腫瘤來(lái)源的細(xì)胞因子CHI3L1誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)促進(jìn)三陰性乳腺癌的T細(xì)胞排斥
免疫療法徹底改變了癌癥治療，并正在迅速成為癌癥治療的基石。盡管免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）在多種癌癥類型中取得了成功，但其在三陰性乳腺癌（TNBC）患者中的有限成功凸顯出研究者需要更好地了解腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）及其調(diào)節(jié)因子。通過(guò)分析T細(xì)胞數(shù)量及其空間分布，TNBC根據(jù)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞浸潤(rùn)的模式被細(xì)分為不同的亞型。闡明T細(xì)胞的基質(zhì)限制機(jī)制是刺激T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和改善患者結(jié)局的關(guān)鍵。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（Stat）家族是調(diào)控TIME的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路。事實(shí)上，在表達(dá)與Cre重組酶（MIC）相關(guān)的多瘤病毒中T（PyMT）癌基因的多西環(huán)素誘導(dǎo)的基因工程小鼠模型（GEMM）中，乳腺上皮STAT3的消融并不影響腫瘤的啟動(dòng)，而是促進(jìn)免疫介導(dǎo)的腫瘤消除。MIC模型通過(guò)不同的組織學(xué)階段發(fā)展乳腺腫瘤，模擬人類乳腺癌從增生到轉(zhuǎn)移癌的進(jìn)展。然而，STAT3缺陷的病變會(huì)消退，并被CD8+ T細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的穩(wěn)健免疫應(yīng)答消除。免疫抑制的確切STAT3依賴機(jī)制仍不清楚。在腫瘤細(xì)胞中，與免疫抑制相關(guān)的一個(gè)直接STAT3轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)是細(xì)胞因子幾丁質(zhì)酶-3樣1（CHI3L1）。CHI3L1是乳腺癌疾病侵襲性和腫瘤分級(jí)的生物標(biāo)志物。CHI3L1可使巨噬細(xì)胞極化為M2狀態(tài)，并促進(jìn)多種實(shí)體癌的轉(zhuǎn)移。然而，其對(duì)其他免疫細(xì)胞的作用以及在TNBC中的作用仍有待探索。該研究發(fā)表在《Immunity》，IF：32.4。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. 在STAT3缺陷的病變中CHI3L1表達(dá)降低
為了闡明STAT3依賴的免疫抑制機(jī)制，使用RNA測(cè)序比較了野生型和STAT3缺陷的MIC病灶在多西環(huán)素誘導(dǎo)后2周的轉(zhuǎn)錄譜。在STAT3缺陷性病變中表達(dá)差異最大的基因是CHI3L1，它編碼分泌的細(xì)胞因子CHI3L1（圖1A），而CHI3L1是STAT3的直接靶點(diǎn)，具有明確的免疫抑制特性。分別使用qPCR和免疫印跡證實(shí)了CHI3L1在mRNA和蛋白水平的差異表達(dá)（圖1B-D）。由于CHI3L1可由多種細(xì)胞類型產(chǎn)生，研究者利用RNA原位雜交確定了野生型MIC病變中CHI3L1的細(xì)胞來(lái)源。大多數(shù)CHI3L1 mRNA在增生的上皮細(xì)胞中檢測(cè)到，而這一信號(hào)在STAT3缺陷的病變中丟失（圖1E，F）。相比之下，基質(zhì)細(xì)胞很少表達(dá)CHI3L1，其表達(dá)不受上皮中STAT3缺失的影響（圖1G）。因此，在MIC GEMM中，CHI3L1主要由增生的上皮細(xì)胞以STAT3依賴的方式產(chǎn)生。
癌癥基因組圖譜分析表明，CHI3L1表達(dá)在許多人類癌癥中升高，包括肺癌、結(jié)直腸癌、食管癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和基底乳腺癌等。由于基底腫瘤是典型的三陰性腫瘤，研究者使用免疫熒光染色檢測(cè)了CHI3L1在不同的TNBC免疫亞型中的表達(dá)。CHI3L1表達(dá)在SR亞組中最高（圖1H，I）。在SR亞型中，CHI3L1表達(dá)遵循雙峰分布，即一些腫瘤高表達(dá)CHI3L1，而其他腫瘤低表達(dá)CHI3L1（圖1I）。對(duì)三陰性乳腺癌樣本進(jìn)行活化p-STAT3染色，觀察到CHI3L1表達(dá)和p-STAT3之間呈正相關(guān)（圖1J-L）。CHI3L1水平升高的SR腫瘤有較高的p-STAT3（圖1J）。
