PRMT3介導的METTL14精氨酸甲基化促進子宮內膜癌的惡性進展和治療耐受性
蛋白精氨酸甲基轉移酶（PRMT）在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著至關重要的作用，但其影響子宮內膜癌（EC）治療敏感性的內在機制仍不清楚，值得進一步研究。本文對癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫和臨床蛋白質組腫瘤分析聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫進行了全面分析，發(fā)現(xiàn)PRMT3在子宮內膜癌中發(fā)揮著重要作用。具體來說，進一步的實驗表明，PRMT3抑制會增強EC細胞對鐵死亡的敏感性。從機理上講，PRMT3與甲基轉移酶14（METTL14）相互作用，并參與其精氨酸甲基化。此外，PRMT3抑制介導的METTL14過表達會通過m6A-YTHDF2依賴性機制促進甲基化修飾，降低谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）mRNA的穩(wěn)定性，增加脂質過氧化水平，加速鐵死亡。值得注意的是，PRMT3阻斷和抗PD-1聯(lián)合療法通過加速細胞衍生的異種移植模型中的鐵死亡而顯示出更有效的抗腫瘤作用。特異性PRMT3抑制劑SGC707在患者來源的異種移植模型中也發(fā)揮了同樣的免疫治療增敏作用。值得注意的是，阻斷PRMT3能改善順鉑和放射治療對腫瘤的抑制作用?？傊?，這項研究表明，PRMT3是一種很有前景的EC靶點。本文于2023年11月發(fā)表于《Advanced Science》，IF=15.1。
技術路線
實驗結果
1. PRMT3是EC中一種關鍵的上調生物標志物
為了確定在EC中起關鍵作用的PRMTs，作者對來自TCGA數(shù)據(jù)庫和CPTAC數(shù)據(jù)庫的UCEC數(shù)據(jù)集進行了差異分析，發(fā)現(xiàn)在重疊結果中，PRMT1和PRMT3在EC組織中升高（圖1A）。qRT-PCR檢測證實，在5個臨床EC組織樣本中，PRMT1和PRMT3的表達均高于匹配的癌旁組織（圖1B）。此外，與正常子宮內膜上皮細胞相比，PRMT3在EC細胞中上調。在EC細胞系中，PRMT3在HEC-1A細胞中表達最高，在HEC-1B細胞中表達最低（圖1C-E）。
為了進一步確定PRMT3的作用，作者通過慢病毒轉染建立了穩(wěn)定的HEC-1B-Lv-PRMT3和HEC-1A-Lv-shPRMT3細胞。通過Western印跡和qRT-PCR驗證了穩(wěn)定基因轉移的有效性（圖1F-G）。與對照組相比，PRMT3的上調提高了HEC-1B細胞的存活率，而PRMT3缺陷的HEC-1A細胞的存活率則降低了（圖1H）。此外，與對照組相比，過表達PRMT3增加了HEC-1B細胞和HEC-1A細胞的集落形成能力。相比之下，在HEC-1B細胞和HEC-1A細胞中去除PRMT3則觀察到相反的趨勢（圖1I）。此外，過表達PRMT3會顯著降低細胞死亡的比例，而敲除PRMT3則會增加這一比例（圖1J）。上述發(fā)現(xiàn)意味著PRMT3在EC中表達上調，并可能在EC的進展中發(fā)揮重要作用。
2. PRMT3耗竭導致EC中的鐵死亡易感性
