口腔病原體通過促進小鼠Th1細胞浸潤而加重帕金森病

       帕金森病(PD)是一種常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，致殘風(fēng)險高且無法治愈。牙周炎是一種發(fā)生在牙周支持組織中的感染性細菌疾病。研究表明牙周炎與PD密切相關(guān)。然而，缺乏牙周炎對PD影響的直接證據(jù)。在本研究中，我們證明了使用齦下菌斑(LIP-SP)結(jié)扎誘導(dǎo)的牙周炎加重了MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的運動功能障礙、小膠質(zhì)細胞激活和多巴胺能神經(jīng)元丟失。16S rRNA基因測序顯示LIP?SP誘導(dǎo)口腔和腸道生態(tài)失調(diào)。特別是，在MPTP + LIP-SP處理的小鼠糞便樣本中，來自口腔結(jié)扎的小韋榮球菌(V. parvula)和變形鏈球菌(S. mutans)增加。我們進一步證明，小韋榮球菌和變形鏈球菌在LIP-SP介導(dǎo)的PD小鼠運動功能障礙和神經(jīng)變性惡化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。小韋榮球菌和變形鏈球菌引起PD小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞活化，腦、頸淋巴結(jié)、回腸和結(jié)腸內(nèi)Th1細胞浸潤。此外，我們觀察到IFNγ中和對小韋榮球菌和變形鏈球菌處理的PD小鼠多巴胺能神經(jīng)元的保護作用。總之，我們的研究表明口腔病原體加劇MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的運動功能障礙和神經(jīng)退行性變。本文于2023年11月發(fā)表于“Microbiome”（IF=15.5）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）LIP-SP加重MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠運動功能障礙和多巴胺能神經(jīng)元丟失

       為了評估牙周炎對MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠運動功能和多巴胺能神經(jīng)元損失的影響，我們首先進行LIP，并每周應(yīng)用三次SP誘導(dǎo)牙周炎。1個月后，我們通過腹腔注射MPTP誘導(dǎo)小鼠PD(圖1A)。行為學(xué)測試顯示，與對照組相比，MPTP顯著減少了滾軸試驗中的潛伏時間和懸掛試驗得分(圖1B)。LIP-SP損害了MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠滾軸試驗和懸掛試驗的運動功能(圖1B)。我們通過表征酪氨酸羥化酶(TH)在ST和SN中的表達來檢測LIP-SP對多巴胺能神經(jīng)元損傷的影響。正如預(yù)期的那樣，IHC顯示MPTP處理導(dǎo)致ST中TH陽性纖維減少近50%(圖1C-1D)，SN中TH陽性多巴胺能神經(jīng)元減少近50%(圖1E-1F)。重要的是，與MPTP組相比，MPTP-LIP-SP導(dǎo)致ST(圖1C-1D)和SN(圖1E-1F)中多巴胺能神經(jīng)元的顯著減少。與此觀察結(jié)果一致，western blot分析顯示MPTP誘導(dǎo)PD小鼠ST中TH蛋白水平較對照小鼠顯著降低。LIP-SP加重了MPTP處理后TH蛋白的損失(圖1G-1H)。LIP-SP對對照組小鼠的多巴胺能神經(jīng)元水平?jīng)]有顯著影響(圖1C-1H)。此外，免疫熒光分析顯示LIP-SP加速了MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠SN中的小膠質(zhì)細胞活化(圖1I-1J)。單獨使用LIP和SP均不會加重MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的多巴胺能神經(jīng)元損失(補充圖)，提示PD的加重需要口腔病原體與牙周炎的結(jié)合。

2）LIP-SP可以改變MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的口腔和腸道微生物群

       先前的研究已經(jīng)證實了腸道生態(tài)失調(diào)在PD中的作用，我們假設(shè)LIP-SP可能通過口腸軸影響PD的發(fā)病機制。我們采用16S rRNA基因測序?qū)π∈罂谇患凹S便進行分析。α多樣性分析顯示，MPTP組和MPTP + LIP-SP組口腔和腸道樣本中Faith的系統(tǒng)發(fā)育多樣性(Faith’s pd)有顯著差異。MPTP + LIP-SP處理的小鼠口腔和腸道微生物組的多樣性明顯高于MPTP處理的小鼠(圖2A)。β多樣性分析顯示，MPTP組和MPTP+LIP-SP組之間的口腔和腸道微生物組成存在顯著差異(圖2B)。接下來，我們使用隨機森林分析來鑒定潛在的致病菌。與MPTP處理小鼠相比，MPTP+LIP-SP處理小鼠的口腔結(jié)扎和糞便中富集了口腔病原菌小韋榮球菌和變形鏈球菌(圖2C)。接下來，我們采用qRT-PCR方法檢測了口腔結(jié)扎和糞便中小韋榮球菌和變形鏈球菌的DNA水平。與MPTP組相比，MPTP+LIP-SP組口腔結(jié)扎和糞便中小韋榮球菌和變形鏈球菌的DNA水平明顯升高(圖2D-2E)。

