骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的含Dermcidin的遷移體增強(qiáng)肺巨噬細(xì)胞與LC3相關(guān)的吞噬功能，并預(yù)防中風(fēng)后肺炎

        肺炎是急性缺血性卒中（AIS）患者的主要死亡原因之一。抗生素雖然抑制感染，但由于對免疫系統(tǒng)的不良影響，未能改善卒中后肺炎患者的預(yù)后。目前的研究報道骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSC）下調(diào)卒中小鼠模型肺部的細(xì)菌負(fù)荷。對BM-MSC治療的卒中模型進(jìn)行的肺RNA測序表明，腦缺血后BM-MSC調(diào)節(jié)肺巨噬細(xì)胞的活性。機(jī)制上，BM-MSC通過釋放遷移體促進(jìn)肺巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬作用。研究結(jié)果表明，BM-MSC具有抗感染和免疫調(diào)節(jié)的雙重功能，是治療卒中后肺炎的有效藥物。該研究于2023年8月發(fā)表在《Advanced Science》，IF：15.1。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植預(yù)防急性缺血性卒中和預(yù)防卒中后肺炎

        成功分離人BM-MSC。為比較對AIS和卒中后肺炎的治療效果，野生型（WT）雄性C57/Bl6小鼠接受60分鐘短暫大腦中動脈閉塞（tMCAO），然后在再灌注后2小時接受BM-MS或廣譜抗生素恩諾沙星（每日腹腔注射20 mg / kg）治療（圖1A）。與之前的報道一致，BM-MSC移植提高卒中后1 ~ 14日的生存率（圖1B）。BM-MSC受者的神經(jīng)功能缺損評分降低（圖1C），梗死體積減?。▓D1D）。通過BM-MSC移植，神經(jīng)元存活在兩個3d（短期，圖1E）和14d（長期，圖1F）。此外，在tMCAO模型的紋狀體（STR）和皮質(zhì)（CTX）的MBP染色顯示，BM-MSC保護(hù)白質(zhì)的完整性（圖1G，H）。因此，BM-MSC治療的卒中模型顯示，在tMCAO后3-14 d，通過滾筒試驗(yàn)（圖1I）、粘連清除試驗(yàn)（圖1J）和足部故障試驗(yàn)（圖1K）評估的感覺運(yùn)動功能改善。然而，與PBS處理的對照相比，抗生素治療小鼠的卒中結(jié)局未顯示顯著改善（圖1B-K）。為分析卒中小鼠的細(xì)菌感染情況，在tMCAO后3d分離支氣管肺泡灌洗液（BALF）并進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)（圖1L）。tMCAO后小鼠肺部感染普遍存在。預(yù)防性抗生素治療限制了肺組織中的細(xì)菌生長（圖1L）。同時，非特異性檢測細(xì)菌存在的肺組織16S rRNA定量（圖1M）和BALF中脂多糖（LPS）水平（圖1N）表明，在抗生素治療的小鼠中，細(xì)菌載量下降（圖1L-N）。有趣的是，BM-MSC受體與抗生素治療的小鼠在細(xì)菌感染方面表現(xiàn)出相似的局限性（圖1L-N）。然而，盡管抗生素具有抗菌作用，但HE染色顯示，恩諾沙星處理的小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的肺部炎癥，這與PBS處理的對照組相似（圖1O）。需要注意的是，BM-MSC移植組的肺組織顯示出有限的免疫細(xì)胞浸潤和保留肺組織完整性（圖1O）。結(jié)果表明，BMMSC對卒中后肺炎具有雙重保護(hù)作用，即抑制細(xì)菌生長和促進(jìn)肺部炎癥消退。