圖1 CHI3L1是STAT3依賴的腫瘤衍生因子
2. CHI3L1表達(dá)與多種癌癥類型中T細(xì)胞的間質(zhì)限制相關(guān)
由于SR腫瘤的特征是腫瘤巢內(nèi)排除CD8+ T細(xì)胞，因此研究者研究了CHI3L1是否可能是促進(jìn)這一現(xiàn)象的腫瘤衍生因子。通過(guò)將針對(duì)CHI3L1的RNA熒光原位雜交（FISH）與CD4和CD8的免疫熒光染色相結(jié)合，研究者觀察到輔助性和細(xì)胞毒性T細(xì)胞在空間上局限于間質(zhì)，無(wú)法浸潤(rùn)WT MIC乳腺中的CHI3L1+病灶（圖2A-D）。CD4+和CD8+ T細(xì)胞與CHI3L1+細(xì)胞的距離均隨著CHI3L1轉(zhuǎn)錄本的增加而增加，表明存在潛在的劑量依賴性排斥（圖2B，D）。與此一致，對(duì)TNBC腫瘤進(jìn)行的免疫組織化學(xué)(IHC)分析表明，細(xì)胞毒性T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞位于CHI3L1+腫瘤的遠(yuǎn)端（圖2E-G）。研究者還觀察到CHI3L1在TNBC中的異質(zhì)性表達(dá);同一腫瘤有CHI3L1高表達(dá)區(qū)域，而CHI3L1陰性區(qū)域和CHI3L1表達(dá)區(qū)域顯示T細(xì)胞基質(zhì)限制（圖2E）。在TNBC腫瘤中，CHI3L1表達(dá)與輔助性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)（圖2H，I）。
接下來(lái)，研究者評(píng)估了其他癌癥類型中CHI3L1表達(dá)和T細(xì)胞排斥之間的關(guān)系。多器官癌組織芯片的多重免疫熒光分析表明CHI3L1在肺癌中表達(dá)。與研究者在TNBC中的觀察結(jié)果一致，CHI3L1+肺腫瘤區(qū)域排除了細(xì)胞毒性T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞（圖2J-L）。研究者觀察到CHI3L1水平與浸潤(rùn)的T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（圖2K，L）。盡管樣本量較小，但在結(jié)腸癌中也觀察到類似趨勢(shì)（圖2J）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，依賴CHI3L1的T細(xì)胞間質(zhì)限制是這些上皮癌的共同特征。
圖2 T細(xì)胞被排除在CHI3L1+腫瘤中
3. CHI3L1的缺失破壞了乳腺腫瘤的發(fā)生，延緩了腫瘤的進(jìn)展
為了闡明CHI3L1在乳腺腫瘤發(fā)生中的作用，研究者利用基于crispr的基因編輯技術(shù)產(chǎn)生了Friend virus B CHI3L1缺陷（CHI3L1-/-）動(dòng)物（圖3A）。在雌性MIC CHI3L1完整和缺陷小鼠隊(duì)列中，通過(guò)多西環(huán)素治療2周誘導(dǎo)腫瘤，研究者觀察到STAT3缺陷系統(tǒng)的整體免疫變化。使用免疫印跡分析證實(shí)CHI3L1蛋白缺失，并且STAT3表達(dá)或活化沒(méi)有隨之增加（圖3B），表明STAT3活性在chi311缺陷背景中是完整的。
對(duì)2周誘導(dǎo)的乳腺的組織學(xué)分析顯示，CHI3L1缺失后，乳腺上皮增生減少（圖3C-F）。與CHI3L1完整的乳腺中觀察到的充滿的導(dǎo)管上皮內(nèi)瘤樣結(jié)構(gòu)相比，CHI3L1缺陷的乳腺導(dǎo)管有明顯的管腔，上皮總量減少（圖3C-F）。雖然CHI3L1+/+小鼠在誘導(dǎo)后6周出現(xiàn)可觸及的腫瘤，但CHI3L1-/-小鼠有殘留增生，上皮內(nèi)容物總量減少（圖3G-J）。研究者一致觀察到，在CHI3L1-/-小鼠中，可觸及的乳腺腫瘤發(fā)生延遲（圖3I，J）。綜上所述，這些觀察結(jié)果表明CHI3L1在乳腺腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。
