器官培養(yǎng)系統(tǒng)的缺點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，為利用這些系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)直腸癌研究和治療開發(fā)提供了一個(gè)框架。

實(shí)驗(yàn)方法

        單細(xì)胞測序、類器官培養(yǎng)、單分子熒光原位雜交。CODEX染色

參考文獻(xiàn)

        Li N, Zhu Q, Tian Y, Ahn KJ, Wang X, Cramer Z, Jou J, Folkert IW, Yu P, Adams-Tzivelekidis S, Sehgal P, Mahmoud NN, Aarons CB, Roses RE, Thomas-Tikhonenko A, Furth EE, Stanger BZ, Rustgi A, Haldar M, Katona BW, Tan K, Lengner CJ. Mapping and modeling human colorectal carcinoma interactions with the tumor microenvironment. Nat Commun. 2023 Nov 30;14(1):7915. doi: 10.1038/s41467-023-43746-6. PMID: 38036590; PMCID: PMC10689473.