肝癌鐵死亡新機(jī)制：靶向USP8通過穩(wěn)定OGT抑制SLC7A11 O-GlcNAc糖基化

        肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌中最常見的亞型，是一種致命的侵襲性惡性腫瘤。泛素化是一種翻譯后修飾，在細(xì)胞存活、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、抗原提呈等過程中發(fā)揮重要作用。去泛素化酶（Deubiquitylating Enzymes，DUBs）可以調(diào)控蛋白質(zhì)的泛素化修飾，與多種癌基因和腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)，因此DUB抑制劑的開發(fā)成為癌癥治療中有吸引力的靶點(diǎn)。本研究考察DUBs抑制劑在HCC中的抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)泛素特異性肽酶8（Ubiquitin Specific Peptidase 8，USP8）小分子抑制劑DUB-IN-3有顯著的抗癌反應(yīng)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明靶向USP8參與鐵死亡并抑制HCC增殖和肺轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步機(jī)制研究表明，USP8去泛素化修飾O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶（O-GlcNAc Transferase，OGT）蛋白，提高其蛋白的穩(wěn)定性，后者通過O-GlcNAc糖基化調(diào)控鐵死亡關(guān)鍵蛋白SLC7A11的Ser26位點(diǎn)的糖基化，從而抑制肝癌鐵死亡，促進(jìn)肝癌進(jìn)展。以上研究表明了USP8可能是一個(gè)潛在的HCC治療靶點(diǎn)。

        該研究于2023年10月發(fā)表在《Advanced Science》，IF：15.1

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1. DUB-IN-3有效抑制HCC

        為了發(fā)現(xiàn)有效的HCC生長(zhǎng)抑制劑，作者在6種HCC細(xì)胞系中篩選了23種已知靶向人DUBs的化合物。所有細(xì)胞系都對(duì)USP8抑制劑DUB-IN-3表現(xiàn)出高敏感性（圖1A，B）。作者還發(fā)現(xiàn)DUB-IN-3以劑量和時(shí)間依賴性的方式降低了LM3和Hep3B細(xì)胞的細(xì)胞活力（圖1C，D）。接下來通過PI染色測(cè)試了DUB-IN-3對(duì)細(xì)胞死亡的影響。如圖1E所示，DUB-IN-3顯著誘導(dǎo)HCC細(xì)胞死亡；Calcein AM/PI染色結(jié)果證明了這一結(jié)論（圖1F，G）。作者進(jìn)一步從原發(fā)性肝癌中建立6種患者來源的類器官，并測(cè)試DUB-IN-3的抗癌活性，發(fā)現(xiàn)DUB-IN-3在類器官模型中表現(xiàn)出顯著的癌癥抑制作用（圖1H，I）。

        為了進(jìn)一步研究DUB-IN-3的抗癌效果，作者選擇對(duì)DUB-IN-3處理有較高敏感性的LM3和Hep3B細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步分析。CCK8分析表明DUB-IN-3抑制HCC細(xì)胞的增殖（圖2A）。克隆形成試驗(yàn)表明DUB-IN-3顯著抑制HCC細(xì)胞的克隆形成能力（圖2B）。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DUB-IN-3抑制LM3和Hep3B細(xì)胞的DNA合成（圖2C）。Calcein AM/PI染色表明DUB-IN-3導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加（圖2D）。Transwell試驗(yàn)表明DUB-IN-3顯著降低LM3和Hep3B細(xì)胞的侵襲能力（圖2E）。接下來研究了DUB-IN-3在HCC干性特征中的作用，發(fā)現(xiàn)DUB-IN-3 顯著抑制了LM3和Hep3B細(xì)胞的成球能力（圖2F）。隨后利用異種移植和尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型來探究DUB-IN-3在體內(nèi)肝癌中的作用，結(jié)果表明DUB-IN-3顯著抑制了體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移（圖2G-L）。這些數(shù)據(jù)表明DUB-IN-3可能通過靶向USP8作為一種新型有效的抗HCC藥物。