考慮到模型的生殖細(xì)胞系性質(zhì)，有必要研究上皮而非間質(zhì)室中的CHI3L1缺失是否導(dǎo)致了腫瘤進(jìn)展的延遲。研究者將未經(jīng)多西環(huán)素處理的CHI3L1缺陷乳腺移植到同系CHI3L1完整受者（CHI3L1-/- TX WT）清除后的乳腺脂肪墊中誘導(dǎo)2周。在該模型中，只有供體上皮缺乏CHI3L1，而CHI3L1的基質(zhì)來(lái)源完整（圖3K）。受體乳腺組織學(xué)表型為MIC CHI3L1缺陷的腺體，其中導(dǎo)管有明顯的空腔（圖3L，M）。相比之下，移植到CHI3L1缺陷宿主（WT TX CHI3L1?/?）中的CHI3L1+/+ MIC乳腺表現(xiàn)出充滿的導(dǎo)管上皮內(nèi)腫瘤結(jié)構(gòu)（圖3K-M）。因此，上皮細(xì)胞是CHI3L1的主要來(lái)源，而基質(zhì)細(xì)胞中CHI3L1的缺失不能解釋對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響。
圖3 CHI3L1消融扭曲了乳腺腫瘤的發(fā)生，延緩了腫瘤的進(jìn)展
4. CHI3L1產(chǎn)生免疫抑制的TIME，從而驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)展
鑒于STAT3缺陷的MIC小鼠表現(xiàn)出由主動(dòng)免疫應(yīng)答驅(qū)動(dòng)的腫瘤進(jìn)展嚴(yán)重延遲，研究者評(píng)估了在CHI3L1-/-小鼠中觀察到的乳腺腫瘤發(fā)展缺陷是否與主動(dòng)抗腫瘤免疫應(yīng)答相關(guān)。通過(guò)免疫熒光染色，研究者觀察到與CHI3L1+/+乳腺相比，CHI3L1-/-乳腺中的總免疫細(xì)胞（CD45+）增加（圖4A，B）。與CHI3L1促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2狀態(tài)極化的作用一致，研究者觀察到在CHI3L1消融后，M2巨噬細(xì)胞（F4/80+ CD206+）丟失，M1巨噬細(xì)胞（F4/80+ p-Stat1+）相應(yīng)增加，但巨噬細(xì)胞總計(jì)數(shù)無(wú)變化（圖4C-G）。此外，與CHI3L1+/+乳腺相比，CHI3L1?/?乳腺富含總T細(xì)胞(CD3+細(xì)胞)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD3+ CD8+）和輔助性T細(xì)胞（CD3+ CD4+）（圖4H-N）。研究者還觀察到通過(guò)PD1和顆粒酶B表達(dá)評(píng)估的T細(xì)胞活化增加（圖4H-P）。需要注意的是，PD1是T細(xì)胞活化的標(biāo)志物，但在其配體PD-l1存在的情況下也可表明T細(xì)胞耗竭。在該模型中，PD1的表達(dá)遵循與顆粒酶B（經(jīng)典的T細(xì)胞活化標(biāo)志物）相似的模式?？傮w而言，研究者的數(shù)據(jù)表明，CHI3L1缺失后觀察到的腫瘤進(jìn)展延遲與活化的CD8+、CD4+ T細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞參與的主動(dòng)抗腫瘤免疫應(yīng)答的募集相關(guān)。
綜上所述，這些藥理學(xué)和遺傳學(xué)數(shù)據(jù)表明，CHI3L1是一種主要的免疫抑制細(xì)胞因子，通過(guò)驅(qū)動(dòng)M2巨噬細(xì)胞極化、抑制T細(xì)胞募集和活化來(lái)支持腫瘤進(jìn)展。
圖4 CHI3L1消融改變了腫瘤免疫微環(huán)境
5. CHI3L1介導(dǎo)T細(xì)胞間質(zhì)限制促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)
鑒于研究者觀察到表達(dá)CHI3L1的病變周圍的T細(xì)胞排斥，研究者對(duì)CHI3L1消融后的T細(xì)胞進(jìn)行了多重免疫熒光空間分析。對(duì)CHI3L1缺陷性病變所做的分析表明，與CHI3L1完整性病變相比，腫瘤巢浸潤(rùn)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞及其活化的對(duì)應(yīng)細(xì)胞增多（圖5A-C）。對(duì)于在CHI3L1缺陷型增生性病變中顯著富集的輔助性T細(xì)胞，研究者也觀察到類似結(jié)果（圖5D-F）。與基因消融一致，抗CHI3L1治療富集了腫瘤浸潤(rùn)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞（圖5G-L）。
