SIRT6調(diào)節(jié)的巨噬細(xì)胞胞葬作用表觀遺傳控制糖尿病牙周炎的炎癥消退

        糖尿病加劇了牙周炎的患病率和嚴(yán)重程度，導(dǎo)致嚴(yán)重的牙周破壞并最終導(dǎo)致牙齒脫落。炎癥的延遲消退是糖尿病牙周炎(DP)發(fā)病機(jī)制的主要因素，但這種不平衡的免疫穩(wěn)態(tài)的潛在機(jī)制尚不清楚。下圖為23年巨噬細(xì)胞胞葬中標(biāo)題目：

        巨噬細(xì)胞中SIRT6作為組蛋白去乙酰化酶的不足導(dǎo)致人類和小鼠DP中未解決的炎癥和加重的牙周炎，并伴有凋亡性中性粒細(xì)胞(AN)的積累和中性粒細(xì)胞胞外陷阱的增加。在機(jī)制上，驗(yàn)證了巨噬細(xì)胞接受高糖刺激導(dǎo)致SIRT6-miR-216/217軸紊亂，通過直接靶向DEL-1/CD36軸觸發(fā)AN的胞葬受阻。此外，我們證明了SIRT6對(duì)MIR217HG轉(zhuǎn)錄的抑制作用，并鑒定了微處理器的作用，即SIRT6通過hnRNPA2B1、DGCR8和Drosha復(fù)合體在表觀遺傳學(xué)上阻礙了初級(jí)miR-216/217的剪接。該研究于23年1月發(fā)表于《Theranostics》，IF：12.4。

技術(shù)路線：

1.嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在人DP中的特征性分布

        為了探索糖尿病相關(guān)炎癥性疾病中細(xì)胞群組成和調(diào)節(jié)細(xì)胞通路的差異，使用單細(xì)胞測(cè)序分析了來自健康非糖尿病和糖尿病足潰瘍非治愈者（DFU-Non-healer）的足部皮膚樣本GSE165816 .GO富集分析結(jié)果顯示，炎癥和細(xì)胞凋亡相關(guān)通路被激活（圖1A和B）。在鑒定的炎癥細(xì)胞中，研究專注于增加巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，并通過GO分析和UMAP分析進(jìn)一步鑒定巨噬細(xì)胞簇的細(xì)胞群。UMAP分析顯示巨噬細(xì)胞異常極化（圖1C）。GO富集分析顯示，與非DM對(duì)照巨噬細(xì)胞相比，糖尿病巨噬細(xì)胞在免疫反應(yīng)、吞噬作用、遷移能力和葡萄糖代謝等相關(guān)途徑中出現(xiàn)異常（圖1D和E）。這些結(jié)果表明，糖尿病創(chuàng)面愈合過程中的異常炎癥反應(yīng)可能是由細(xì)胞凋亡相關(guān)通路的大量激活和巨噬細(xì)胞的異常吞噬能力引起的。為了進(jìn)一步探討DP炎癥持續(xù)升高是否與巨噬細(xì)胞吞噬能力異常有關(guān)，我們收集了患有或不患有糖尿病的牙周炎患者的牙齦樣本（圖1F）。因此，我們首先在牙齦中檢測(cè)到中性粒細(xì)胞，結(jié)果顯示DP中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（CD15）細(xì)胞數(shù)量高于CP組（1G和L）。采用連續(xù)切片牙齦組織進(jìn)行TUNEL染色，結(jié)果顯示DP的牙齦組織中有大量的凋亡細(xì)胞，而CP中幾乎沒有可見的凋亡細(xì)胞（圖1H和M）。此外，通過切片進(jìn)行比較觀察，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)凋亡細(xì)胞是CD15中性粒細(xì)胞（圖1G和H）。隨后使用MPO和H3cit標(biāo)記NETs，發(fā)現(xiàn)DP中中性粒細(xì)胞的過度積累和延遲去除導(dǎo)致了大量NETs的形成（圖1I和N），從而加重了糖尿病患者的炎癥并延遲了炎癥的消退。為進(jìn)一步探究未及時(shí)清除的凋亡中性粒細(xì)胞是否為巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)異常所導(dǎo)致的，接下來對(duì)巨噬細(xì)胞極化進(jìn)行免疫熒光染色。巨噬細(xì)胞（CD68）在DP牙齦中的浸潤(rùn)率遠(yuǎn)高于CP（圖1O）。DP組CD68、CD86陽性M1巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)率高于CP組（圖1J和P），CD68 CD206陽性M2極化巨噬細(xì)胞中DP組和CP組無差異（圖1K和Q）。然而，DP組的M2/M1比值明顯低于CP組（圖1R）綜上所述，凋亡中性粒細(xì)胞和NETs的過度積累和延遲清除，伴有巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加和巨噬細(xì)胞極化破壞，無疑加重了DP炎癥。