圖1：DUB-IN-3是HCC的有效抑制劑

圖2：DUB-IN-3在體內(nèi)外均可抑制HCC進(jìn)展

2. 靶向USP8抑制谷胱甘肽代謝并誘導(dǎo)HCC鐵死亡

        為了探索上述結(jié)果的潛在機(jī)制，作者進(jìn)行了氣相色譜法和基于TOF-質(zhì)譜（GC/TOF-MS）的代謝組學(xué)分析。熱圖分析表明，DUB-IN-3處理引起了代謝產(chǎn)物的顯著差異（圖3A）。對(duì)代謝產(chǎn)物的途徑進(jìn)行富集發(fā)現(xiàn)，DUB-IN-3處理的細(xì)胞中谷胱甘肽（GSH）代謝途徑、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝途徑以及鐵死亡途徑受到顯著影響（圖3B）。GSH是生物體內(nèi)最重要的抗氧化劑之一，GSH代謝在腫瘤進(jìn)展中起著重要作用，GSH水平升高與轉(zhuǎn)移增加有關(guān)。有研究報(bào)告胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Xc-/GSH/ GPX4軸是參與調(diào)節(jié)鐵死亡的關(guān)鍵途徑，這是一種新定義的程序性細(xì)胞死亡形式（圖3C）。

        靶向GSH的合成和運(yùn)用被認(rèn)為是腫瘤治療的一種潛在手段。因此作者對(duì)GSH代謝途徑進(jìn)行研究。GSH代謝的關(guān)鍵中間產(chǎn)物如胱氨酸和谷胱甘肽在DIB-IN-3處理的細(xì)胞中顯著降低（圖3D，E）。DIB-IN-3處理后，細(xì)胞中亞鐵水平上調(diào)（圖3F）。GSH耗竭導(dǎo)致細(xì)胞積累更多的脂質(zhì)ROS（圖3G）。通過檢測(cè)RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡進(jìn)一步評(píng)估DIB-IN-3在鐵死亡中的作用。DUB-IN-3降低了RSL3治療下的細(xì)胞活力，可以通過Ferrostin-1挽救，表明該機(jī)制在細(xì)胞鐵死亡中具有特異性（圖3H，I）。敲除USP8降低了胱氨酸攝取和GSH水平，增加了亞鐵鐵水平和脂質(zhì)ROS（圖3J-M）。USP8耗盡的細(xì)胞對(duì)RSL3處理更敏感（圖3N，O）。綜上所述，藥理抑制或敲除USP8可能通過抑制HCC細(xì)胞從細(xì)胞外環(huán)境吸收胱氨酸并賦予鐵死亡來抑制GSH生物合成。

圖3： 靶向USP8抑制GSH代謝并導(dǎo)致HCC發(fā)生鐵死亡

3. USP8通過去泛素化調(diào)節(jié)OGT穩(wěn)定性

        為了找到可能由USP8調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，作者在Flag-USP8表達(dá)和免疫沉淀后進(jìn)行了基于免疫沉淀的質(zhì)譜分析(IP-MS)，發(fā)現(xiàn)了USP8免疫沉淀的OGT蛋白（圖4A）。進(jìn)一步的Co-IP實(shí)驗(yàn)表明內(nèi)源性USP8可以與內(nèi)源性OGT互作（圖4B）。GST-pulldown實(shí)驗(yàn)表明USP8在體外與OGT互作（圖4C）。接下來作者通過免疫熒光證明了USP8和OGT在細(xì)胞內(nèi)共定位。此外，蛋白的結(jié)構(gòu)域和缺失突變體的Co-IP結(jié)果顯示OGT的GT結(jié)構(gòu)域與USP8的USP結(jié)構(gòu)域存在物理相互作用(圖4E-H)。