圖1. BM-MSC移植可預(yù)防AIS并預(yù)防卒中后肺炎

2. BM-MSC轉(zhuǎn)移通過巨噬細(xì)胞依賴的方式預(yù)防卒中后肺炎

        在tMCAO后3d分離腦卒中模型小鼠的肺組織并進(jìn)行大批量RNA測序（RNA-seq）。分析了PBS、抗生素和BM -MSC治療的卒中小鼠之間的差異表達(dá)基因（DEGs）（圖2A）。為探索BM -MSC轉(zhuǎn)移的治療機(jī)制，選擇BM-MSC和PBS處理小鼠中上調(diào)的DEGs（圖2Aa），抗生素和PBS處理小鼠中下調(diào)的DEGs（圖2Ab），以及BM-MSC和抗生素治療小鼠中上調(diào)的DEGs（圖2Ac）的交集（圖2B）。在交集的DEGs中發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的特征基因，包括Ccr2（圖2C）。通過Reactome通路分析進(jìn)一步分析交集的DEGs。結(jié)果顯示，在BM -MSC治療的小鼠的肺中，多個抗原呈遞相關(guān)通路上調(diào)（圖2D）。免疫組織化學(xué)染色（Iba1，綠色）和熒光原位雜交（FISH）技術(shù)（EUB338，紅色）對tMCAO模型的肺組織進(jìn)行巨噬細(xì)胞標(biāo)記。發(fā)現(xiàn)，BM-MSC治療增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的清除，因?yàn)榧?xì)菌大部分保留在Iba1+細(xì)胞內(nèi)（圖2E）。相比之下，在接受抗生素治療的小鼠中，盡管細(xì)菌負(fù)荷減少，但殘留細(xì)菌仍未被巨噬細(xì)胞吞噬，這表明巨噬細(xì)胞的抗菌功能受到抗生素治療的影響（圖2E）。進(jìn)一步耗盡循環(huán)單核細(xì)胞（圖2F）和肺駐留巨噬細(xì)胞（圖2F）聯(lián)合氯磷酸二鈉脂質(zhì)體（75 mg kg - 1，腹腔注射，tMCAO前3d）（圖2F）。值得注意的是，在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞清除的小鼠中，BM-MSC未能對腦缺血提供進(jìn)一步保護(hù)（圖2G）。此外，BM-MSC的抗菌作用被逆轉(zhuǎn)（圖2H，I）。這些數(shù)據(jù)表明，巨噬細(xì)胞的功能在BM-MSC移植對AIS和卒中后肺炎的保護(hù)中是必不可少的。

圖2. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)移促進(jìn)巨噬細(xì)胞的細(xì)菌清除

3. BM-MSC通過增強(qiáng)LC3相關(guān)的吞噬作用促進(jìn)巨噬細(xì)胞的細(xì)菌清除

        評估BM-MSC處理后巨噬細(xì)胞的功能變化。如細(xì)菌16s rRNA的FISH所示，在BM-MSC轉(zhuǎn)移小鼠中，細(xì)菌吞噬肺巨噬細(xì)胞的效率提高（圖2E）。入侵的細(xì)菌被巨噬細(xì)胞通過LC3相關(guān)吞噬作用（LAP）識別和處理通過免疫染色，RUBCN （RUN結(jié)構(gòu)域和含半胱氨酸豐富結(jié)構(gòu)域的Beclin 1相互作用蛋白），LAP的特異性標(biāo)志物，在BM-MSC受體的肺巨噬細(xì)胞中上調(diào)（圖3A）。相應(yīng)地，通過trans-well將骨髓來源的巨噬細(xì)胞（BMDM）與BM-MSC共培養(yǎng)（圖3B）提高了它們對大腸桿菌的清除，而大腸桿菌是導(dǎo)致卒中后肺炎的主要病原體之一（圖3C，D）。通過western blot發(fā)現(xiàn)BM-MSC共培養(yǎng)上調(diào)BMDM中的RUBCN表達(dá)，并促進(jìn)下游與LC3相關(guān)的大腸桿菌的消化（圖3D）。此外，當(dāng)用大腸桿菌（e.c oli-BM-MSC）刺激BM-MSC來封閉卒中后肺炎的微環(huán)境時，BM-MSC吞噬BMDM的促進(jìn)作用進(jìn)一步增強(qiáng)（圖3B-D）。在與E. Coli-BM-MSC共培養(yǎng)的小鼠BMDM和人巨噬細(xì)胞中，RUBCN顯示出與BECN1的活躍組裝，表明LAP進(jìn)展（圖3E-G）。敲低Rubcn抑制BMDM的LAP，E. Coli-BM-MSC對BMDM細(xì)菌清除的促進(jìn)作用被消除（圖3H，I），說明BM-MSC通過促進(jìn)LAP增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺菌功能。值得注意的是，恩諾沙星下調(diào)BMDM的細(xì)菌清除及其RUBCN的表達(dá)（圖3C-E），這進(jìn)一步證明與抗生素相比，恩諾沙星對BM-MSC的卒中后肺炎具有更好的保護(hù)作用。