對細胞死亡不敏感是癌癥的關鍵特性之一，它使腫瘤對治療方法產生部分抗性。用不同濃度的鐵死亡誘導劑處理PRMT3下調或對照的EC細胞表明，PRMT3缺失抑制了對彈性蛋白誘導的細胞死亡的抵抗力（圖2A）。PRMT3阻斷組和Erastin處理組的細胞都表現(xiàn)出一定程度的鐵死亡。此外，鐵死亡抑制劑liproxstatin-1挽救了這種由 PRMT3敲低促進的Erastin誘導的細胞死亡，但不能被細胞凋亡抑制劑（Z-VAD-FMK）、壞死抑制劑（壞死磺胺）或自噬抑制劑（3-甲基腺嘌呤）所挽救（圖2B、C）。這些結果表明，PRMT3的缺失通過增加細胞內的鐵死亡而增強了Erastin治療的抑制作用。
由于GPX4是鐵死亡過程的一個顯著標志，因此進行了進一步的實驗。過表達 PRMT3在蛋白和mRNA水平上都促進了GPX4的表達（圖2D）。值得注意的是，GPX4的上調或抑制對PRMT3的表達沒有影響。PRMT3作為GPX4的上游因子發(fā)揮著調控作用（圖2E）。接下來，作者試圖研究PRMT3和GPX4對EC中鐵死亡敏感性的影響。CCK8測定顯示，PRMT3過表達細胞和GPX4過表達細胞的細胞活力增強，而PRMT3缺陷細胞和GPX4缺陷細胞的細胞活力則相反。GPX4的抑制或上調分別部分逆轉了PRMT3過表達或敲除誘導的細胞活性變化（圖2F）。隨后，PRMT3過表達細胞和GPX4過表達細胞中的丙二醛（MDA）和亞鐵（Fe2+）水平降低，而PRMT3缺失細胞和GPX4敲除細胞中的丙二醛和亞鐵水平升高。PRMT3過表達導致的MDA和Fe2+水平降低或PRMT3缺失導致的MDA和Fe2+水平升高趨勢可分別被GPX4抑制或過表達所挽救（圖2G,H）。具有代表性的透射電子顯微鏡圖像顯示，PRMT3缺失細胞和GPX4缺失細胞的線粒體變小，膜密度增加，這是鐵死亡的特征。GPX4的下調或上調分別部分改變了PRMT3的上調或下調所誘導的細胞內鐵死亡的程度（圖2I）?？傊@些數(shù)據(jù)表明，沉默PRMT3可以通過抑制EC中GPX4的表達來抑制癌細胞對鐵死亡的抵抗力。
3. PRMT3精氨酸甲基化METTL14負調控其蛋白表達
為了闡明PRMT3調節(jié)GPX4的機制，作者對PRMT3結合蛋白進行了質譜分析，其中METTL14被認為是可能與PRMT3相互作用的蛋白（圖3A）。隨后，證實PRMT3與METTL14的結合，并觀察到PRMT3催化了METTL14的ADMA（圖3B、C）。進一步分析表明，PRMT3能放大METTL14的ADMA信號，而在PRMT3缺失的細胞中該信號被抑制（圖3D）。這一精氨酸殘基序列在不同物種間的高度保守性表明，這種甲基化可能具有生物學功能（圖3E）。此外，作者根據(jù)GPS-MSP分析估計了可能的精氨酸殘基位置（R418）（http://msp.biocuckoo.org/）。METTL14中R418的賴氨酸突變（418RK）導致METTL14的ADMA甲基化顯著消失，表明該位點可能是 PRMT3對METTL14進行精氨酸甲基化的靶點（圖3F）。此外，該突變縮短了 METTL14的半衰期，PRMT3缺失阻止了METTL14蛋白的降解（圖3G、H）。拯救實驗進一步揭示了PRMT3-METTL14-GPX4上下游調控軸之間的蛋白表達和鐵死亡之間的調控關系（圖3I-K）?？傊?span>PRMT3促進了METTL14的精氨酸甲基化并對其進行表觀遺傳調控，從而介導了對細胞鐵死亡的抑制。
4. m6A通過METTL14-YTHDF2依賴性途徑對GPX4 mRNA進行甲基化