        由于USP8是泛素特異性加工蛋白酶家族的成員，作者假設(shè)USP8可能通過泛素-蛋白酶體通路調(diào)節(jié)OGT周轉(zhuǎn)。USP8的消耗顯著降低OGT表達(dá)，卻不影響其mRNA豐度（圖5A），并且通過添加蛋白酶體抑制劑MG132或過表達(dá)USP8-WT可以逆轉(zhuǎn)OGT下降趨勢(shì)，而USP8催化失活突變體（USP8-C786A）不能逆轉(zhuǎn)OGT下降趨勢(shì)（圖5B，C）。因此作者認(rèn)為USP8影響了OGT的穩(wěn)定性，為了證明這一結(jié)論，蛋白合成抑制劑放線菌酮（CHX）處理LM3細(xì)胞，USP8敲低后OGT半衰期縮短（圖5D）。OGT穩(wěn)定性在過表達(dá)USP8-WT時(shí)增加，在USP8-C786A時(shí)沒有增加（圖5E）。這些結(jié)果表明USP8通過泛素-蛋白酶體途徑穩(wěn)定細(xì)胞中的OGT。進(jìn)一步研究OGT是否是USP8的底物。如圖5F所示，USP8的耗竭顯著提高泛素化OGT的水平；USP8-WT的表達(dá)顯著降低泛素化OGT（圖5G）。作者還對(duì)突變泛素（K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63）進(jìn)行泛素化測(cè)定，結(jié)果表明USP8可以有效地從OGT蛋白中去除K48連接的泛素鏈（圖5H）。為了確定被USP8去泛素化的OGT蛋白的特定位點(diǎn)，作者突變了OGT的賴氨酸殘基（圖5I），泛素化測(cè)定表明K117是關(guān)鍵位點(diǎn)（圖5J）。綜上所述，這些結(jié)果表明USP8是OGT的調(diào)節(jié)因子，是預(yù)后標(biāo)志物。

圖4： USP8與OGT相關(guān)

圖5： USP8穩(wěn)定去泛素化酶OGT

4. USP8的磷酸化是與OGT相互作用所必需的

        作者發(fā)現(xiàn)USP8在Ser716殘基處出現(xiàn)磷酸化，而且STE20樣激酶（SLK）與Flag-USP8共純化。在LM3細(xì)胞中進(jìn)行Co-IP驗(yàn)證SLK和USP8之間發(fā)生互作（圖6A）。敲低SLK顯著降低了USP8的S716磷酸化（圖6B，C）。接下來，作者探究了SLK介導(dǎo)的USP8磷酸化是否影響其與OGT的關(guān)聯(lián)。敲低SLK后USP8和OGT之間的關(guān)聯(lián)顯著降低（圖6D）。USP8 S716無義磷酸化突變體）（USP8 S716A）與OGT之間的關(guān)聯(lián)下降，USP8 S716類似磷酸化（USP8 S716D）與OGT之間的關(guān)聯(lián)升高(圖6E)。隨后，作者表達(dá)USP8- WT或USP8 S716D的LM3細(xì)胞中敲低SLK發(fā)現(xiàn)只有USP8-WT與OGT結(jié)合的能力降低（圖6F）。作者還觀察到USP8- WT和USP8 S716D增加了OGT蛋白表達(dá)水平（圖6G）。

        為了研究USP8磷酸化在HCC細(xì)胞中的作用，作者在HCC細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)USP8 WT和S716A，與對(duì)照相比，USP8 WT促進(jìn)了HCC細(xì)胞的增殖、侵襲和干性，增強(qiáng)了HCC細(xì)胞的胱氨酸攝取和GSH水平，降低了脂質(zhì)ROS水平和細(xì)胞對(duì)RSL3治療的敏感性，而USP8 S716A突變體失去了這些能力（圖6H-P）。USP8 WT，但不是C786A和S716A突變體，（圖6M-P）。這些結(jié)果表明USP8與OGT相互作用時(shí)需要磷酸化激活。