圖1嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在人DP中的特征性分布

2.功能失調(diào)的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞會(huì)加重小鼠 DP 的炎癥損傷并損害炎癥消退

        為了探究糖尿病對(duì)牙周炎進(jìn)展和炎癥消退的影響，我們使用了兩種經(jīng)典的結(jié)扎誘導(dǎo)牙周炎（LIP）小鼠模型，即牙周炎模型和牙周炎消退模型。在牙周炎模型中進(jìn)行結(jié)扎過程長(zhǎng)達(dá)14天，而牙周炎消退模型中的小鼠結(jié)扎7天，然后去除結(jié)扎以模擬炎癥消退的過程再進(jìn)行7天（圖2A）進(jìn)行顯微CT和組織形態(tài)學(xué)分析以觀察牙槽骨丟失和炎癥。在牙周炎和牙周炎消退模型中，糖尿病小鼠從CEJ到ABC的距離均顯著增加（圖2B和I）。在牙周炎和牙周炎消退模型中，與CP組相比，糖尿病小鼠表現(xiàn)出更多的破骨細(xì)胞活性，TRAP陽性破骨細(xì)胞表面發(fā)生率更高（圖2C和J）。此外，在DP的牙周中觀察到大量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)以及MPO和H3cit NET（圖2D、K、E、L）。TUNEL染色還顯示DP牙周內(nèi)有大量凋亡細(xì)胞，而CP組未觀察到可見的凋亡細(xì)胞（圖2F和M）。DP組F4/80巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)大于CP組（圖2N）具體來說，F(xiàn)4/80+ CD86+ M1巨噬細(xì)胞的數(shù)量（圖2G和O）和F4 / 80 CD206 M2巨噬細(xì)胞（圖2H和P）顯著高于CP組。然而，在LIP模型的分辨率中，與CP組相比，DP中M2 / M1巨噬細(xì)胞的比率也顯著降低（圖2Q）總的來說，牙周組織中凋亡性粒細(xì)胞和NETosis的積累加速了牙周炎的進(jìn)展，而凋亡性中性粒細(xì)胞和NET的延遲清除阻礙了小鼠DP炎癥的消退。

圖2功能失調(diào)的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞會(huì)加重小鼠 DP 的炎癥損傷并損害炎癥消退

3.SIRT6 在高糖條件下顯著調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞胞吐作用

        高糖（HG）刺激后巨噬細(xì)胞吞噬凋亡中性粒細(xì)胞的能力下降(圖3A)。鑒于DM巨噬細(xì)胞團(tuán)團(tuán)的GO富集分析顯示NAD+代謝異常(圖1D, E)，我們進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)HG刺激可導(dǎo)致NAD+/NADH代謝異常(圖3B)。Sirtuins (SIRTs)是一個(gè)依賴NAD+的組蛋白去乙酰化酶家族，在葡萄糖穩(wěn)態(tài)、炎癥、基因組穩(wěn)定性和DNA修復(fù)中發(fā)揮作用。因此，我們確定并重點(diǎn)關(guān)注SIRT6，因?yàn)樗贖G條件下明顯下調(diào)，在48 h和72 h時(shí)最為明顯(圖3C)。為了進(jìn)一步研究SIRT6在DP巨噬細(xì)胞中的可能功能，CD68(巨噬細(xì)胞標(biāo)志物)和SIRT6共染色顯示，與CP相比，DP巨噬細(xì)胞中SIRT6的表達(dá)顯著降低(圖3D)。SIRT6抑制劑顯著降低了巨噬細(xì)胞進(jìn)行胞葬的能力，而SIRT6過表達(dá)則提高了其吞噬凋亡中性粒細(xì)胞的能力(圖3E, F)。與胞葬相比，凋亡細(xì)胞增加了巨噬細(xì)胞的遷移能力。綜上所述，高糖刺激導(dǎo)致巨噬細(xì)胞SIRT6的低表達(dá)，從而損害了胞葬，胞葬通過減少死細(xì)胞的DAMP釋放和維持生物穩(wěn)態(tài)來抑制炎癥。然而，當(dāng)糖尿病患者巨噬細(xì)胞的胞漿功能受損時(shí)，通過損傷相關(guān)的分子識(shí)別模型，促炎溶解細(xì)胞死亡，包括NETosis和胞葬，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加，打破了M1和M2分化的平衡。