METTL14作為甲基轉移酶的核心成分，可以參與m6A修飾的動態(tài)過程，因此作者進一步研究了METTL14對GPX4的m6A修飾。本節(jié)的實驗選擇了HEC-1A和 Ishikawa細胞，因為它們分別被鑒定為METTL14表達較低和較高的細胞（圖4A）。Western印跡和免疫熒光檢測顯示，METTL14高表達細胞中GPX4表達減少，而 METTL14缺失細胞中GPX4表達增加（圖4B）。如結果所示，過表達METTL14顯著提高了細胞的全局m6A水平和GPX4 mRNA的m6A富集（圖4C、D）。接下來，SRAMP程序（http://www.cuilab.cn/sramp）確定了GPX4 mRNA上潛在的m6A修飾位點。生成包含野生型（WT）或突變型（Mut）GPX4 的熒光素酶報告基因，用于后續(xù)檢測。在突變型GPX4中，m6A共序中的腺苷核苷酸被胸苷取代（圖4E）。含有GPX4-WT的構建體的熒光素酶活性在METTL14過表達時顯著降低，而在METTL14缺失時則增強，而GPX4-MUT的熒光素酶活性似乎不受影響（圖4F）。這些結果表明 GPX4的表達受METTL14介導的m6A修飾控制。
考慮到m6A甲基化過程涉及m6A閱讀蛋白的識別，研究人員調查了YTHDF1/2/3作為經典的m6A閱讀蛋白家族對GPX4 mRNA穩(wěn)定性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，YTHDF2缺失后，GPX4的表達升高；然而，在YTHDF1/3缺失的細胞中，GPX4沒有發(fā)生變化（圖4G,H）。YTHDF2缺乏消除了METTL14過表達對GPX4的抑制作用（圖4I）。RIP-qPCR證實了YTHDF2和GPX4 mRNA之間的相互作用（圖4J）。此外，與使用放線菌素D處理后的對照細胞相比，METTL14基因缺失和YTHDF2基因缺失都顯著延長了GPX4 mRNA的半衰期（圖4K）。因此，METTL14介導的GPX4 m6A修飾可通過YTHDF2依賴性識別促進mRNA降解。
5. PRMT3表達與EC患者METTL14表達及預后良好呈負相關
在臨床患者組織中進行了進一步的研究和證實。Western印跡結果顯示，腫瘤組織中PRMT3的表達高于鄰近的正常組織（圖5A）。如圖5B的代表性圖像所示，腫瘤組織中PRMT3高表達，METTL14低表達（圖5B）。值得注意的是，在PRMT3低表達的患者中，約有2/3（64.52%）的患者METTL14水平相對較高，而在PRMT3高表達組中，72.04%的組織METTL14水平較弱（圖5C）。此外，Kaplan-Meier曲線顯示，PRMT3表達較低的EC患者預后良好（圖5D）。同樣，qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示，新鮮EC腫瘤組織中的PRMT3 mRNA水平相對高于相應的鄰近正常組織（圖5E）。PRMT3的高表達與晚期病理分級、T分期、N分期和FIGO分期密切相關（圖5F-I）。質譜鑒定出的與PRMT3相互作用蛋白在鐵死亡途徑中富集，進一步證實了作者的結論（圖5J）。此外，作者還探討了PRMT3、METTL14和GPX4聯(lián)合作用的預后潛力。低PRMT3表達、高METTL14表達和低GPX4表達的患者預后最好。這些數(shù)據(jù)表明，由PRMT3、METTL14和GPX4組成的模型可用作EC患者的預后因素?？傊?span>PRMT3在EC中表達上調，可能與腫瘤進展有關。
6. PRMT3抑制通過提高腫瘤對鐵死亡的敏感性，增強了抗PD-1治療對EC的抗腫瘤作用
從成年雌性NOG-dKO小鼠的尾靜脈輸入人外周血單核細胞（Hu-PBMCs），用于構建免疫重建模型。流式細胞術用于監(jiān)測2-3周后小鼠外周血中人源T淋巴細胞的重建水平（圖6A）。結果表明，人源化小鼠模型已成功建立，可用于后續(xù)的免疫檢查點抑制劑研究。