鑒于T細(xì)胞排斥會(huì)導(dǎo)致對(duì)免疫療法的耐藥，研究者接下來(lái)評(píng)估了CHI3L1缺失可否改善對(duì)pd1阻斷的應(yīng)答。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，研究者將CHI3L1完整和缺陷的PyMT腫瘤移植到同系小鼠的乳腺脂肪墊中，并使用抗PD1或IgG2a對(duì)照進(jìn)行治療。與之前的報(bào)告一致，CHI3L1-精通的PyMT腫瘤對(duì)抗PD1耐藥（圖5M，N）。相比之下，CHI3L1缺陷的腫瘤對(duì)抗PD1的應(yīng)答改善，這一點(diǎn)可以通過(guò)其較慢的生長(zhǎng)速度來(lái)證明（圖5M）。
為了評(píng)估針對(duì)CHI3L1的治療靶點(diǎn)是否對(duì)免疫治療應(yīng)答產(chǎn)生類似影響，研究者使用抗CHI3L1中和抗體、抗PD1或兩者聯(lián)合治療了CHI3L1陽(yáng)性的PyMT腫瘤。雖然抗CHI3L1單藥治療未影響腫瘤生長(zhǎng)，但研究者觀察到與抗PD1聯(lián)合治療有顯著的協(xié)同反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)較慢（圖5N）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明CHI3L1促進(jìn)T細(xì)胞的基質(zhì)限制，靶向CHI3L1是一種可行的治療策略，以增強(qiáng)T細(xì)胞浸潤(rùn)和改善ICB反應(yīng)。
圖5 基因和藥物消融CHI3L1可緩解T細(xì)胞的基質(zhì)限制，并改善對(duì)免疫治療的應(yīng)答
6. CHI3L1促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集和NET形成
除了改變適應(yīng)性免疫細(xì)胞外，中性粒細(xì)胞還通過(guò)NETosis促進(jìn)免疫抑制。NETs通過(guò)在腫瘤周圍形成物理屏障，在癌癥進(jìn)展、免疫抑制、轉(zhuǎn)移和T細(xì)胞排斥中發(fā)揮重要作用。為了評(píng)估CHI3L1對(duì)中性粒細(xì)胞的影響，研究者將Ly6G作為中性粒細(xì)胞的一般標(biāo)志物，同時(shí)將髓過(guò)氧化物酶（MPO）和瓜氨酸化H3（CitH3）作為NETosis的標(biāo)志物。CHI3L1缺失減少了總中性粒細(xì)胞和接受NETosis的中性粒細(xì)胞（Ly6G+ MPO+ CitH3+）（圖6A-E）。這一點(diǎn)在免疫印跡分析中得到了進(jìn)一步證實(shí)。此外，人類TNBC的IHC分析表明CHI3L1表達(dá)和中性粒細(xì)胞之間呈正相關(guān)（圖6F，G）。
雖然這些結(jié)果表明CHI3L1在中性粒細(xì)胞募集和NETosis中具有潛在的功能作用，但研究者使用小鼠中性粒細(xì)胞和人類早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系（HL-60）在體外獨(dú)立地驗(yàn)證了這一點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，研究者對(duì)小鼠中性粒細(xì)胞進(jìn)行了transwell遷移實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估其向含有重組小鼠CHI3L1（rmCHI3L1）或PBS對(duì)照的培養(yǎng)基的遷移。結(jié)果顯示對(duì)rmCHI3L1的強(qiáng)烈遷移反應(yīng)（圖6H，I）。這些數(shù)據(jù)表明CHI3L1是一個(gè)強(qiáng)的趨化刺激，促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集。
為了進(jìn)一步研究CHI3L1在NET形成中的作用，在rmCHI3L1存在的情況下培養(yǎng)原代小鼠中性粒細(xì)胞。通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)到rmCHI3L1刺激導(dǎo)致了CitH3-DNA復(fù)合物的擠出(圖6J-L)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明CHI3L1在中性粒細(xì)胞募集和NETosis中起著關(guān)鍵作用。
對(duì)人TNBC和MIC樣本進(jìn)行的免疫熒光分析表明，CD8+ T細(xì)胞與CHI3L1+上皮被一層MPO+細(xì)胞分離（圖6M，N），這表明正如之前證明的那樣，中性粒細(xì)胞密切促進(jìn)T細(xì)胞排斥。