圖3 SIRT6 在高糖條件下顯著調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞胞吐作用

4.髓細(xì)胞特異性SIRT6基因敲除會(huì)加重牙周炎并損害炎癥消退

        為了探索SIRT6介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞胞葬在牙周炎中的作用，我們將LysM-Cre小鼠與SIRT6flox/flox小鼠雜交產(chǎn)生mS6KO小鼠。與野生型小鼠骨髓巨噬細(xì)胞(BMMs)相比，mS6KO骨髓巨噬細(xì)胞吞噬凋亡中性粒細(xì)胞的能力下降(圖4A)。采用2月齡mS6KO小鼠及其WT窩代建立LIP模型和LIP分辨率模型。與WT小鼠相比，CEJ到ABC的距離(圖4B, I)和捕獲陽性的破骨細(xì)胞明顯增加(圖4C, J)。為了研究巨噬細(xì)胞胞葬功能受損是否與mS6KO小鼠的持續(xù)性骨質(zhì)流失有關(guān)，通過TUNEL染色評(píng)估m(xù)S6KO小鼠和WT小鼠牙周組織中凋亡細(xì)胞的數(shù)量(圖4D，結(jié)果顯示，與同窩野生型小鼠相比，mS6KO小鼠牙周組織中Ly6g+細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著增加(圖4E, L)， SIRT6敲除促進(jìn)了mS6KO小鼠牙周組織中NETosis(圖4F, M)， F4/80+ CD86+ M1巨噬細(xì)胞(圖4G, O)和F4/80+ CD206+ M2巨噬細(xì)胞(圖4H, P)。與WT小鼠相比，mS6KO小鼠牙周組織中抗炎的F4/80+ CD206+ M2巨噬細(xì)胞的百分比較低(圖4Q)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明SIRT6介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞胞葬與牙周破壞和炎癥的消退有關(guān)。

圖4髓細(xì)胞特異性SIRT6基因敲除會(huì)加重牙周炎并損害炎癥消退

5.SIRT6通過H3K56ac抑制miR-216a-5p-216b-5p-217簇的轉(zhuǎn)錄

        為了深入了解SIRT6調(diào)控巨噬細(xì)胞胞葬的詳細(xì)機(jī)制，我們進(jìn)一步評(píng)估了SIRT6對(duì)巨噬細(xì)胞中microRNA表達(dá)的影響。從SIRT6抑制后的巨噬細(xì)胞中分離RNA進(jìn)行miRNA PCR微陣列分析，結(jié)果顯示miR-216a-5p-216b-5p-217簇明顯增加，SIRT6表達(dá)下調(diào)(圖5A-C)。數(shù)據(jù)進(jìn)一步顯示SIRT6抑制和HG條件下miR-216a-5p-216b-5p-217簇表達(dá)增加(圖5D和F)，SIRT6過表達(dá)導(dǎo)致miR-216a-5p-216b-5p-217簇表達(dá)降低(圖5E)。為了進(jìn)一步闡明SIRT6如何抑制miR-216a-5p-216b-5p-217簇表達(dá)，通過ChIP-qPCR檢測(cè)了巨噬細(xì)胞中SIRT6宿主基因MIR217HG啟動(dòng)子的組蛋白修飾。SIRT6作為一種轉(zhuǎn)錄共抑制因子，通過催化位點(diǎn)9和56乙酰化的組蛋白H3賴氨酸殘基(H3K9ac和H3K56ac)的去乙?；G處理僅顯著上調(diào)H3K56ac的表達(dá)(圖5H)。使用覆蓋miR-216a-5p-216b-5p-217啟動(dòng)子的七對(duì)引物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示HG處理增加了miR-216a-5p-216b-5p-217集群?jiǎn)?dòng)子的H3K56ac水平(圖5I)。我們還進(jìn)一步證實(shí)了SIRT6抑制和HG條件下pri-miR-217簇表達(dá)增加(圖5J和L)，SIRT6過表達(dá)后pri-miR-217簇表達(dá)下調(diào)(圖5K)。值得注意的是，來自mS6KO小鼠的bmm顯示出增加的pri-miR-217和miR-216a-5p-216b-5p-217簇表達(dá)(圖5G和M)。