圖3. BM-MSC通過增強(qiáng)LC3相關(guān)吞噬作用（LAP）促進(jìn)巨噬細(xì)胞的細(xì)菌清除

4. BM-MSC通過釋放遷移體促進(jìn)巨噬細(xì)胞清除細(xì)菌

        在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，通過插入物將BMMSC與BMDM分離，但不影響它們的非接觸交流（圖3B）。BM-MSC的條件培養(yǎng)基（CM）或經(jīng)大腸桿菌預(yù)處理的條件培養(yǎng)基（CM）均可增強(qiáng)BMDM對大腸桿菌 （GFP+）的吞噬作用（圖4A），表明BM-MSC衍生的分泌因子促進(jìn)BMDM對細(xì)菌的吞噬作用。BM-MSC衍生的CM被進(jìn)一步分離為可溶性部分和細(xì)胞外囊泡（EVs），特別是由大腸桿菌預(yù)處理的BM-MSC產(chǎn)生的EVs，增強(qiáng)BMDM對細(xì)菌的吞噬（圖4B，C）。在體內(nèi)，BM-MSC注射后僅在肺內(nèi)短暫停留約24小時（圖4C）。BM-MSC在2天內(nèi)從肺內(nèi)回縮，而BM-MSC移植的抗菌作用至少在3天內(nèi)仍然明顯（圖1I-K）。因此，作者推斷是BM-MSC衍生的EVs對巨噬細(xì)胞發(fā)揮促吞噬作用。在BM-MSC受者的肺中發(fā)現(xiàn)了直徑為500 ~ 3000 nm的EV富集，這與報告的新發(fā)現(xiàn)的遷移體EV的大小一致（圖4E，F）。對從BMMSC CM和BM-MSC轉(zhuǎn)移的卒中模型中分離的EVs進(jìn)行的透射電子顯微鏡（TEM）分析顯示，典型的偏小體形態(tài)為結(jié)合回縮纖維的大囊泡，并包含小囊泡（圖4G，H）。此外，與BPS處理對照相比，BMMSC轉(zhuǎn)移的卒中小鼠（tMCAO后3d）的肺組織的蛋白質(zhì)印跡分析顯示，C3ORF64、PIGK和PGCP的遷移體標(biāo)志物表達(dá)增加，而外泌體標(biāo)志物包括HSP70和HSP90的水平穩(wěn)定（圖4H）。免疫染色一致地顯示，注射后0-3d， tMCAO受體肺內(nèi)保留BM-MSC （WGA預(yù)染色，紅色）來源的遷移體 （TSPAN4+，白色）（圖4I）。

圖4. BM-MSC轉(zhuǎn)移通過釋放遷移體預(yù)防卒中后肺炎

        通過流式細(xì)胞術(shù)（圖5A）和免疫染色（圖5B）評估發(fā)現(xiàn)PBS-M和E. Coli-M均上調(diào)BMDM對GFP+ E. Coli的吞噬。為探索遷移體在BM-MSC提供的BMDM細(xì)菌清除增強(qiáng)中的必要性，將細(xì)胞松弛素D（CytD）應(yīng)用于BM-MSC以抑制細(xì)胞遷移（圖5C）。將不含遷移體的CytD處理的BM-MSC （CytD-EV）來源的EVs處理為BMDM。發(fā)現(xiàn)，CytD-EV既不能增強(qiáng)BMDM對GFP+大腸桿菌的吞噬作用（圖5D-F），也不能上調(diào)其RUBCN的表達(dá)（圖5F）。另一方面，BM-MSC衍生的遷移體的促吞噬作用與BM-MSC衍生的EVs相當(dāng)（圖5A，B）。在本研究中發(fā)現(xiàn)，接受遷移體處理的巨噬細(xì)胞在細(xì)菌清除方面的改善與接受含有遷移體的總EVs處理的巨噬細(xì)胞相似（圖5A，B），而接受不含遷移體的EVs處理的巨噬細(xì)胞的吞噬增強(qiáng)較弱（圖5G-I）。在動物實(shí)驗(yàn)中，無論是偏側(cè)體還是偏側(cè)體排除的EVs均有效縮小了梗死體積（圖5J）。然而，在腦卒中后肺部感染的體內(nèi)分析中發(fā)現(xiàn)，通過遷移體轉(zhuǎn)移的tMCAO模型肺組織中的細(xì)菌生長（圖5K）、肺組織16S rRNA濃度（圖5L）、BALF中的LPS水平（圖5M）和肺部炎癥（圖5N）減少，這與接受BM-MSC治療的模型相似（圖1L - O），并優(yōu)于通過排除遷移體的EVs轉(zhuǎn)移的模型（圖5K - n）。因此，得出結(jié)論，BM-MSC通過釋放遷移體促進(jìn)巨噬細(xì)胞清除細(xì)菌，同時發(fā)揮殺菌作用。