3）LIP-mix加重MPTP誘導(dǎo)的運動功能障礙和多巴胺能神經(jīng)元丟失

       我們隨后研究了小韋榮球菌和變形鏈球菌對MPTP誘導(dǎo)的PD的影響。LIP-mix小鼠模型先進行LIP，然后每周3次給藥，持續(xù)1個月，然后注射MPTP誘導(dǎo)PD(圖3A)。正如預(yù)期的那樣，通過行為測試確定，腹腔注射MPTP會損害運動功能。與MPTP組相比，MPTP+LIP-mix組滾軸試驗潛伏時間縮短，懸掛試驗評分明顯降低(圖3B)。在不腹腔注射MPTP的情況下，LIP-mix不影響運動功能(圖3B)。此外，LIP-mix增強了MPTP誘導(dǎo)的ST和SN的多巴胺能神經(jīng)元損傷。MPTP注射后，ST和SN中多巴胺能纖維和神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，LIP-mix處理導(dǎo)致MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠ST和SN中多巴胺能神經(jīng)元進一步減少(圖3C-3F)。ST中TH陽性蛋白水平也呈現(xiàn)出類似的趨勢(圖3G)。但對照組和LIP-mix組之間多巴胺能纖維和神經(jīng)元水平無顯著差異(圖3C-3G)。然后我們進行了額外的實驗，在沒有LIP誘導(dǎo)的情況下，小鼠口服小韋榮球菌和變形鏈球菌，然后用MPTP誘導(dǎo)PD(圖S4A)。我們發(fā)現(xiàn)，在沒有LIP的情況下，這兩種細菌幾乎不會在腸道中定植(圖S4B)，也不會加重PD(補充圖)。這些數(shù)據(jù)表明，小韋榮球菌和變形鏈球菌需要牙周炎的存在才能在小鼠腸道中定植，并對PD產(chǎn)生加重作用。

4）LIP-mix刺激MPTP誘導(dǎo)的小鼠腦小膠質(zhì)細胞活化和CD4+T細胞浸潤

       為了研究大腦中的神經(jīng)炎癥，我們用流式細胞術(shù)分析了腦組織樣本。與對照組相比，MPTP組小膠質(zhì)細胞(CD45low CD11b+)和CD4+T細胞(CD3+ CD4+)的數(shù)量顯著增加(圖4A, 4B)。值得注意的是，LIP-mix處理進一步增加了MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠大腦中小膠質(zhì)細胞和CD4+T細胞的數(shù)量(圖4A, 4B)。接下來，我們用流式細胞術(shù)檢查了頸部淋巴結(jié)、回腸和結(jié)腸中的免疫細胞。與MPTP組相比，MPTP + LIP-mix組頸部淋巴結(jié)的CD4+T細胞顯著增加，但對照組與MPTP組之間沒有差異(圖4C)。同樣，LIP-mix組與MPTP組相比，MPTP+LIP-mix組的CD4+ T細胞數(shù)量增加(圖4D)。值得注意的是，MPTP組的結(jié)腸中CD4+T細胞數(shù)量比對照組增加。MPTP+LIP-mix組進一步增加了這一比例(圖4E)。

5）LIP-mix促進MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠中Th1細胞的積累

       我們進一步用流式細胞術(shù)分析CD4+T細胞的亞型。在腦組織中，與對照組小鼠相比，MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠中Th1細胞(CD4+ IFNγ+)增加，MPTP+LIP-mix處理的小鼠比MPTP處理的小鼠顯示更多的Th1細胞(圖5A)。然后，我們檢查了頸部淋巴結(jié)、回腸和結(jié)腸中的外周Th1細胞。在頸淋巴結(jié)和回腸中，MPTP+LIP-mix組與MPTP組相比Th1細胞明顯增加，但對照組與MPTP組之間沒有差異(圖5B, 5C)。值得注意的是，MPTP組結(jié)腸中Th1細胞數(shù)量比對照組增加，LIP-mix處理進一步刺激了MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠中Th1細胞的積累(圖5D)。

6）中和IFNγ可減輕MPTP + LIP-mix處理小鼠的多巴胺能神經(jīng)元損失

       由于IFNγ是Th1細胞分泌的主要細胞因子，我們使用IFNγ中和抗體來驗證Th1細胞是否在多巴胺能神經(jīng)元損失的加劇中起關(guān)鍵作用(圖6A)。MPTP+LIP-mix組ST中TH陽性蛋白水平顯著降低(圖6B)。IFNγ中和并沒有阻止MPTP處理小鼠TH陽性蛋白損失，但減輕了MPTP+LIP-mix處理小鼠TH陽性蛋白的減少(圖6B)。同樣，IHC結(jié)果顯示LIP-mix加劇了MPTP處理小鼠ST和SN中多巴胺能纖維和神經(jīng)元的丟失(圖6C-6F)。中和IFNγ對MPTP處理的小鼠沒有影響，但減輕了MPTP+LIP-mix處理的小鼠的神經(jīng)元損失(圖6C-6F)。

結(jié)論：口腔病原體小韋榮球菌和變形鏈球菌在牙周炎的情況下加重PD的嚴重程度。從機制上講，小韋榮球菌和變形鏈球菌改變口腔和腸道微生物群，誘導(dǎo)外周和腦區(qū)Th1細胞浸潤，從而增強小膠質(zhì)細胞激活，導(dǎo)致神經(jīng)退行性變。我們的研究揭示了口腔病原體加重PD的機制，為PD的預(yù)防和治療提供了新的方向。

實驗方法：行為測試，Western blot，IHC，免疫熒光，16S?rRNA測序，qRT?PCR，流式。

參考文獻：Bai XB, Xu S, Zhou LJ, Meng XQ, Li YL, Chen YL, Jiang YH, Lin WZ, Chen BY, Du LJ, Tian GC, Liu Y, Duan SZ, Zhu YQ. Oral pathogens exacerbate Parkinson's disease by promoting Th1 cell infiltration in mice. Microbiome. 2023 Nov 17;11(1):254. doi: 10.1186/s40168-023-01685-w.