圖5 SIRT6通過H3K56ac抑制miR-216a-5p-216b-5p-217簇的轉(zhuǎn)錄

6.SIRT6 通過“非經(jīng)典”微處理器復(fù)合體抑制 miR-216a-5p-216b-5p-217 簇成熟

        有研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖代謝影響Drosha蛋白的表達(dá)，葡萄糖剝奪促進(jìn)Drosha表達(dá)，HG刺激抑制Drosha表達(dá)。同樣，我們的結(jié)果顯示HG刺激可以抑制巨噬細(xì)胞中Drosha蛋白的表達(dá)(圖6A)。為了進(jìn)一步探索HG條件下miR216a-5p-216b-5p-217簇成熟的機(jī)制，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種特異性的生物素標(biāo)記的pri-miR-217探針，在巨噬細(xì)胞中進(jìn)行RNA下拉實(shí)驗(yàn)，銀染顯示與pri-miR-217結(jié)合的幾個(gè)蛋白帶富集(圖6B)。同時(shí)，蛋白質(zhì)譜分析顯示hnRNPA2B1在識(shí)別蛋白列表中排名靠前，未觀察到Drosha和DGCR8。RIP實(shí)驗(yàn)顯示，與IgG相比，hnRNPA2B1抗體降低了更多的pri-miR-217(圖6C)。據(jù)報(bào)道，hnRNPA2B1與microRNA微處理器復(fù)合物蛋白DGCR8相互作用，通過結(jié)合m6A標(biāo)記初級(jí)miRNA轉(zhuǎn)錄物來切割初級(jí)miRNA。內(nèi)源性hnRNPA2B1蛋白與巨噬細(xì)胞中DGCR8和Drosha的共免疫沉淀(Co-IP)表明它們之間存在直接的物理相互作用，hnRNPA2B1與DGCR8結(jié)合，而未觀察到Drosha(圖6F)。我們進(jìn)一步確定DGCR8可以與Drosha結(jié)合，這意味著hnRNPA2B1與DGCR8結(jié)合，招募Drosha形成微處理器復(fù)合物，“非規(guī)范”微處理器復(fù)合物識(shí)別并切割pri-miR-217(圖6E)。Co-IP還顯示SIRT6抑制促進(jìn)了“非規(guī)范”微處理器復(fù)合物的形成，SIRT6過表達(dá)減少了微處理器復(fù)合物(圖6G)。此外，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，高葡萄糖不僅增加了與pri-miR-217結(jié)合的hnRNPA2B1(圖6D)。Chip的結(jié)果還顯示，HG處理增加了hnRNPA2B1啟動(dòng)子的H3K56ac(圖6H)。為了確定HG是否以hnRNPA2B1依賴的方式影響pri-miR-217的加工，我們對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行了hnRNPA2B1敲低，發(fā)現(xiàn)成熟miRNA的水平下降，而其pri-miR-217的水平上升(圖6I, J)。FISH染色顯示HG刺激導(dǎo)致細(xì)胞核中pri-miR-217的減少，以及敲低hnRNPA2B1后細(xì)胞核中pri-miR-217的積累(圖6K)。這些數(shù)據(jù)表明SIRT6不僅可以促進(jìn)pri-miR-217的轉(zhuǎn)錄，還可以通過促進(jìn)HG條件下“非規(guī)范”微處理器復(fù)合物的形成來促進(jìn)miR216a-5p-216b-5p-217簇的成熟。

圖6 SIRT6 通過“非經(jīng)典”微處理器復(fù)合體抑制 miR-216a-5p-216b-5p-217 簇成熟

7.miR-216a-5p-216b-5p-217簇通過靶向DEL-1和CD36負(fù)性調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的胞葬