作者在Hu-NOG-dKO小鼠模型中異種移植了HEC-1A-shPRMT3和HEC-1A-載體細胞，小鼠在注射后第11天開始在規(guī)定時間接受PD-1阻斷或IgG治療（圖6B）。與其他小鼠相比，PRMT3下調和抗PD-1聯(lián)合治療組小鼠的腫瘤體積和重量進一步減少（圖6C-E）。聯(lián)合處理組的脂質過氧化物、MDA和Fe2+水平明顯更高。Liproxstatin-1逆轉了聯(lián)合治療組的療效和細胞死亡程度（圖6F-H）。此外，還觀察到聯(lián)合治療組小鼠的GPX4表達最弱，4-HNE（一種脂質過氧化標記物）表達最強，PRMT3表達較低，METTL14表達較高（圖6I）。PRMT3下調的癌細胞更容易被T細胞殺死（圖6J）。與其他組相比，聯(lián)合治療組的腫瘤生長速度更慢，腫瘤重量更輕，脂質過氧化反應、MDA和Fe2+水平更高（圖6K-N）。因此，阻斷PRMT3表達或PRMT3抑制劑可能會通過抑制細胞對鐵死亡的耐藥性來提高抗PD-1療法的療效。
7. PRMT3下調增強EC放化療的抗腫瘤療效
考慮到PRMT3基因敲除在增強免疫療法方面的顯著療效，作者隨后研究了它是否會對化療和放療等其他治療方式產生類似的影響。事實證明，順鉑和放射治療都會在細胞水平上加速鐵死亡。此外，與其他對照組相比，順鉑和放射治療在PRMT3缺陷組中都能產生更大的鐵死亡誘導和治療增敏作用，而且這種作用可被Liproxstatin-1部分消除（圖7A-L）。鑒于腫瘤控制機制存在于輻射部位之外，作者進一步探討了沉默PRMT3與放療聯(lián)合治療是否有可能產生更大的遠隔效應。在雙側腫瘤模型中，與未治療的對照側相比，治療側的腫瘤生長明顯減慢，未治療側的腫瘤體積略有縮小，兩側的鐵死亡水平均升高。與其他三組相比，雙側 PRMT3基因敲除腫瘤聯(lián)合左側放療組的雙側腫瘤顯示出更強的抗腫瘤效果和更大的鐵死亡（圖7M-P）。這些數(shù)據(jù)證實，阻斷PRMT3改善了順鉑和放療對腫瘤的抑制作用，并能更大程度地激活脫落效應。
結論：
總之，作者發(fā)現(xiàn)PRMT3可能是預測EC患者不良預后和不利臨床進展的生物標記物。作者還闡明了PRMT3在EC細胞鐵死亡抵抗中的潛在機制。PRMT3缺失導致METTL14結合和精氨酸甲基化失敗，METTL14高表達并以m6A依賴性方式下調GPX4，最終抑制細胞對鐵死亡的抗性并導致EC的治療敏感性（圖8）。作者的工作提出了一種很有前景的方法，即消耗PRMT3可通過促進EC中的鐵死亡抑制對抗PD-1、化療和放療的耐藥性。
實驗方法：
生物信息分析、蛋白質印跡分析、實時熒光定量PCR、鐵檢測、免疫共沉淀測定、m6 斑點印跡測定、MeRIP-qPCR、熒光素酶報告基因檢測、RNA穩(wěn)定性測定、免疫組化、轉染、CCK8檢測、菌落形成檢測、脂質過氧化評估和細胞死亡分析、透射電子顯微鏡成像、免疫熒光、流式細胞術、T 細胞介導的癌細胞殺傷、Hu-NOG-dKO 模型的建立和體內療效實驗、建立 PDX
參考文獻：
Wang, Y., Wang, C., Guan, X., Ma, Y., Zhang, S., Li, F., Yin, Y., Sun, Z., Chen, X., Yin, H., PRMT3-Mediated Arginine Methylation of METTL14 Promotes Malignant Progression and Treatment Resistance in Endometrial Carcinoma. Adv. Sci. 2023, 2303812.