圖5. BM-MSC通過釋放遷移體促進(jìn)巨噬細(xì)胞清除細(xì)菌

5. 皮離蛋白（DCD）被包裝在BM-MSC衍生的遷移體中并改善巨噬細(xì)胞的細(xì)菌清除

        分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSC）來源的遷移體，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS/MS）分析遷移體的抗菌分子。在鑒定的成分中，抗菌蛋白皮離蛋白（DCD）值得關(guān)注（圖6A）。通過免疫染色（圖6B）和ELISA（圖6C），驗(yàn)證DCD集中于BM-MSC衍生的遷移體。DCD在BM-MSC胞體中的濃度較低（圖6B,C）。此外，通過ELISA（圖6C）和QPCR（圖6D）評估，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌刺激上調(diào)BM-MSC中的DCD表達(dá)，這解釋了大腸桿菌預(yù)處理的BM-MSC共培養(yǎng)和E. Coli對巨噬細(xì)胞的超活性作用。用DCD預(yù)處理BMDM，進(jìn)行細(xì)菌清除實(shí)驗(yàn)。免疫染色表明DCD啟動以劑量依賴性方式改善BMDM對大腸桿菌的吞噬或髓鞘碎片的清除（圖6E，F），揭示DCD的促清除功能。同時，DCD促進(jìn)E. Coli吞噬巨噬細(xì)胞后的LAP（圖6G）。免疫染色評估發(fā)現(xiàn)RUBCN和BECN1、GFP+ E. Coli或和LC3A/B的共定位在DCD預(yù)處理的BMDM中上調(diào)（圖6H）。需要注意的是，DCDKD 的BM-MSC來源的遷移體的pro-LAP功能被取消，這表明DCD在BM-MSC來源的遷移體的抗菌作用中不可或缺的作用（圖6I，J）。

圖6. BM-MSC衍生的遷移體含有皮離蛋白（dermcidin, DCD），可提高巨噬細(xì)胞的細(xì)菌清除

        進(jìn)一步研究DCD和含有DCD的BM-MSC衍生的遷移體的治療潛力。我們發(fā)現(xiàn)，與年齡和性別匹配的健康對照（HC）相比，AIS患者（急性期，發(fā)病后0-3d）外周血中的DCD濃度上調(diào)（圖7A）。有趣的是，外周血DCD水平與患者的梗死體積呈負(fù)相關(guān)（圖7B - d），與δ NIHSS （7d-1d）呈正相關(guān)（圖7B，E） 說明DCD有利于AIS的恢復(fù)。血漿DCD濃度高的AIS患者比DCD水平低的患者有更明顯的肺炎發(fā)生率（圖7F,G）?？紤]到DCD和含DCD的巨噬細(xì)胞來源的遷移體的抗菌作用（圖7H-J），推斷DCD對肺炎的抗菌反應(yīng)至關(guān)重要。使用BMDM、DCD和含DCD處理時BM-MSC衍生的遷移體均被BMDM吞噬（圖7H）。通過流式細(xì)胞術(shù)分析（圖7I）和免疫染色（圖7J），發(fā)現(xiàn)與使用DCD蛋白處理的BMDM相比，使用BM-MSC來源的遷移體處理的BMDM顯示出更強(qiáng)的細(xì)菌清除能力。因此，含有DCD的BM-MSC衍生的遷移體是一種治療卒中后肺炎的有效療法，其療效優(yōu)于之前所關(guān)注的DCD蛋白。

圖7. DCD有利于AIS的恢復(fù)，含DCD的BM-MSC來源的遷移體可有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能

結(jié)論

        綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BM-MSC移植通過釋放含DCD的遷移體，增強(qiáng)肺巨噬細(xì)胞的LAP，從而保護(hù)卒中后肺炎。BM-MSC不僅具有有效的神經(jīng)保護(hù)作用，還具有抗菌和免疫調(diào)節(jié)功能，是治療AIS和卒中后肺炎的潛在治療方法，遠(yuǎn)超抗生素。

實(shí)驗(yàn)方法

        人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSC）的分離鑒定，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨和成脂分化，急性缺血性腦卒中的小鼠模型，小鼠的BM-MSC移植和藥物給藥，神經(jīng)功能評分，行為實(shí)驗(yàn)，梗死體積分析，支氣管肺泡灌洗液（BALF）收集，原代小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞（BMDMs）培養(yǎng)，人單核細(xì)胞富集和巨噬細(xì)胞分化，巨噬細(xì)胞耗竭，批量RNA測序和數(shù)據(jù)分析，組織學(xué)分析，FISH，BM-MSC的細(xì)胞外囊泡（EVs）和遷移體的分離和鑒定，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析，TEM分析，吞噬作用分析，體內(nèi)MSC示蹤實(shí)驗(yàn)，慢病毒感染BMDM和BM-MSC，免疫熒光染色，RT-PCR，免疫沉淀，WB，流式細(xì)胞分析，ELISA

參考文獻(xiàn)

        Li T, Su X, Lu P, Kang X, Hu M, Li C, Wang S, Lu D, Shen S, Huang H, Liu Y, Deng X, Cai W, Wei L, Lu Z. Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell-Derived Dermcidin-Containing Migrasomes enhance LC3-Associated Phagocytosis of Pulmonary Macrophages and Protect against Post-Stroke Pneumonia. Adv Sci (Weinh). 2023 Aug;10(22): e2206432. doi: 10.1002/advs.202206432. Epub 2023 May 28. PMID: 37246283; PMCID: PMC10401184.