        DEL-1和CD36已被確定為巨噬細(xì)胞胞葬和炎癥清除的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。我們假設(shè)SIRT6通過miR-216/217簇/ DEL-1 CD36軸調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的胞葬和炎癥的消退。生物信息學(xué)算法(miRwalk)的結(jié)果表明，miR-216a-5p-216b-5p-217簇與DEL-1和CD36 mRNA的3'UTR結(jié)合(圖7A)。隨后，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，miR216a-5p216b-5p-217簇的共轉(zhuǎn)染降低了WT-DEL-1-3'UTR和WT-CD36-3'UTR的熒光素酶活性，而Mut-DEL-1-3'UTR和Mut-CD36 -3'UTR的熒光素酶活性不受影響(圖7B)。此外，Western blot分析顯示，在miR216a-5p-216b-5p-217 mimic處理的巨噬細(xì)胞中，DEL-1和CD36表達(dá)降低，而在miR-216b5p-217 inhibitor處理的巨噬細(xì)胞中，DEL-1和CD36表達(dá)升高(圖7C)。免疫熒光也證實(shí)了DEL-1和CD36在糖尿病牙周炎中的低表達(dá)(圖7D)。miR216a-5p-216b-5p-217簇的過表達(dá)降低了巨噬細(xì)胞的吞噬能力(圖7E)，在這三種micRNA中，miR-217對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬作用影響最大。HG環(huán)境下miR-217敲低可以像重組DEL-1蛋白一樣恢復(fù)巨噬細(xì)胞的胞葬(圖7F)?？傮w而言，我們的研究結(jié)果支持SIRT6通過促進(jìn)pri-miR-217轉(zhuǎn)錄和pri-miR“非規(guī)范”微處理器復(fù)合物的形成負(fù)調(diào)控miR216a-5p/ 216b-5p-217簇表達(dá)的假設(shè)。該microRNA簇通過靶向關(guān)鍵的胞葬分子DEL-1和CD36抑制巨噬細(xì)胞的胞葬，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥消退功能失調(diào)。 

圖7miR-216a-5p-216b-5p-217簇通過靶向DEL-1和CD36負(fù)性調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的胞葬

8.局部給藥antagomir-217促進(jìn)小鼠DP炎癥的消退

        根據(jù)上述功能獲得和功能喪失研究中的吞噬指數(shù)觀察，miR-217表現(xiàn)出更好的表型，并被選擇用于體內(nèi)干預(yù)治療。我們?cè)诮Y(jié)扎絲后第3、6、9和12天立即將miR-217特異性拮抗劑或scramble (NC)-miR注射到糖尿病小鼠的牙周組織中(圖8A)。在第7天解除結(jié)扎后，安他哥米-217注射液顯著改善了糖尿病小鼠牙周炎癥和骨質(zhì)丟失(圖8B、C、G、H)。注射安他哥米-217后，糖尿病小鼠牙周組織中DEL-1的表達(dá)顯著增加(圖8D和I)。注射安他哥米-217后，糖尿病小鼠牙周組織中Ly6g+中性粒細(xì)胞的數(shù)量顯著減少(圖8E和J)。注射安塔戈米爾-217后，MPO+ H3cit+ NET(圖8L)和凋亡細(xì)胞的形成明顯減少(圖8F和K)。安塔戈米爾-217治療組M2抗炎巨噬細(xì)胞比例較高(圖8O)，而對(duì)照組大部分巨噬細(xì)胞為M1巨噬細(xì)胞(圖8M, N, P)?？偠灾?，這些結(jié)果表明，通過沉默miR-217抑制SIRT6 / miR216a-5p-216b-5p-217簇/ DEL-1和CD36調(diào)節(jié)軸可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的胞葬以清除凋亡細(xì)胞，這意味著該調(diào)節(jié)軸具有作為糖尿病炎癥解決靶點(diǎn)的潛力。

圖8局部給藥antagomir-217促進(jìn)小鼠DP炎癥的消退

結(jié)論：

        綜上所述，作者揭示了SIRT6-miR-216/217軸在糖尿病背景下巨噬細(xì)胞胞葬中的重要作用，并概述了通過抑制miR-217來改善炎癥消退和牙周組織修復(fù)的方法。這一策略可能與糖尿病和其他慢性炎癥性疾病的管理相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)方法：

        小鼠牙周炎和消退造模、蘇木精和伊紅、Masson 染色、免疫熒光染色、流式檢測(cè)凋亡細(xì)胞的吞噬作用、RNA pull-down 、RIP、ChIP、FISH、Co-IP、雙熒光素酶報(bào)告基因。

參考文獻(xiàn)：

        Li B, Xin Z, Gao S, et al. SIRT6-regulated macrophage efferocytosis epigenetically controls inflammation resolution of diabetic periodontitis. Theranostics. 2023;13(1):231-249. Published 2023 Jan 1.