圖6 CHI3L1促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集和NET形成
7. CHI3L1誘導(dǎo)的間質(zhì)限制是通過(guò)NETosis介導(dǎo)的
誘導(dǎo)2周時(shí)的組織學(xué)分析表明，與CHI3L1缺陷的乳腺相似，與igg2a治療的對(duì)照小鼠相比，清除中性粒細(xì)胞的MIC腺體的導(dǎo)管上皮內(nèi)瘤變減少（圖7A，B）。中性粒細(xì)胞清除組的大多數(shù)導(dǎo)管有空腔，而對(duì)照組的導(dǎo)管充滿（圖7A-C）。鑒于CHI3L1促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化，以及它們?cè)?span>T細(xì)胞排斥中的作用，因此評(píng)估巨噬細(xì)胞是否參與了CHI3L1的促腫瘤功能至關(guān)重要。與之前的報(bào)道一致，抗csf1r（集落刺激因子1受體）或抗f4 /80抗體治療減少了巨噬細(xì)胞頻率，但未影響乳腺導(dǎo)管增生（圖7A-C）。此外，抗Ly6G治療減少了總體增生面積（圖7A-C）。這些數(shù)據(jù)表明，巨噬細(xì)胞在誘導(dǎo)乳腺病變中是不需要的，而中性粒細(xì)胞是CHI3L1在MIC GEMM中促腫瘤功能的主要中介。
為了進(jìn)一步研究中性粒細(xì)胞在T細(xì)胞基質(zhì)限制中的作用，研究者對(duì)中性粒細(xì)胞缺失的乳腺和對(duì)照乳腺進(jìn)行CHI3L1的RNA FISH分析，并結(jié)合CD4和CD8染色。此外，之前觀察到的CHI3L1+病變周圍的T細(xì)胞排斥在清除中性粒細(xì)胞后消失（圖7D-G）。綜上所述，研究者的結(jié)果表明，腫瘤來(lái)源的CHI3L1協(xié)同中性粒細(xì)胞介導(dǎo)T細(xì)胞排斥。
為了評(píng)估NETosis的相對(duì)作用，研究者用DNA酶、蛋白質(zhì)精氨酸脫亞胺酶4抑制劑（PAD4i）、GSK484或溶劑對(duì)照處理MIC小鼠。與抗Ly6G治療的乳腺類似，研究者觀察到PAD4i和dnase治療的乳腺增生減少，導(dǎo)管未閉上皮內(nèi)瘤變?cè)黾樱▓D7H-J）。與抗Ly6G治療相似，抑制NETosis使T細(xì)胞不再被排斥出CHI3L1+病變（圖7K-N）。與之前的研究一致，不受PAD4i或DNase處理影響的中性粒細(xì)胞功能不會(huì)促進(jìn)CHI3L1介導(dǎo)的T細(xì)胞排斥。這些發(fā)現(xiàn)支持CHI3L1直接誘導(dǎo)NETs促進(jìn)T細(xì)胞排斥的觀點(diǎn)（圖7O）。
圖7 靶向中性粒細(xì)胞消除了CHI3L1誘導(dǎo)的T細(xì)胞間質(zhì)限制，扭曲了腫瘤發(fā)生
結(jié)論：
該研究表明，分泌的細(xì)胞因子CHI3L1產(chǎn)生的免疫抑制TIME在M2巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中豐富，但缺乏活化的T細(xì)胞。此外，CHI3L1可直接誘導(dǎo)NETosis，將T細(xì)胞排除到間質(zhì)中，阻止其向腫瘤浸潤(rùn)。未來(lái)的臨床引入CHI3L1靶向治療有可能重新激活抗腫瘤免疫反應(yīng)和增強(qiáng)T細(xì)胞浸潤(rùn)，從而改善ICB反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)方法：
小鼠模型，細(xì)胞培養(yǎng)，小鼠乳腺移植試驗(yàn)，小鼠藥物治療，RNA測(cè)序，定量逆轉(zhuǎn)錄酶PCR（qRT-PCR），免疫印跡，多重?zé)晒饷庖呓M化，流式細(xì)胞分析，跨孔遷移測(cè)定，酶聯(lián)免疫吸附
參考文獻(xiàn)：
Taifour T, Attalla SS, Zuo D, Gu Y, Sanguin-Gendreau V, Proud H, et al. The tumor-derived cytokine CHI3L1 induces neutrophil extracellular traps that promote T cell exclusion in triple-negative breast cancer. Immunity. 2023 Nov 18:S1074-7613(23)00483-1. doi: 10.1016/j.immuni.2023.11.002.