圖6： SLK磷酸化USP8

5. HCC細(xì)胞中OGT O-GlcNAa糖基化SLC7A11 Ser26

        作者已經(jīng)證明USP8去泛素化OGT并影響HCC細(xì)胞的胱氨酸攝取。由于胱氨酸是由胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（System Xc-）從卵泡外環(huán)境輸入的，故作者研究該反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能亞基——SLC7A11是否受USP8-OGT軸的調(diào)節(jié)。Co-IP表明OGT和SLC7A11在生理?xiàng)l件下存在關(guān)聯(lián)（圖7A）；SLC7A11發(fā)生了O-GlcNAa糖基化，OGT的消耗可降低SLC7A11的O-GlcNAa糖基化（圖7B）。TMG（OGA抑制劑）處理細(xì)胞發(fā)現(xiàn)整體O-GlcNAa糖基化的升高增加了SLC7A11的O-GlcNAa糖基化，OSMI-1（OGT抑制劑）處理的細(xì)胞顯示出相反的現(xiàn)象（圖7C）。SLC7A11的O-GlcNAa糖基化水平在DAB-IN-3處理或敲除USP8后下降（圖7D，E）。此外，OGT的過表達(dá)可以挽救USP8-KO細(xì)胞中SLC7A11的O-GlcNAa糖基化（圖7F）。這些結(jié)果表明USP8通過OGT調(diào)節(jié)SLC7A11的O-GlcNAa糖基化水平。

        為了確定SLC7A11上發(fā)生O-GlcNAa糖基化的位點(diǎn)，作者使用在線生物信息學(xué)工具（https://services.healthtech.dtu.dk/）進(jìn)行預(yù)測(cè)，確定了4個(gè)殘基（S8，T9，S26和T218）。為了確定SLC7A11中糖基化的發(fā)生位點(diǎn)，將四個(gè)殘基均突變?yōu)楸彼幔l(fā)現(xiàn)S26的突變降低了O-GlcNAa糖基化水平，表明S26是主要的糖基化位點(diǎn)（圖7G，H）。為了進(jìn)一步了解O-GlcNAa糖基化對(duì)SLC7A11活性的影響，在HCC細(xì)胞中敲除了SLC7A11（SLC7A11-KO），轉(zhuǎn)染SLC7A11-WT和SLC7A11-S26A。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除SLC7A11抑制HCC細(xì)胞的增殖、侵襲和干性，SLC7A11-WT的過表達(dá)恢復(fù)了SLC7A11敲除誘導(dǎo)的效果，SLC7A11-S26A不能恢復(fù)（圖7I-N）。類似的，SLC7A11-WT增強(qiáng)了HCC細(xì)胞的胱氨酸攝取和GSH水平，同時(shí)降低了脂質(zhì)ROS水平和細(xì)胞對(duì)RSL3治療的敏感性（圖7O-R）。綜上所述，SLC7A11在HCC細(xì)胞中被OGT進(jìn)行O-GlcNAa糖基化，SLC7A11的O-GlcNAa糖基化對(duì)其胱氨酸攝取活性至關(guān)重要。

圖7：HCC細(xì)胞中OGT通過O-GlcNAc糖基化修飾SLC7A11 Ser26位點(diǎn)

結(jié)論

     總之，本研究證明了靶向USP8降低了OGT的穩(wěn)定性，抑制了肝癌的進(jìn)展，并誘導(dǎo)了肝癌的鐵死亡。從機(jī)制上講，USP8通過去除K48連接的泛素鏈?zhǔn)?span>OGT去泛素化和穩(wěn)定增加，然后SLC7A11在S26位點(diǎn)發(fā)生O-GlcNAc糖基化。SLC7A11的O-GlcNAc糖基化是其從細(xì)胞外環(huán)境中吸收胱氨酸的活性所必需的。此外，USP8在S716的磷酸化是與OGT相互作用所必需的。我們的發(fā)現(xiàn)為USP8在肝癌中調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝和鐵死亡的作用提供了新的見解（圖8），并表明靶向USP8是一種有希望的肝癌治療策略。

實(shí)驗(yàn)方法

        代謝組學(xué)分析，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析，去泛素化實(shí)驗(yàn)，蛋白質(zhì)印跡分析，脂質(zhì)ROS分析，GSH檢測(cè)，細(xì)胞培養(yǎng)，質(zhì)粒和USP8敲除細(xì)胞系的生成，細(xì)胞染色，細(xì)胞活力測(cè)定，球體形成分析，小鼠實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)腫瘤發(fā)生試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)

        Tang Jianing, Long Guo, Hu Kuan et al. Targeting USP8 Inhibits O-GlcNAcylation of SLC7A11 to Promote Ferroptosis of Hepatocellular Carcinoma via Stabilization of OGT. [J]. Adv Sci (Weinh), 2023, 10: e2302953.